自噬在腦缺血中的作用

李瀟，李紅遠，李義會，田代實

自噬在腦缺血中的作用

李瀟1，李紅遠2，李義會2，田代實1

研究表明，自噬在腦卒中發(fā)生發(fā)展中具有非常重要的作用，闡明自噬作用的機制對于治療腦卒中意義重大。因此在本文對自噬的發(fā)生過程及可能的分子機制進行闡述，并對自噬研究的發(fā)展前景進行展望。

自噬；神經(jīng)元；腦缺血；凋亡

自噬是一種廣泛存在于真核細胞生物內(nèi)的、依賴溶酶體的降解途徑，是一種防御和應(yīng)激調(diào)控機制。細胞內(nèi)的垃圾產(chǎn)物如受損、變性、衰老蛋白質(zhì)及細胞器通過自噬和溶酶體來降解[1]。自噬可通過應(yīng)激反應(yīng)抵御病原體的入侵，并防止細胞內(nèi)毒物的過度堆積導致?lián)p傷[2]。在不同的條件下自噬可發(fā)揮不同作用，當自噬適度激活時，可促使細胞內(nèi)蛋白質(zhì)細胞器等垃圾物質(zhì)降解，產(chǎn)生氨基酸、能量等補充細胞內(nèi)物質(zhì)不足，對細胞存活具有促進作用；當自噬過度激活時，可破壞細胞內(nèi)部穩(wěn)態(tài)，擾亂細胞的正常代謝，導致細胞裂解，引起自噬性細胞死亡，即Ⅱ型程序型細胞死亡[3,4]。

研究表明，自噬在腦缺血缺氧后的病理生理變化中發(fā)揮非常重要的作用。1995年，Nitatori等[5]在沙土鼠短暫腦缺血模型后發(fā)現(xiàn)自噬激活。隨后，研究人員又在局灶性和永久性腦缺血模型中發(fā)現(xiàn)溶酶體和自噬溶酶體的活性增加，進一步證實自噬在神經(jīng)元缺血缺氧后發(fā)揮重要作用。Koike等[6]的研究顯示，ATG-7缺陷新生小鼠缺血缺氧損傷時發(fā)現(xiàn)病側(cè)海馬錐體細胞層的損傷體積較野生型小鼠明顯減小，提示ATG基因敲除可保護缺血、缺氧后海馬區(qū)神經(jīng)細胞損傷。另外，有研究顯示膠質(zhì)細胞系源性神經(jīng)營養(yǎng)因子（glial cellline-derived neurotrophic factor，GDNF）和肝細胞生長因子（hepatocyte growth factor，HGF）等神經(jīng)保護劑也是通過抗自噬及抗凋亡作用發(fā)揮神經(jīng)保護作用[7]，還有越來越多的藥物被認為是通過調(diào)節(jié)自噬水平來改善缺血后腦損傷[8-10]。但是自噬發(fā)揮的作用形式及相關(guān)的信號通路仍不明確，因此闡明自噬的發(fā)生過程及機制非常重要。

1 自噬的分類及過程

目前，依據(jù)自噬的轉(zhuǎn)運方式將其分為三種形式：大自噬（macroautophagy）、分子伴侶介導的自噬（chaperon-mediated autophagy，CMA）和小自噬（microautophagy）。在中樞神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)揮作用的主要為大自噬和CMA。巨自噬首先在細胞內(nèi)產(chǎn)生雙層膜結(jié)構(gòu)，包裹部分需要降解的細胞器及蛋白質(zhì)形成自噬體，然后自噬體與溶酶體融合形成自噬溶酶體，隨后降解和消化蛋白質(zhì)（本文所提到的自噬均指巨自噬）。微自噬指溶酶體通過直接吞噬胞質(zhì)成分的一種方式。CMA是一種高選擇性的降解方式。受損蛋白在修飾過程中被加入包含KFERQ模體的基序，熱休克蛋白Hsc70能識別KFERQ模體并與之結(jié)合。復合體與溶酶體膜蛋白LAMP-2A結(jié)合，溶酶體腔中的Hsc73幫助其進入溶酶體內(nèi)進行降解[11]。

自噬主要分為4個步驟（圖1）：①自噬誘導和囊泡成核：在生理情況下，酵母自噬基因Atg13被磷酸化，與Atg1親和力較低，但細胞處于饑餓或缺血缺氧能量耗竭狀態(tài)時，Atg13迅速去磷酸化，與Atg1結(jié)合誘導下游蛋白FIP200和Atg101結(jié)合，促進自噬前體（phagophore）的雙膜結(jié)構(gòu)形成。磷脂酰肌醇3激酶（phosphatidylinositol 3-kinase，PI3K）復合體在這個過程中具有重要的調(diào)節(jié)作用[12]。②囊泡延伸：自噬前體主要利用兩個泛素樣蛋白系統(tǒng)Atg12-Atg5和Atg8/LC3進行延伸。Atg12與Atg7結(jié)合后轉(zhuǎn)運至E2樣酶（Atg10），接下來與Atg5結(jié)合，Atg16的二聚體形式Atg16L與上述復合物結(jié)合形成Atg5-Atg12-Atg16L復合物，促進自噬體膜不斷延伸，包裹細胞內(nèi)物質(zhì)形成自噬體[13]。另一個Atg8/ LC3復合物首先是由Atg7、Atg3的共同作用下細胞質(zhì)內(nèi)的LC3-I與磷脂酰乙醇胺（phosphatidylethanolamine，PE）結(jié)合轉(zhuǎn)換為囊泡上的LC3-II。囊泡的數(shù)量增多，LC3-II的含量增多，因此，LC3-Ⅱ含量可代表細胞內(nèi)自噬體的數(shù)量，通過檢測LC3-Ⅱ可判斷細胞自噬的水平[14]。LC3亦被認為是p62的受體，p62蛋白在自噬降解的過程中發(fā)揮重要作用。因此p62也是自噬的標志蛋白之一。自噬體延伸后形成完整的雙膜結(jié)構(gòu)，因此在電鏡下觀察到的自噬體是雙膜結(jié)構(gòu)，而自噬溶酶體由于溶解了內(nèi)層膜則為單膜結(jié)構(gòu)。③自噬體融合：囊泡利用溶酶體膜蛋白LAMP-1、LAMP-2與溶酶體融合，形成自噬溶酶體[15]。④降解與消化：自噬溶酶體內(nèi)存在一些酸性水解酶（Cathepsins B、D、L等），它們將其內(nèi)的物質(zhì)降解，其產(chǎn)物釋放入細胞質(zhì)被循環(huán)利用[16]。

2 神經(jīng)元的自噬水平

圖1 自噬的基本過程

在正常生理狀態(tài)下，神經(jīng)系統(tǒng)維持基礎(chǔ)水平的自噬，自噬體運載其內(nèi)容物從軸突到細胞質(zhì)，與細胞質(zhì)內(nèi)的溶酶體融合，降解受損的細胞產(chǎn)物，維持神經(jīng)系統(tǒng)穩(wěn)態(tài)[17]。在外界因素刺激下，如缺血缺氧、能量減少、毒性刺激等自噬激活增加，大量的自噬體在軸突中集聚，導致自噬降解不完全。另外，這種病理狀態(tài)迫使溶酶體逆向轉(zhuǎn)運至軸突，從而使軸索運輸功能紊亂，軸突損傷，最后導致神經(jīng)元萎縮降解[18]。

3 腦缺血誘導自噬的信號通路

腦缺血缺氧后多種信號通路參與自噬激活，主要包括mTOR、Ca2+、AMPK等（圖2）。當腦組織缺血缺氧時，腦內(nèi)氨基酸和ATP減少，能量耗竭。mTOR是哺乳動物雷帕霉素靶蛋白，當細胞處于饑餓狀態(tài)時AA和胰島素供應(yīng)減少，mTORC1受到抑制，自噬被激活。腦內(nèi)能量供應(yīng)減少，AMP與ATP比值升高，激活AMP激活激酶（AMP-activated protein kinase，AMPK），亦能抑制mTOR活性激活自噬。另外，Ca2+濃度增高和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激也是誘導自噬的重要原因。Ca2+可通過Ca2+/AMPK/mTOR途徑激活自噬，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激通過PERK/eIF2a[19]和Ire1/TRAF2/ JNK[12]通路誘導自噬水平增強。

mTOR自噬啟動階段信號轉(zhuǎn)導通路的上游調(diào)控蛋白。mTOR包含兩種蛋白mTORC1、mTORC2。其中mTORC1對雷帕霉素敏感并可調(diào)節(jié)自噬。mTORC2對雷帕霉素不敏感，主要是促進細胞骨架蛋白形成。mTOR通過作用于自噬相關(guān)蛋白而負向調(diào)控自噬通路調(diào)控因子。胰島素、生長因子等可促進PI3K的磷酸化，而PI3K則是促使PIP3產(chǎn)生的關(guān)鍵酶。PIP3可激活磷酸化的PDK1及下游蛋白Akt[20]。Akt被PDK1磷酸化后抑制TSC1/TSC2（結(jié)節(jié)硬化復合體）的活性。TSC1/2能負調(diào)節(jié)小G蛋白Rheb，促使GTP Rheb轉(zhuǎn)變?yōu)镚DP Rheb[21]。mTOR可GTP Rheb結(jié)合，因此Rheb-GTP減少，mTOR活性增強。AA也正是通過調(diào)節(jié)Rheb-GTP的產(chǎn)生而抑制自噬[22]。

AMPK作為細胞內(nèi)能量情況的感受器，對細胞內(nèi)ATP/AMP比值非常敏感[23]。當細胞能量供應(yīng)障礙時，ATP/AMP比值下調(diào)，AMPK可被LKB1及CaMKKb激活。激活的AMPK可通過兩種方式抑制mTORC1:TSC2及mTOR調(diào)節(jié)相關(guān)蛋白（raptor），從而正性調(diào)節(jié)自噬的激活。另外，也有研究表明AMPK直接通過Atg激活自噬。Kim等[24]的研究表明，在細胞饑餓狀態(tài)下AMPK通過磷酸化Ulk1激活自噬。

另外，Bcl-2作為凋亡抑制因子，通過結(jié)合Beclin-1，來抑制Beclin-1依賴的自噬通路。Bcl-2與Beclin-1結(jié)合后，促使beclin-1從p150/vps34復合體中解離出來，從而減少自噬的發(fā)生。在細胞內(nèi)營養(yǎng)物質(zhì)缺乏的狀態(tài)下，Bcl-2可通過抑制Beclin-1降低自噬水平，減少缺血缺氧導致的細胞死亡及腦組織損傷。

圖2 腦缺血后自噬的信號通路

4 自噬與腦缺血

4.1 自噬途徑在腦缺血缺氧過程中發(fā)揮的作用

自噬在腦缺血缺氧后的病理變化過程中發(fā)揮的作用依然存在很多爭議。研究發(fā)現(xiàn)，利用自噬抑制劑三甲基腺嘌（3-methyladenine，3-MA）可明顯減少腦缺血缺氧后的細胞壞死，腦缺血損傷程度減輕[25]。Chauhan等[26]觀察到腹腔注射雷帕霉素后可減少大鼠局灶性腦缺血后的的梗死體積，提示自噬的神經(jīng)保護作用。但也有研究發(fā)現(xiàn)過度激活的自噬可加重腦損傷。Puyal等[27]在新生鼠腦局灶性缺血造模后3 h側(cè)腦室注射自噬抑制劑發(fā)現(xiàn)梗死體積明顯減小，神經(jīng)損傷減輕，這說明抑制自噬有利于局灶性腦缺血再灌注后神經(jīng)組織損傷恢復。Zheng等[28]通過構(gòu)建大鼠MCAO模型，采用側(cè)腦室注射連結(jié)有Beclin-1干擾片段的慢病毒載體下調(diào)大鼠腦內(nèi)自噬相關(guān)分子Beclin-1的表達，發(fā)現(xiàn)大鼠缺血性腦損傷癥狀減輕。也有學者發(fā)現(xiàn)通過抑制細胞凋亡保護缺血/復灌的神經(jīng)細胞，但在單一的缺血損傷模型中發(fā)揮神經(jīng)損傷作用[29]。心肌缺血模型中也發(fā)現(xiàn)，不同的損傷模型存在不同的自噬作用[30]。不同學者的研究結(jié)果不同，可能是因為模型類型、藥物劑量、給藥時間等不同，也提示自噬在腦缺血發(fā)生過程中的復雜性，因此需要更多細致的研究。

4.2 自噬與腦缺血預處理的保護作用

很多研究發(fā)現(xiàn)，自噬參與缺血預處理（ischemic preconditioning，IPC）的保護作用。Carloni等[25]研究發(fā)現(xiàn)，給予缺血缺氧處理后可觀察到Beclin1表達上調(diào)及腦損傷減輕；而側(cè)腦室注射自噬抑制劑3-MA和渥曼青霉素，發(fā)現(xiàn)海馬和皮質(zhì)神經(jīng)細胞損傷加重；注入雷帕霉素后發(fā)現(xiàn)腦損傷減輕。Park等[31]在研究P12細胞的缺血耐受時發(fā)現(xiàn)自噬小體明顯增加，而給予3-MA后壞死細胞增加。Yan等[32]也發(fā)現(xiàn)在高壓氧預處理后，自噬水平增加并參與其對缺血腦組織的保護作用。Xia等[33]的研究表明IPC可通過激活自噬、抑制凋亡來發(fā)揮其神經(jīng)保護作用。因此自噬可能是缺血耐受發(fā)揮作用的基本過程之一。IPC與腦缺血都可引起自噬，而腦缺血可引起自噬性的細胞死亡，而IPC可通過適度的自噬挽救腦缺血造成的損傷。兩種結(jié)果的不同可能是自噬發(fā)生的時間及程度不一所造成的。IPC通過上調(diào)自噬活性，合理的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)激活及抑制凋亡來發(fā)揮其神經(jīng)保護作用，因此闡明自噬發(fā)揮作用的不同途徑對于利用自噬非常重要。

4.3 自噬與凋亡的相互作用

Carloni等[29]發(fā)現(xiàn)在新生大鼠腦缺血模型上給予自噬激動劑雷帕霉素可減少促凋亡蛋白Bax和Bad向線粒體膜的轉(zhuǎn)運，降低Caspase-3的表達，減少細胞色素C的釋放，提示腦缺氧后升高自噬水平可抑制內(nèi)源性線粒體途徑介導的凋亡。這是由于在腦缺血缺氧時，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激增加，腦內(nèi)ROS增多，細胞通過自噬清除壞死的線粒體，促進能量恢復，從而使凋亡和壞死減少。然而，隨著腦缺血缺氧時間增加，自噬壓力增加，細胞內(nèi)壞死物質(zhì)堆積，則會導致溶酶體聚集而后細胞死亡。因此自噬可直接抑制凋亡而發(fā)揮其神經(jīng)保護作用，也可通過誘導凋亡或向凋亡轉(zhuǎn)化，最終導致細胞死亡。因此，在腦缺血缺氧的過程中，自噬、凋亡、壞死可同時存在并發(fā)揮不同作用，共同參與神經(jīng)細胞的死亡過程（圖3）。

圖3 自噬與凋亡、壞死之間的關(guān)系

5 結(jié)論與展望

自噬在腦缺血中發(fā)揮的作用，猶如一把“雙刃劍”。一方面過度的自噬導致凋亡激活，加重細胞損傷，引起自噬性細胞死亡；另一方面自噬適度激活有助于清除受損的細胞器和蛋白，促進能量恢復，從而保護受損的細胞。自噬在腦缺血后的作用是損傷還是保護，這取決于細胞內(nèi)外的應(yīng)激程度及細胞自噬的內(nèi)部反應(yīng)機制。另外，不同的實驗模型、研究方法、檢測手段，自噬的作用結(jié)果可能截然不同。因此，通過多方面研究腦缺血后自噬的發(fā)生發(fā)展過程，探索自噬調(diào)節(jié)的信號通路及分子機制，了解自噬在腦缺血不同情況下發(fā)揮的作用，有助于為腦缺血的治療提供新思路。

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（本文編輯：王晶）

R741;R741.02;R743

A DOI 10.16780/j.cnki.sjssgncj.2016.06.022

1.華中科技大學同濟醫(yī)學院附屬同濟醫(yī)院武漢430030

2.南陽市第四人民醫(yī)院失眠科河南 南陽473000

2016-04-05

田代實tiands@foxmail. com