番茄骨干材料對黃化曲葉病毒病抗性的鑒定及防御酶活性差異比較

賀字典，余金詠，沈江杰，毛秀杰，杜艷麗

(河北科技師范學(xué)院，河北 秦皇島，066600)

番茄骨干材料對黃化曲葉病毒病抗性的鑒定及防御酶活性差異比較

賀字典，余金詠，沈江杰，毛秀杰，杜艷麗

(河北科技師范學(xué)院，河北 秦皇島，066600)

為確定番茄對黃化曲葉病毒病的抗性，以番茄骨干育種資源為試驗(yàn)材料，鑒定了34份對番茄黃化曲葉病毒病的抗性，同時(shí)測定了8份骨干材料感病前后體內(nèi)相關(guān)防御酶活性的變化。結(jié)果表明：44.12%的番茄育種材料屬于黃化曲葉病毒病抗性免疫，高抗占11.76%。從34份番茄品種中任選取5份抗病和3份中抗番茄材料進(jìn)行生化指標(biāo)的比較，發(fā)現(xiàn)8份材料感病后的EST，PAL，POD活性均比感病前高。此外，8份材料的CAT活性感病后均比感病前低。

番茄；黃化曲葉病毒病(TYLCV)；抗病性鑒定；防御酶活性

番茄黃化曲葉病毒病是由番茄黃化曲葉病毒(Tomato yellow leaf curl virus，簡稱TYLCV)引起的一種重要番茄病害[1]。該病毒的主要傳毒介質(zhì)是煙粉虱，其中B型煙粉虱繁殖快、適應(yīng)能力強(qiáng)、傳毒效率高，是TYLCV的最主要的傳播介體[2，3]。煙粉虱的若蟲和成蟲在刺吸寄主汁液過程中傳播TYLCV。在有毒寄主植物上最短的獲毒時(shí)間為15～30 min，一旦獲毒可在體內(nèi)終生存在，屬于持久性傳毒類型[4]。煙粉虱的獲毒及傳毒效率與蟲齡及性別有關(guān)，雌成蟲的傳毒效率比雄成蟲高5倍左右，成蟲傳播TYLCV的效率也隨蟲齡的增長而下降[5，6]。嫁接是傳播TYLCV的另一個(gè)途徑。Pico等[1]1996年報(bào)道感病的接穗嫁接到正常的砧木上，TYLCV可以經(jīng)接穗傳至砧木，造成全株系統(tǒng)發(fā)病。于力等[7]發(fā)現(xiàn)以感病的番茄幼苗為砧木嫁接健康接穗，嫁接后30 d所有接穗的葉片均檢測到TYLCV，從另一方面證明嫁接可以傳毒。與其它植物病毒不同，TYLCV不經(jīng)由種子、機(jī)械摩擦等途徑傳毒[8]。近年來煙粉虱的大發(fā)生，該病害迅速在全球蔓延，已給美國、以色列、埃及和澳大利亞等國的番茄生產(chǎn)造成嚴(yán)重?fù)p失[9]，中國廣東、廣西、上海、江蘇、河南、山東、臺灣和浙江等地番茄黃化曲葉病毒病的發(fā)生逐年嚴(yán)重，并呈現(xiàn)由南向北迅速蔓延的趨勢[10～14]。發(fā)病較輕的地塊一般減產(chǎn)30%～40%，嚴(yán)重地塊造成絕產(chǎn)絕收。

農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中解決番茄黃化曲葉病毒病危害的最有效途徑是選育抗病品種。不同的植株對同一病原物，同一植株對不同種的病原物可具有不同的抗病性[15，16]，植物抗病性與防御酶類的含量是密切相關(guān)的，目前已有關(guān)于利用某些防御酶類的含量或活性水平變化作為植物抗病性鑒定的生化指標(biāo)的研究報(bào)道。如PAL活性和酚類物質(zhì)含量可作為茄子黃萎病抗性鑒定的生化指標(biāo)[17]；PAL活性可作為花椒葉銹抗性鑒定的生化指標(biāo)[18]；PPO 和PAL活性作為野生大豆病毒病抗性鑒定的生化指標(biāo)[19]。但是目前尚未發(fā)現(xiàn)關(guān)于番茄黃化曲葉病毒病的抗性與相關(guān)酶之間關(guān)系的研究報(bào)道。筆者對34份番茄育種材料對TYLCV抗病性進(jìn)行鑒定，以揭示番茄對TYLCV的抗性強(qiáng)弱與其防御酶活性的關(guān)系，為選育抗病品種奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 供試材料

本試驗(yàn)選用的34份番茄品種見表1，由河北科技師范學(xué)院番茄育種課題組提供。

1.2 抗病性鑒定

1.2.1 調(diào)查方法 大棚內(nèi)番茄黃化曲葉病毒病是在自然條件下發(fā)病的，無人為干預(yù)，待大棚內(nèi)番茄普遍發(fā)病，病情穩(wěn)定，病害特征明顯后，調(diào)查棚內(nèi)番茄各株的發(fā)病情況，每7 d調(diào)查1次，計(jì)算病株率和病情指數(shù)。

1.2.2 番茄黃化曲葉病病情指數(shù)的分級標(biāo)準(zhǔn)

0級：整株健康無黃化曲葉。

1級：輕度矮化。株高為健株株高的4/5左右，頂部1～2枝枝條黃化曲葉，結(jié)果期有3穗以上果實(shí)。

2級：矮化。株高為健株株高的2/3左右，頂部典型黃化曲葉，結(jié)果期下部有2穗果。

3級：明顯矮化。株高為健株株高的1/2左右，頂部典型黃化曲葉，結(jié)果期下部有1穗果。

4級：嚴(yán)重矮化。株高為健株株高的1/3以下，整株典型癥狀，結(jié)果期無番茄果實(shí)，或提早枯死。

1.2.3 病株率和病情指數(shù)的計(jì)算

發(fā)病率=(病株數(shù)/總株數(shù))×100%

1.2.4 番茄病毒病群體抗性分級標(biāo)準(zhǔn) 參考文獻(xiàn)[20]的抗性鑒定標(biāo)準(zhǔn)。其中免疫I(病情指數(shù)為0)，高抗HR(2≥病情指數(shù)>0)，抗病R(15≥病情指數(shù)>2)，中抗MR(30≥病情指數(shù)>15)，感病S(100≥病情指數(shù)>30)；并將免疫、高抗、抗病、中抗均歸為抗病。

1.3 試驗(yàn)材料的采集

從34份番茄育種材料中選取抗病和中抗的8份番茄育種材料，分別為1-浙粉702和迪福，4-216，3-16綠，5-16綠選小臍，8-yzfgcg，6-jl-1×815♂不易落，7-JdftF2和2-寒光，每個(gè)品種采集未感染黃化曲葉病毒和感染番茄TYLCV植株葉片各3株。將采摘下的番茄葉片立即放入冰盒中，帶回實(shí)驗(yàn)室，放入-20 ℃冰箱內(nèi)保存，備用。

1.4 酶粗提液制備

將3棵番茄葉片混合，隨機(jī)稱取各處理冰凍葉片1 g，3次重復(fù)。然后將3 mL的0.01 mmol/L磷酸緩沖液( pH 6.5，內(nèi)含PVP 10 g/L，疏基乙醇15 mmol/L)分2次加入，冰浴研磨過濾后，15 000 r/min 4 ℃離心15 min，取上清液為酶粗提液。

1.5 防御酶活性測定

1.5.1 酯酶( EST )活性測定 采用賈顯祿[21]的方法測定。

1.5.2 過氧化物酶( POD ) 活性測定 采用愈創(chuàng)木酚法[22]，以每分鐘OD450值改變0.1的酶用量為一個(gè)酶活單位。

1.5.3 超氧化物歧化酶( SOD )活性測定 采用Giannopolitis和Rice方法測定[23]，以每分鐘抑制氮藍(lán)四唑(NBT)50%的酶用量為一個(gè)酶活單位。

1.5.4 苯丙氨酸解氨酶( PAL) 活性測定 采用陳捷等[24]的方法，以每分鐘OD290值改變0.01的酶用量為一個(gè)酶活單位。

1.5.5 蛋白質(zhì)含量測定 采用考馬斯亮蘭G250法[ 25]。酶的比活性以每毫克蛋白所含的酶單位數(shù)(U/mg protein)。

1.5.6 過氧化氫酶(CAT)活性測定 參考陳捷等[24]測定。以每分鐘OD值減少0.01的酶用量為一個(gè)酶活單位。

2 結(jié)果與分析

2.1 番茄對TYLCV抗病性鑒定

番茄育種材料抗TYLCV抗病性差異較大，表現(xiàn)免疫的有15份，占供試材料總數(shù)的44.12%;表現(xiàn)高抗的有4份，占11.76%；表現(xiàn)抗病的有10份，占29.41%；表現(xiàn)中抗的有5份，占14.71%(表1)。

2.2 番茄感染TYLCV前后EST活性的變化

番茄葉片內(nèi)的EST活性測定結(jié)果表明，受TYLCV侵染的8份番茄育種材料EST活性均比未感染TYLCV時(shí)的高(圖1)。其中2-寒光感病后葉片內(nèi)EST活性是未發(fā)病時(shí)的1.46倍； 7-jdftf2和8-yzhgcg感病后EST活性分別是未發(fā)病時(shí)的1.9倍和1.8倍；而其余育種材料感病前后EST活性差異不顯著。

2.3 番茄感染TYLCV前后CAT活性的變化

番茄葉片內(nèi)的CAT活性測定結(jié)果表明，受黃化曲葉病毒侵染的8份番茄育種材料CAT活性均比未感染黃化曲葉病毒的降低(圖2)。1-浙粉702和迪福未發(fā)病葉片內(nèi)CAT活性分別是感病狀態(tài)下的3.60倍；3-16綠和7-jdftf2未發(fā)病時(shí)CAT活性分別是發(fā)病后的1.85倍和2.07倍；其余育種材料感病前后差異不顯著。

2.4 番茄感染TYLCV前后PAL活性的變化

番茄葉片內(nèi)的PAL活性測定結(jié)果表明，受黃化曲葉病毒侵染的8份不同番茄育種材料PAL活性均比未感染黃化曲葉病毒的高(圖3)。其中2-寒光，3-16綠，5-16綠選小臍，6-jl-1×185(不易落)和8-yzhgcg發(fā)病后葉片內(nèi)的PAL活性分別是未發(fā)病的1.99，1.23，1.47，1.30和1.11倍。

2.5 番茄感染TYLCV前后蛋白質(zhì)含量活性的變化

番茄葉片內(nèi)的蛋白質(zhì)含量測定結(jié)果表明，除2-寒光外，受黃化曲葉病毒侵染的7份番茄育種材料蛋白質(zhì)含量均比未感染黃化曲葉病毒的低(圖4)。其中1-浙粉702和迪福、3-16綠育種材料未發(fā)病葉片內(nèi)蛋白質(zhì)含量分別是感病狀態(tài)下的1.66倍，1.59倍。4-216，6-jl-1×185(不易落)和8-yzhgcg育種材料感病前蛋白質(zhì)含量是感病狀態(tài)下的1.29倍，1.46倍和1.53倍。

圖1 不同番茄品種感病前后EST活性變化注：圖中的品種序號1，代表1-浙粉702和迪福；2，代表2-寒光；3，代表3-16綠；4，代表4-216；5，代表5-16綠選小臍；6，代表6-jl-1×815(不易落♂)；7代表7-jdftf2；8代表8-yzhgcg。以下同。

圖2 不同番茄品種感病前后CAT活性變化

圖3 不同番茄品種感病前后PAL活性的變化 圖4 不同番茄品種感病前后蛋白質(zhì)質(zhì)量分?jǐn)?shù)的變化

2.6 番茄感染TYLCV前后POD活性的變化

番茄葉片內(nèi)的POD活性測定結(jié)果表明，受黃化曲葉病毒侵染的8份番茄育種材料POD活性均比未感染黃化曲葉病毒時(shí)的高(圖5)。3-16綠發(fā)病后葉片內(nèi)POD活性分別是未發(fā)病時(shí)的3倍；其余育種材料感病前后POD活性差異不顯著。

圖5 不同番茄品種感病前后POD活性的變化

圖6 不同番茄品種感病前后SOD活性的變化注：1表示jl-1×815(不易落♂)，2表示7-jdftf2，3表示 3-16綠，4表示4-216

2.7 番茄感染TYLCV前后SOD活性的變化

番茄葉片內(nèi)的SOD活性測定結(jié)果表明，除7-jdftf2育種材料以外，其余番茄育種材料受黃化曲葉病毒侵染后葉片內(nèi)的SOD活性均比未感染黃化曲葉病毒的低(圖6)。

3 結(jié)論與討論

目前，番茄種質(zhì)資源缺乏，特別是抗病、抗逆的資源材料。我國抗病品種主要靠從國外引進(jìn)的親本改造和國外抗病品種后代分離篩選獲得，自主創(chuàng)新材料較少。趙麗萍等[26]利用從國外和臺灣地區(qū)引進(jìn)的抗性父母親本育成的蘇粉紅1號就對TYLCD田間抗性較強(qiáng)，適宜在TYLCD嚴(yán)重發(fā)生的地區(qū)種植，說明父母本對TYLCD抗性強(qiáng)弱決定了后代的抗性。

在植物的抗病反應(yīng)中，其中一些相關(guān)酶類起著很重要的調(diào)控作用，超氧化物歧化酶(SOD)、過氧化氫酶(CAT)、過氧化物酶(POD)、苯丙氨酸解氨酶(PAL)等，植物病害的發(fā)生與這些酶活性變化有著密切的關(guān)系，并且抗病反應(yīng)和感病反應(yīng)兩者在SOD等酶活性變化方面有著顯著的不同[27～29]。PAL活性是番茄對根霉果腐病抗性的參考指標(biāo)[30]。番茄葉片苯丙氨酸解氨酶( PAL)、 多酚氧化酶( PPO)、過氧化物酶( POD)、脂氧合酶( LOX)、幾丁質(zhì)酶和β- 1，3葡聚糖酶活性明顯增強(qiáng)后可抵抗番茄灰霉病侵染[31]。但目前尚未發(fā)現(xiàn)關(guān)于番茄黃化曲葉病毒病抗性高低與相關(guān)酶活性的研究報(bào)道，本實(shí)驗(yàn)通過分別比較了8份不同番茄育種材料發(fā)病前后幾種相關(guān)酶活性水平的變化，發(fā)現(xiàn) 8份材料感病后的EST，PAL，POD活性均比感病前高，而CAT活性感病后均比感病前低。所得結(jié)果結(jié)合分子生物學(xué)如SSR標(biāo)記、RFLP標(biāo)記和蛋白質(zhì)組學(xué)進(jìn)一步研究后，對于指導(dǎo)番茄抗TYLCD育種會(huì)更有意義。

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(責(zé)任編輯：朱寶昌)

Resistance Identification of Tomato Key Materials to Yellow Leaf Curl Virus and Comparison of Major Defensive Enzymes Activities Between Healthy and Sick Breeds

HE Zidian, YU Jinyong, SHEN Jiangjie, MAO Xiujie, DU Yanli

(Hebei Normal University Science & Technology, Qinhuangdao Hebei, 066600，China)

Tomato yellow leaf curl virus (TYLCV) has developed from south to north in recent years and become a major tomato disease in Eastern Hebei. The resistance of 34 main tomato breeding materials to TYLCV was identified in the greenhouse. At the same time, the defensive enzyme activities of 8 key materials signed resistant and susceptible were tested between healthy and sick ones. The results showed that 44.12% were immune, 11.76% were high resistant to TYLCV. With the comparison of differences test, the activities of EST, PAL and POD in pathogenic materials were higher than that of healthy ones, while CAT activity seemed to be opposite.

tomato; yellow leaf curl virus (TYLCV); resistance identification; defensive enzyme activity

10.3969/J.ISSN.1672-7983.2016.02.006

2016-03-09; 修改稿收到日期: 2016-03-30

S436.412.1+1

A

1672-7983(2016)02-0027-06

賀字典(1972-)，女，博士，教授。主要研究方向：蔬菜病害生物防治。