糖多酚A對輻射損傷小鼠的防護(hù)作用

糖多酚A對輻射損傷小鼠的防護(hù)作用

劉娟洪閣楊澍紀(jì)?，撽慅垊⑻燔?/p>

300192天津，中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院生物醫(yī)學(xué)工程研究所（劉娟、洪閣、紀(jì)?，摗㈥慅?、劉天軍）；300140天津市第四中心醫(yī)院藥物臨床試驗(yàn)機(jī)構(gòu)（楊澍）

目的通過建立137Cs γ射線誘導(dǎo)的輻射損傷小鼠模型，探討通過結(jié)構(gòu)修飾而得到的糖多酚A的輻射防護(hù)作用。方法4～6周齡的雄性昆明種小鼠42只，用隨機(jī)數(shù)字表法分為陰性對照組（NCG）、陽性對照組（PCG）、照射對照組（ICG）以及糖多酚A的0.05、0.10和0.20 g/kg 3個劑量組。采用6.0 Gy137Cs γ射線單次全身照射構(gòu)建小鼠電離輻射損傷模型。射線照射前連續(xù)給藥14 d，照射后繼續(xù)給藥7 d。照射后第7天處死小鼠，觀察不同劑量的糖多酚A對小鼠臟器系數(shù)、外周血指標(biāo)、脾結(jié)節(jié)數(shù)、骨髓DNA含量和股骨有核細(xì)胞數(shù)的影響。結(jié)果與ICG比較，糖多酚A 0.05、0.10、0.20 g/kg劑量組均可有效抑制照射后7 d小鼠免疫系統(tǒng)和造血系統(tǒng)的輻射損傷，使脾臟系數(shù)（Z=-2.364、-3.003、-2.747，均P＜0.05）和內(nèi)源性脾結(jié)節(jié)數(shù)均顯著升高（Z= -2.458、-2.141、-2.206，均P＜0.05），其中糖多酚A 0.05 g/kg和0.20 g/kg劑量組白細(xì)胞數(shù)顯著升高（Z=-2.652、-2.139，均P＜0.05），糖多酚A 0.20 g/kg劑量組紅細(xì)胞數(shù)（Z=-2.364，P＜0.05）、骨髓DNA含量（Z=-2.492，P＜0.05）和股骨有核細(xì)胞數(shù)（Z＝-2.492，P＜0.05）也顯著高于ICG。結(jié)論糖多酚A可通過改善臟器系數(shù)，增高內(nèi)源性脾結(jié)節(jié)數(shù)、外周血白細(xì)胞數(shù)、骨髓DNA含量和股骨有核細(xì)胞數(shù)來緩解電離輻射所致?lián)p傷，促進(jìn)小鼠免疫和骨髓造血功能的恢復(fù)。

結(jié)構(gòu)修飾；糖多酚A；電離輻射；外周血；脾結(jié)節(jié)；骨髓DNA

0 引言

電離輻射可導(dǎo)致頭暈、乏力、食欲下降、免疫力降低、白細(xì)胞數(shù)降低、造血系統(tǒng)損傷、染色體畸變等癥狀[1]，故輻射防護(hù)藥物的研發(fā)受到社會的廣泛關(guān)注。過去輻射防護(hù)劑在國內(nèi)外的研究主要集中于合成化合物上[2-3]。研究結(jié)果表明，一大批植物提取物和草藥制劑在體內(nèi)外均具有很好的輻射防護(hù)作用[4-5]。植物中富含大量多酚物質(zhì)，且已有研究結(jié)果證實(shí)這些多酚類物質(zhì)具有潛在的輻射防護(hù)作用[6]。植物多酚可通過抗氧化、DNA修復(fù)等機(jī)制對輻射造成的皮膚損傷具有顯著保護(hù)作用[7]。其中，茶多酚不僅能顯著增加輻射后小鼠的紅細(xì)胞數(shù)、白細(xì)胞數(shù)和血紅蛋白含量，還能增加輻射后小鼠的脾臟系數(shù)和胸腺系數(shù)，從而起到輻射防護(hù)作用[8]。

植物多酚[8-9]雖具有強(qiáng)大的輻射防護(hù)作用，但其存在生物利用度低、提取困難等缺點(diǎn)。本課題組通過對多酚化合物進(jìn)行結(jié)構(gòu)修飾得到含有糖化基團(tuán)的多酚類結(jié)構(gòu)——糖多酚A（圖1）。糖多酚A是以木糖與多酚為原料反應(yīng)而得，并經(jīng)紅外光譜、紫外光譜、核磁波譜和質(zhì)譜表征[10]；不僅降低了多酚的毒性、提高了生物利用度，同時(shí)制備簡捷，可彌補(bǔ)植物多酚的不足。此外，糖多酚A還具有良好的抗氧化活性和增強(qiáng)機(jī)體免疫力的功能[10]。據(jù)報(bào)道，植物中提取的多酚-多聚糖軛合物具有很好的輻射防護(hù)活性[11]，因此推測糖多酚A也應(yīng)具有一定的輻射防護(hù)作用。本研究主要觀察糖多酚A對小鼠免疫器官（脾臟和胸腺）以及外周血、骨髓DNA含量的影響；同時(shí)，考察糖多酚A對股骨有核細(xì)胞數(shù)的改變，以探討糖多酚A對電離輻射所致免疫和造血等輻射敏感器官受損以及活動能力降低等的防治作用。

圖1 糖多酚A的結(jié)構(gòu)

1 材料與方法

1.1 主要材料與儀器

SPF級雄性昆明種小鼠42只，4～6周齡，18～20 g，購自北京華阜康生物科技股份有限公司，實(shí)驗(yàn)動物使用許可證號SCXK（京）2014-0004。注射用氨磷?。▏帨?zhǔn)字H20010403，大連美羅大藥廠），糖多酚A（中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院生物醫(yī)學(xué)工程研究所自制）。Gammacel 40137Cs γ射線照射源（加拿大原子能有限公司），BC-2800全自動血液細(xì)胞分析儀（深圳邁瑞生物醫(yī)療電子股份有限公司），Hettich Zentrifugen 110離心機(jī)（德國Hettich公司），BX53正置熒光顯微鏡（日本Olympus公司）；VarioskanFlash3001全波長多功能酶標(biāo)儀（美國Thermo Fisher Scientific公司）。

1.2 方法

1.2.1 動物分組及給藥方案

小鼠飼養(yǎng)條件為光照12 h，飼養(yǎng)溫度25～27℃，濕度40%。適應(yīng)性喂養(yǎng)4 d后，將小鼠按體質(zhì)量大小編號，用隨機(jī)數(shù)字表法進(jìn)行完全隨機(jī)化分組：陰性對照組（negative control group，NCG）、陽性對照組（positivecontrolgroup，PCG）、照射對照組（irradiation control group，ICG）以及糖多酚A的0.05、0.10和0.20 g/kg 3個劑量組，每組7只。NCG、PCG和ICG每天灌胃去離子水；糖多酚A的3個劑量組分別給予相應(yīng)劑量的糖多酚A，1次/d，灌胃14 d。第14天給藥后，除NCG不給予照射外，其余各組均給予137Cs γ射線單次全身照射，吸收劑量為6.0 Gy，劑量率為0.905 2 Gy/min[12]，其中PCG于照射前30 min腹腔注射氨磷汀0.25 ml（16 mg/ml）。照射后繼續(xù)給藥7 d，照射前每2天記錄1次體質(zhì)量，照射后每天記錄體質(zhì)量，并同時(shí)記錄飲食量。

1.2.2 小鼠脾臟系數(shù)和胸腺系數(shù)檢測

小鼠接受6.0 Gy射線單次全身照射后7 d，對小鼠稱體質(zhì)量，眼球取血處死，收集脾臟和胸腺并稱質(zhì)量，按臟器質(zhì)量（mg）/體質(zhì)量（g）計(jì)算臟器系數(shù)。

1.2.3 小鼠外周血指標(biāo)檢測

小鼠接受6.0 Gy137Cs γ射線單次全身照射后7 d，對小鼠摘眼球取血，用全自動血液細(xì)胞分析儀檢測白細(xì)胞數(shù)、紅細(xì)胞數(shù)和血紅蛋白含量。具體方法參照文獻(xiàn)[13]進(jìn)行。

1.2.4 小鼠脾結(jié)節(jié)數(shù)、骨髓DNA含量和股骨有核細(xì)胞數(shù)的測定

將取出的脾臟稱質(zhì)量后放入Bouin液內(nèi)固定，約24 h后取出，用體積分?jǐn)?shù)為70%的乙醇溶液沖洗去大部分黃色，肉眼計(jì)數(shù)突出脾臟表面的結(jié)節(jié)數(shù)。照射后7 d，小鼠眼球取血處死后取一側(cè)股骨，參照文獻(xiàn)[14]測定DNA含量；取另一側(cè)股骨，用白細(xì)胞稀釋液沖洗骨髓，再于熒光顯微鏡下觀察股骨有核細(xì)胞并計(jì)數(shù)[15]。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS17.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，所有計(jì)量資料均以均值±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示，組間比較用秩和檢驗(yàn)，以P＜0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 糖多酚A對受照小鼠體質(zhì)量的影響

經(jīng)6.0 Gy137Cs γ射線照射后，小鼠體質(zhì)量明顯下降，其中NCG、PCG和糖多酚A 0.10 g/kg劑量組小鼠的體質(zhì)量下降較少，且照射后這3組小鼠的體質(zhì)量均明顯高于ICG組，表明氨磷汀和0.10 g/kg劑量的糖多酚A對受照小鼠的體質(zhì)量均有明顯的提高。（圖2）

圖2 糖多酚A對6.0 Gy137Cs γ受照小鼠體質(zhì)量的影響

2.2 糖多酚A對受照小鼠臟器系數(shù)的影響

圖3 糖多酚A對6.0 Gy137Cs γ射線受照小鼠脾臟系數(shù)的影響

經(jīng)6.0 Gy137Cs γ射線照射后7 d，小鼠脾臟和胸腺嚴(yán)重受損，與NCG比較，ICG小鼠的脾臟系數(shù)和胸腺系數(shù)均顯著降低（Z=-3.130、-2.492，均P＜0.05）。與PCG比較，糖多酚A各劑量組小鼠的脾臟系數(shù)、胸腺系數(shù)差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＞0.05）。受照后7 d，與ICG相比，糖多酚A各劑量組小鼠的脾臟系數(shù)和胸腺系數(shù)均有不同程度的升高，其中糖多酚A 0.20g/kg劑量組小鼠的脾臟系數(shù)升高顯著（Z=-2.364，P＜0.05），0.05 g/kg劑量組和0.10 g/kg劑量組小鼠的胸腺系數(shù)亦升高顯著（Z=-1.981、-2.364，均P＜0.05）。這表明糖多酚A與氨磷汀均可有效抑制脾臟細(xì)胞和胸腺細(xì)胞的輻射損傷，促進(jìn)脾臟細(xì)胞增殖，增加脾臟質(zhì)量。（圖3、4）

2.3 糖多酚A對受照小鼠外周血的影響

經(jīng)6.0 Gy137Cs γ射線照射后7 d，與NCG比較，ICG小鼠白細(xì)胞數(shù)、紅細(xì)胞數(shù)和血紅蛋白濃度均顯著降低（Z=-3.137、-2.364、-3.130，均P＜0.05）。與PCG比較，糖多酚A各劑量組小鼠的白細(xì)胞數(shù)、紅細(xì)胞數(shù)和血紅蛋白濃度差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＞0.05）。與ICG相比，糖多酚A各劑量組白細(xì)胞數(shù)、紅細(xì)胞數(shù)和血紅蛋白濃度均呈上升趨勢，但未見明顯的劑量-反應(yīng)關(guān)系，其中糖多酚A 0.05 g/kg劑量組和0.20 g/kg劑量組與ICG比較，白細(xì)胞數(shù)（Z= -2.625、-2.139，均P＜0.05）和血紅蛋白濃度（Z=-2.108、-1.981，均P＜0.05）差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；糖多酚A 0.20 g/kg劑量組與ICG相比，紅細(xì)胞數(shù)差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（Z=-2.364，P＜0.05）。上述結(jié)果表明，糖多酚A與氨磷汀對于輻射損傷小鼠的外周血指標(biāo)有一定的提升作用，且低劑量與高劑量組的提升作用更明顯。（圖5～7）

2.4 糖多酚A對受照小鼠骨髓DNA含量、脾結(jié)節(jié)和股骨有核細(xì)胞數(shù)的影響

圖4 糖多酚A對6.0 Gy137Cs γ射線受照小鼠胸腺系數(shù)的影響

經(jīng)6.0 Gy137Cs γ射線照射后7 d，與NCG比較，ICG小鼠骨髓DNA含量和股骨有核細(xì)胞數(shù)顯著減少，脾結(jié)節(jié)數(shù)顯著增加，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（Z=-3.134、-3.130、-2.245，均P＜0.05）。與PCG比較，糖多酚A 0.20 g/kg劑量組小鼠骨髓DNA含量、股骨有核細(xì)胞和脾結(jié)節(jié)數(shù)差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（Z=-3.134、-3.130、-0.966，均P＜0.05）。與ICG比較，糖多酚A 0.05、0.10、0.20 g/kg劑量組均可增加受照小鼠的骨髓DNA含量、股骨有核細(xì)胞數(shù)和脾結(jié)節(jié)數(shù)，其中脾結(jié)節(jié)數(shù)差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（Z=-2.458、-2.141、-2.206，均P＜0.05），但未見明顯劑量依賴性；糖多酚A 0.20 g/kg劑量組小鼠骨髓DNA含量和股骨有核細(xì)胞數(shù)增加亦較為顯著（Z=-2.492、-2.492，均P＜0.05）。提示與糖多酚A相比，氨磷汀能顯著改善輻射所致的免疫系統(tǒng)和造血系統(tǒng)的損傷，但糖多酚A 0.20 g/kg劑量組的作用也較為顯著。（圖8～10）

圖5 糖多酚A對6.0Gy137Csγ射線受照小鼠外周血白細(xì)胞數(shù)的影響

圖6 糖多酚A對6.0Gy137Csγ射線受照小鼠外周血紅細(xì)胞數(shù)的影響

圖7 糖多酚A對6.0Gy137Csγ射線受照小鼠外周血血紅蛋白的影響

圖8 糖多酚A對6.0 Gy137Cs γ射線受照小鼠骨髓DNA的影響

圖9 糖多酚A對6.0 Gy137Cs γ射線受照小鼠脾結(jié)節(jié)數(shù)的影響

圖10 糖多酚A對6.0 Gy137Cs γ射線受照小鼠股骨有核細(xì)胞數(shù)的影響

3 討論與結(jié)論

輻射能造成機(jī)體一系列的生理損傷，其中免疫抑制和造血系統(tǒng)損傷是造成死亡的主要原因[8]。免疫細(xì)胞以及脾臟、胸腺等參與免疫調(diào)節(jié)的臟器是高輻射敏感的細(xì)胞群；而射線對于造血系統(tǒng)的損傷主要是抑制或破壞造血干細(xì)胞，常造成骨髓抑制、微循環(huán)障礙、白細(xì)胞數(shù)下降等造血微環(huán)境破環(huán)[16]。楊映雪等[17]研究結(jié)果表明，黃酮類可通過降低輻射對小鼠外周血白細(xì)胞的損傷、明顯提高受照小鼠脾臟系數(shù)和增加脾結(jié)節(jié)數(shù)，從而促進(jìn)放射損傷后造血系統(tǒng)和免疫系統(tǒng)的重建。因而本研究選取免疫系統(tǒng)（脾臟和胸腺）和造血系統(tǒng)（外周血、骨髓DNA、脾結(jié)節(jié)和股骨有核細(xì)胞）[1]作為評價(jià)對象。脾臟和胸腺是重要的免疫器官，脾臟系數(shù)和胸腺系數(shù)反映了生物體的免疫功能。骨髓是主要的造血組織，經(jīng)射線照射后，會造成DNA斷裂和外周血中白細(xì)胞、紅細(xì)胞、血小板數(shù)降低；而脾結(jié)節(jié)和股骨有核細(xì)胞數(shù)也代表了機(jī)體造血組織恢復(fù)的能力[1]，小鼠內(nèi)源性脾結(jié)節(jié)計(jì)數(shù)曾被作為一種篩選抗輻射藥物的方法[15]。

在本研究中，經(jīng)6.0 Gy137Cs γ射線照射后，小鼠免疫系統(tǒng)和造血系統(tǒng)均受到嚴(yán)重?fù)p傷，表現(xiàn)為脾臟和胸腺嚴(yán)重受損，小鼠的脾臟系數(shù)和胸腺系數(shù)顯著降低；同時(shí)，小鼠白細(xì)胞數(shù)、紅細(xì)胞數(shù)、骨髓DNA含量、脾結(jié)節(jié)和股骨有核細(xì)胞數(shù)亦顯著下降，說明動物輻射損傷造模成功。然而，在對小鼠喂食糖多酚A后，上述檢測指標(biāo)均有不同程度的改善。研究結(jié)果顯示，糖多酚A各劑量組均能提高免疫器官脾臟系數(shù)和胸腺系數(shù)，說明糖多酚A能很好地促進(jìn)免疫系統(tǒng)的恢復(fù)；同時(shí)，能不同程度地提高受照小鼠的外周血指標(biāo)、骨髓DNA含量、脾結(jié)節(jié)和股骨有核細(xì)胞數(shù)，表明糖多酚A在促進(jìn)免疫系統(tǒng)恢復(fù)的同時(shí)還能加速造血系統(tǒng)的恢復(fù)，從而起到輻射防護(hù)作用。筆者采用了文獻(xiàn)報(bào)道的評價(jià)方法，具有一定的可行性，故糖多酚A具有抗輻射作用。當(dāng)然，糖多酚A這種保護(hù)作用機(jī)制和藥物的構(gòu)效關(guān)系還有待更深入的研究。

利益沖突無

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Protective effect of sugar polyphenols A on radiation injury in mice

Liu Juan,Hong Ge,Ji Haiying,Yang Shu, Chen Long,Liu Tianjun
Institute of Biomedical Engineering,Chinese Academy of Medical Sciences&Peking Union Medical College,Tianjin 300192,China(Liu J,Hong G,Ji HY,Yang S,Chen L,Liu TJ);Drug Clinical Trial Institution,Tianjin Fourth Centre Hospital,Tianjin 300140,China(Yang S)

ObjectiveTo study the radiation protection effect of sugar polyphenols A obtained by structured modification using mouse model of radiation injury induced by137Cs γ-ray.MethodsTotal 42 male Kunming mice aged 4-6 weeks were randomly divided into six groups:negative control group(NCG),positive control group(PCG), irradiation control group(ICG)as well as three irradiation experimental groups.The radiation injury model was developed by once whole-body irradiation with 6.0 Gy137Cs γ-ray.The mice in three experimental groups were fed sugar polyphenols A respectively with doses of 0.05,0.10 and 0.20 g/kg,for 14 d before irradiation,and continuously fed with the drug for 7 d after the irradiation.After that the mice were sacrificed,and the organ index,hematological parameters,spleen colony number,bone marrow DNA content and nucleated cells in bone-marrow were tested to evaluate the effect of sugar polyphenols A.ResultsCompared with the ICG,the irradiation experimental groups with the sugar polyphenols A doses of 0.05,0.10,0.20 g/kg showed reductions in irradiation injuries of immune system and hematopoietic system,which makes the significant increases of the spleen indexes(Z=-2.364,-3.003 and -2.747,P＜0.05)and the number of endogenous spleen colony(Z=-2.458,-2.141 and-2.206,P＜0.05).In the groups with the doses of 0.05 and 0.2 g/kg,the number of white blood cells were significantly increased(Z=-2.652 and-2.139, P＜0.05).Besides,in the group with the dose of 0.2 g/kg,the level of red blood cells(Z=-2.364,P＜0.05),bone marrow DNA content(Z=-2.492,P＜0.05)and nucleated cells in bone-marrow(Z=-2.492,P＜0.05)were also increased compared with the ICG.ConclusionsSugar polyphenols A has the positive effects on the recovery of immune and hematopoietic function of mice through improving the organ index,endogenous spleen colony number,peripheral white blood cell number,bone marrow DNA content and nucleated cells in bone-marrow,which can reduce the injury induced by ionizing radiation.

Structural modification;Sugar polyphenols A;Ionizing radiation;Hematological parameters;Endogenous spleen colony;Bone marrow DNA

Liu Tianjun,Email:liutianjun@hotmail.com

2016-08-07）

劉天軍，Email:liutianjun@hotmail.com

10.3760/cma.j.issn.1673-4181.2016.06.004