轉(zhuǎn)SOS基因高羊茅的耐鹽性鑒定

倪　星，秦　楚，平　玲，麻冬梅，許　興

(1.寧夏大學(xué) 農(nóng)學(xué)院，寧夏 銀川　750021； 2.寧夏大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，寧夏 銀川　750021)

?

轉(zhuǎn)SOS基因高羊茅的耐鹽性鑒定

倪星1，秦楚2，平玲1，麻冬梅1，許興1

(1.寧夏大學(xué) 農(nóng)學(xué)院，寧夏 銀川750021； 2.寧夏大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，寧夏 銀川750021)

摘要：試驗以轉(zhuǎn)SOS基因的高羊茅和野生型高羊茅為材料，測定其在鹽堿脅迫下的葉綠素含量、丙二醛、脯氨酸和抗氧化酶活性指標(biāo)，并測定種植轉(zhuǎn)基因高羊茅和野生型高羊茅前后土壤的理化性質(zhì)。結(jié)果表明，轉(zhuǎn)基因的高羊茅在鹽堿脅迫下，葉綠素的含量、脯氨酸的含量和抗氧化酶的活性均高于野生型，丙二醛含量低于野生型；種植野生型高羊茅和轉(zhuǎn)基因高羊茅后，土壤中的pH、堿化度均逐步降低，且種植轉(zhuǎn)基因高羊茅后土壤中的pH、堿化度降低的幅度更大，說明轉(zhuǎn)基因高羊茅植株的耐鹽堿性較好，并且在一定程度上改善了土壤的理化性質(zhì)。

關(guān)鍵詞：高羊茅；轉(zhuǎn)基因；生理生化；土壤理化性質(zhì)；耐鹽性

高羊茅是適應(yīng)生長在亞熱帶過渡氣候區(qū)的一種冷季型草種。因適應(yīng)于廣泛的土壤條件，并具有強(qiáng)的耐旱性和耐鹽性的優(yōu)點，被廣泛用于城市的綠化。然而在一些傳統(tǒng)灌溉區(qū)的鹽漬化情況下，高羊茅的生長發(fā)育受到影響。土壤鹽害對植物的生長發(fā)育有著嚴(yán)重的影響，是非生物脅迫的因子之一[1,2]。在全球鹽漬化情況日益加劇下，在鹽堿地上種植耐鹽植物，不僅可以起到保護(hù)和美化環(huán)境，而且有抑制土壤的返鹽現(xiàn)象[3]。隨著生物學(xué)的不斷發(fā)展，通過轉(zhuǎn)基因技術(shù)將耐鹽性基因轉(zhuǎn)入到植株中，從而獲得高的耐鹽性轉(zhuǎn)基因植株。目前，在草坪草上應(yīng)用農(nóng)桿菌介導(dǎo)法等獲得耐鹽性轉(zhuǎn)基因植株已經(jīng)有了研究的進(jìn)展[4,5]，通過轉(zhuǎn)基因技術(shù)去提高植株的耐鹽性已經(jīng)成為現(xiàn)在研究的一大熱點。耐鹽性基因是一種由多基因控制的數(shù)量性狀，SOS信號通路的活性認(rèn)為是在細(xì)胞水平上排Na+和控制離子平衡的關(guān)鍵機(jī)制，SOS(salt overly sensitive)途徑的一種重要的生理功能就是植物在鹽脅迫下進(jìn)行離子穩(wěn)態(tài)調(diào)節(jié)和提高耐鈉性。對篩選出的轉(zhuǎn)SOS基因高羊茅株系6-2和6-3進(jìn)行田間的耐鹽性鑒定分析，通過測定相關(guān)生理生化和土壤理化性質(zhì)指標(biāo)，進(jìn)一步鑒定所獲得的轉(zhuǎn)基因高羊茅的耐鹽性。

1材料和方法

1.1試驗材料

1.1.1野生型材料材料為高羊茅屬的“愛瑞3號” (FestucaarundinaceaArid 3)，愛瑞3號高羊茅的成熟種子來源于寧夏草地研究所。

1.1.2轉(zhuǎn)基因材料由中國農(nóng)業(yè)大學(xué)植物生物化學(xué)與分子生物學(xué)重點實驗室構(gòu)建，在遺傳育種技術(shù)實驗室于-70℃保存?zhèn)溆谩２捎盟⒌霓r(nóng)桿菌介導(dǎo)轉(zhuǎn)化體系，首次將耐鹽相關(guān)擬南芥SOS途徑基因(SOS1,SOS2，SOS3和SCaBP8)導(dǎo)入高羊茅品種愛瑞3號的基因組中,經(jīng)PCR、Southern blotting、RT-PCR分子檢測和活體葉片PPT抗性鑒定分析,獲得獨立來源的轉(zhuǎn)基因植株[6]。

1.2試驗地概況

賀蘭山農(nóng)牧場位于寧夏平原西部，處于賀蘭山東麓洪積平原與黃河沖積平原的結(jié)合部，屬溫帶大陸性干旱、半干旱氣候，具有無霜期長(175 d)，有效積溫較高(3 278～3 350℃)，光照充足(年均日照時數(shù)3 039 h，年太陽總輻射量達(dá)145 KJ/cm2)，降水少(200 mm)的氣候特點。

在賀蘭山農(nóng)牧場開展試驗，種植材料前對土壤0～20 cm的表層土壤進(jìn)行耙地、耢耱、整地、鎮(zhèn)壓、鏟地等措施，將表層土壤混勻，種植轉(zhuǎn)基因材料和野生型材料，測定土壤的理化性質(zhì)。賀蘭山農(nóng)牧場為典型的鹽堿地，土壤pH為9.29，全鹽含量為5.01 g/kg，堿化度為14.91%。

1.3方法

試驗采用小區(qū)分組，將獲得的轉(zhuǎn)基因植株6-2、6-3和野生型植株選取長勢一致的株系種植在已經(jīng)完成耕作并且劃分完成小區(qū)內(nèi)。從6～10月，每月采樣，從每個小區(qū)內(nèi)取長勢相同植株的完全展開葉片，設(shè)3次重復(fù)，測定材料生理生化指標(biāo)和土壤理化性質(zhì)。

1.3.1生理生化指標(biāo)測定丙二醛(MDA)采用硫代巴比妥酸法[7]測定；脯氨酸(Pro)采用磺基水楊酸法[8,9]測定；超氧化物歧化酶(SOD)活性采用(NBT)氮藍(lán)四唑比色法[7]測定；過氧化物酶(POD)活性采用鄰甲氧基苯酚(即愈創(chuàng)木酚法)[10]測定；過氧化氫酶(CAT)活性采用紫外吸收法[11]測定；葉綠素含量用手持葉綠素儀(TYS-A)測定。

1.3.2土壤理化性質(zhì)的測定水溶性鹽總量測定采用電導(dǎo)法測定， pH用1.0 mol/L KCl浸提電位法測定，土壤全氮采用半微量開式法測定，全磷采用HCLO-H2SO4鉬銻鈧比色法測定，堿解氮采用堿解擴(kuò)散法測定，速效磷采用0.5 mol/L NaHCO3浸提鉬銻鈧比色法測定，速效鉀采用NH4OAc浸提火焰光度法測定[12]。

2結(jié)果與分析

2.1高羊茅株系的生理生化指標(biāo)的變化

2.1.1MDA的變化MDA是在逆境脅迫下，植物組織或器官受到損害時，膜脂質(zhì)受到過氧化作用形成的一種產(chǎn)物，其含量與植物在逆境中受到的脅迫程度有關(guān)。MDA含量越高，植株組織或器官受到的損害就越大。因此，常用MDA作為膜質(zhì)過氧化指標(biāo)表示植物對逆境條件反應(yīng)的強(qiáng)弱[13]。6～10月，轉(zhuǎn)基因株系6-2的 MDA含量呈下降趨勢，轉(zhuǎn)基因株系6-3株系和野生型對照的MDA含量呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢，這可能是在鹽堿脅迫時，種植在賀蘭山農(nóng)牧場鹽堿地上的植物對膜脂過氧化的一種防御反應(yīng)(圖1)。

圖1　高羊茅的MDA含量Fig.1　The MDA content of transgenic tall fescue under salt stress

2.1.2Pro含量的變化植物體中游離的Pro含量不多，在逆境條件下(旱、熱、冷、凍等)，植物體內(nèi)Pro的含量顯著增加[14]，植物體內(nèi)Pro含量在一定程度上反映了植物的抗逆性，Pro含量越多，植物對逆境的抵抗性越大。除了9月，轉(zhuǎn)基因高羊茅6-2和6-3株系的Pro含量顯著高于野生型對照的Pro，轉(zhuǎn)基因株系中Pro含量為對照植株的0.65～12.9倍(圖2)。

圖2　高羊茅的Pro含量Fig.2　The Pro content of transgenic tall fescue under salt stress

2.1.3POD活性變化POD是植物體內(nèi)普遍存在的一種酶，其環(huán)境的變化比較敏感，并且隨著鹽濃度的升高酶的活性會提高。楊素欣等[15]的研究發(fā)現(xiàn)，在鹽脅迫下，POD酶活性會升高是清除了活性氧自由基，隨著脅迫強(qiáng)度的增加則作為一種分解酶，促進(jìn)細(xì)胞的分解衰老，所以POD可作為組織老化的一種生理指標(biāo)。6～10月，農(nóng)牧場所有株系POD活性呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢。轉(zhuǎn)基因高羊茅6-2和6-3株系的POD活性高于野生型對照植株。轉(zhuǎn)基因株系與野生型對照植株中POD活性差異顯著(圖3)。

2.1.4SOD活性的變化SOD酶是清除生物體內(nèi)自由基的重要酶，有清除體內(nèi)超氧陰離子自由基的生理功能。6～10月，農(nóng)牧場所有株系SOD活性呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢，與POD活性的變化趨勢一致。8月，所有株系SOD含量達(dá)到最大值。除了6月，轉(zhuǎn)基因株系6-2的SOD含量小于野生型，其他月，SOD含量從大到小依次為：6-2>6-3>野生型對照(圖4)。

圖3　高羊茅的POD活性Fig.3　The POD content of transgenic tall fescue

圖4　高羊茅的SOD活性Fig.4　The SOD content of transgenic tall fescue

2.1.5CAT活性的變化CAT是一種抗氧化酶，是在生物進(jìn)化的過程中產(chǎn)生的生物防御系統(tǒng)的一種關(guān)鍵酶，并且能夠催化細(xì)胞內(nèi)的過氧化氫發(fā)生歧化反應(yīng)，所以是生物體內(nèi)的酶的保護(hù)系統(tǒng)的一個重要的因素[16]。由圖5可知，6～8月,所有株系CAT活性都呈現(xiàn)上升的趨勢，8月，各株系CAT活性達(dá)到最高值。9月CAT活性都呈現(xiàn)下降趨勢，10月CAT活性又有所增加。轉(zhuǎn)基因高羊茅6-2和6-3株系的POD活性均高于野生型對照植株(圖5)。

2.1.6葉綠素含量的變化植株的生長代謝與葉綠素含量有很大的關(guān)系。光合作用產(chǎn)生的有機(jī)物提供植物的生長，光合作用必須有色素才能進(jìn)行，大部分葉綠素a和b吸收光能，少量的葉綠素a捕獲傳遞光能，使光合作用進(jìn)行下去，所以葉綠素的含量越多，植株的生長越旺盛，代謝越強(qiáng)。在農(nóng)牧場種植的株系在7月葉綠素含量降低，8月葉綠素含量大幅上升，9～10月，葉綠素含量逐漸降低，可能是7月份農(nóng)牧場的灌水受到限制。轉(zhuǎn)基因株系6-2株系和6-3株系的葉綠素平均含量均大于野生型對照(表5)。

圖5　高羊茅的CAT活性Fig.5　The CAT content of transgenic tall fescue

圖6　草坪草的葉綠素含量Fig.6　The cholorophyll content of transgenic tall

2.2種植轉(zhuǎn)基因高羊茅的土壤理化性質(zhì)變化

賀蘭山農(nóng)牧場為典型的鹽堿地，土壤pH 9.29，全鹽含量為5.01 g/kg，堿化度為14.91%。所有株系土壤pH和全鹽含量呈現(xiàn)線下降后上升的趨勢，這可能是秋季反鹽的原因。轉(zhuǎn)基因株系土壤的pH顯著低于野生型，pH呈現(xiàn)為野生型>6-2>6-3，堿化度呈下降趨勢(表1)。

3討論與結(jié)論

3.1鹽堿地上轉(zhuǎn)基因高羊茅生理生化指標(biāo)變化

葉綠素作為綠色植物吸收光能，發(fā)生光合反應(yīng)，將光能轉(zhuǎn)換成化學(xué)能的一種活性物質(zhì)，其含量的多少直接影響到植物光合作用，產(chǎn)生有機(jī)物能力的強(qiáng)弱[17]。鹽脅迫下能破壞植物葉綠體的結(jié)構(gòu)，并且增加葉綠體酶的活性，從而加速葉綠素的分解，導(dǎo)致葉綠素含量降低[18]。轉(zhuǎn)基因株系6-2和6-3株系的葉綠素平均含量整體大于野生型對照。

表1　農(nóng)牧場轉(zhuǎn)基因高羊茅的土壤pH、全鹽及堿化度

鹽堿地上種植的植物在受到鹽脅迫時，導(dǎo)致植物發(fā)生氧化反應(yīng)，使植物體內(nèi)產(chǎn)生大量的活性氧和自由基，從而破換植物的細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)[19]。有研究報道，在鹽脅迫下，植物體內(nèi)的活性氧含量會上升[20]，為了適應(yīng)鹽脅迫產(chǎn)生的氧化傷害,植物體內(nèi)形成了相應(yīng)的保護(hù)系統(tǒng)來減少或清除活性氧或自由基,緩解氧化脅迫[21]。植物體內(nèi)的SOD，CAT和POD等保護(hù)酶類相互協(xié)同作用，共同清除植物體在逆境下產(chǎn)生的過量的活性氧,從而保持活性氧的代謝平衡和膜結(jié)構(gòu),在一定程度上減緩或抵御逆境脅迫對植物的傷害[22]。SOD更是保護(hù)植物細(xì)胞免受自由基傷害的第一道防線,其活性的高低反映氧化損傷時植株的修復(fù)能力。從試驗中發(fā)現(xiàn)，農(nóng)牧場所有株系SOD活性的變化呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢。SOD平均含量從大到小依次為：6-2>6-3>野生型對照，鹽堿脅迫下，高羊茅野生型植株SOD活性降低，而轉(zhuǎn)基因植株葉中的SOD活性則顯著升高，轉(zhuǎn)基因株系6-2的SOD活性>6-3。CAT能消除植物體內(nèi)產(chǎn)生的過多的H2O2,使植物體內(nèi)H2O2含量維持一個低濃度水平。高羊茅野生型植株葉片的CAT活性相對高,而轉(zhuǎn)基因植株的CAT活性相對低。而植物體內(nèi)POD是免受H2O2傷害保護(hù)細(xì)胞的主要酶[23],它在保護(hù)細(xì)胞免受H2O2脅迫中起重要作用。從試驗結(jié)果分析，轉(zhuǎn)基因株系與野生型對照中POD活性差異顯著，鹽堿脅迫顯著提高了轉(zhuǎn)基因植株的POD活性，轉(zhuǎn)基因株系6-3和6-2的POD活性大于野生型植株。轉(zhuǎn)SOS途徑基因的轉(zhuǎn)基因植株具有較強(qiáng)耐鹽堿性的原因之一是增強(qiáng)了耐鹽堿修復(fù)能力。

Pro是植物在逆境脅迫下產(chǎn)生的一種重要的滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)。種植在農(nóng)牧場的轉(zhuǎn)基因高羊茅6-2和6-3株系的脯氨酸含量顯著高于野生型對照的脯氨酸含量，這說明在鹽堿脅迫條件下，通過積累較多的脯氨酸，轉(zhuǎn)SOS途徑基因的轉(zhuǎn)基因植株可以提高植物的耐鹽堿能力。

逆境脅迫導(dǎo)致細(xì)胞膜脂質(zhì)過氧化，破壞質(zhì)膜結(jié)構(gòu)，植物MDA含量高低能夠反映質(zhì)膜破壞程度。轉(zhuǎn)基因株系6-2和6-3與野生型對照相比，在鹽堿脅迫下MDA積累較少，說明轉(zhuǎn)基因株系膜脂過氧化程度較低，膜的結(jié)構(gòu)較穩(wěn)定。

3.2轉(zhuǎn)基因高羊茅對土壤理化性質(zhì)的影響

對種植轉(zhuǎn)基因高羊茅后的土壤的理化性質(zhì)方面影響的研究報道較少，多數(shù)僅研究土壤肥力。土壤理化性質(zhì)及結(jié)構(gòu)多數(shù)發(fā)生變化是由于灌溉、耕作模式等對其產(chǎn)生影響。試驗由于導(dǎo)入的SOS基因途徑使轉(zhuǎn)基因高羊茅在一定程度上出現(xiàn)了耐鹽性，從試驗的總體結(jié)果分析，農(nóng)牧場種植的轉(zhuǎn)基因高羊茅和野生型高羊茅的土壤的物理性質(zhì)發(fā)生了一定的變化。通過將種植在相同條件下的轉(zhuǎn)基因高羊茅與野生型植株的種植土壤進(jìn)行比較，種植轉(zhuǎn)基因高羊茅后能降低土壤 pH、全鹽及堿化度，這是由于種植高羊茅后，植株的長勢差異而引起的，即達(dá)到生物改良的作用[24]。

參考文獻(xiàn):

[1]Apse M P,Aharon G S,Snedden W A,etal.Salt tolerance conferred by over-expression of a vacuolar Na+/H+antiporter in Arabidopsis[J].Science,1999,285:1256-1258.

[2]Zhu J K.Plant salt tolerance[J].Trends Plant Sci,2001,6(2):66-71.

[3]湯巧香，蔣桂香.高羊茅草坪草的耐鹽性鑒定研究[J].山東林業(yè)科技，2009(3)：37-38.

[4]Lakkaraju S ,Piteher L H,Wang X L,etal.Agrobactetrium mediated trnasofrmation of turgfrasses[J].Proeeeding sof the Tenth Annivesrary Rugters Turgfarss Sym Posium[M].Cook College,RugtersUniversiyt,2001:20.

[5]Bettany A J E,Dalton S J,Timms E,etal.Agrobaeteriumtuoeafeeins-mediated Transformation ofFestucaarundniaeea(Sehreb) andLoliummultrum(Lam.)[J].Plnat Cell ReP,2003,21:437-444.

[6]Dong Mei Ma,Wei Rong Xu.Co-expression of the Arabidopsis SOS genes enhances salt tolerance in transgenic tall fescue[J].International Journal of Cell Biology,2014,251:219-231.

[7]張治安,張美善,蔚榮海.植物生理學(xué)實驗指導(dǎo)[M].北京:中國農(nóng)業(yè)科學(xué)技術(shù)出版社,2004.

[8]王晶英,敖紅,張杰,等.植物生理生化實驗技術(shù)與原理[M].哈爾濱:東北林業(yè)大學(xué)出版社,2003.

[9]張志良,瞿偉菁,李小芳.植物生理學(xué)實驗指導(dǎo)[M].北京:高等教育出版社,2009.

[10]李合生.植物生理生化實驗原理和技術(shù)[M].北京：高等教育出版社，1985:67-70.

[11]王學(xué)奎.植物生理生化實驗原理和技術(shù)[M].北京：高等教育出版社，2006:167-173.

[12]南京農(nóng)業(yè)大學(xué).土壤農(nóng)化分析(二版)[M].北京：農(nóng)業(yè)出版社，1986.

[13]孫偉澤，韓博，胡曉寧，等.不同濃度脅迫下苜蓿丙二醛含量變化[J].安徽農(nóng)業(yè)科學(xué)，2009,37(5)：1905-1906.

[14]劉旻霞，馬建祖.逆境脅迫下的亞高山草甸植物脯氨酸累積特點分析[J].石河子大學(xué)學(xué)報(自然科學(xué)版)，2010,28(4)：422-426.

[15]王志兵，解叢林，張鳳清.豆殼中過氧化物酶的提純[J].食品研究與開發(fā)，2010,31(8)：159-162.

[16]Hodge M，Aadrew C J,Johnson D A,etal.Antioxidant compound responses to chilling stress in differentially sensitive inbred maize lines[J].Physiol Plant,1996,98(4):685-692.

[17]盧瓊瓊，宋新山，嚴(yán)登華.干旱脅迫對大豆苗期光合生理特性的影響[J].中國農(nóng)學(xué)通報，2012，28(9)：42-47.

[18]馬巧利，孫彥，楊青川，等.NaCl和等滲PEG400脅迫下對紫花苜蓿種子發(fā)芽及生理活性的影響[J].草地學(xué)報，2012,20(3)：547-551.

[19]Scandalios J G.Oxygen stress and superoxide dismutases [J].Plant Physiology,1993,101:7-12.

[20]Jiang M,Zhang J.Effect of abscisic acid on active oxygen species,antioxidative defence system and oxidative damage in leaves of maize seedlings[J].Plant and Cell Physiology,2001,42:1265-1273.

[21]Mittler R.Oxidative stress,antioxidants and stress tolerance[J].Trends in Plant Science,2002,7(9):405-410.

[22]Hernandez J A,Ferrer M A,Jimenez A,etal.Antioxidant system and O2/H2O2production in theapoplast of pea leaves.Its relation with salt-induced necrotic lesions in minor veins [J].Plant Physiology,2001,127:817-831.

[23]Rout N P,Shaw B P.Salt tolerance in aquatic macrophytes:ionic relation and interaction [J].Biologia Plantarum,2001,44:95-99.

[24]李茜，孫兆軍，秦萍.寧夏鹽堿地現(xiàn)狀及改良措施綜述[J].安徽農(nóng)業(yè)科學(xué),2007,35(33):10808-10810.

Salt tolerance identification of tall fescue transferred SOS pathway genes

NI Xing1,QIN Chu2,PING Ling1,MA Dong-mei1,XU Xing1

(1.CollegeofAgriculture,NingxiaUniversity,Yinchuan750021,China； 2.CollegeofLifeScience,NingxiaUniversity,Yinchuan750021,China)

Abstract：The tall fescue transferred SOS gene and wild type plants were used to identify the salt tolorence through measuring the chlorophyll content，MDA，proline，antixidant enzyme activity and physicochemical properties. The results showed that the average chlorophyll content, proline content and antioxidant enzyme activity of the transgenic tall fescue were higher than wild type. However，MDA content was lower. The soil pH，alkalinity all gradually reduced after growing tall fecuse, and the decreasing range for transgenetic tall fescue was greater than wild type. The results suggested that transgenic tall fescue was better in terms of salt tolerance and soil improvement.

Key words：tall fescue;transgenosis;physiology and biochemistry;soil physicochemical properties;salt tolerance

中圖分類號：Q 789

文獻(xiàn)標(biāo)識碼：A

文章編號：1009-5500(2016)01-0043-05

作者簡介：倪星(1991-)，陜西咸陽人，在讀碩士研究生。

基金項目：寧夏回族自治區(qū)牧草育種專項(NYYZ-2014-Z12)和國家973項目(2012CB114204)資助

收稿日期：2015-08-23； 修回日期：2015-11-27

E-mail：475399935@qq.com

許興為通訊作者。