膠原模擬多肽-PEG雜化水凝膠及用于兔骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的三維培養(yǎng)

張洋王靜潔任穎劉玲蓉

300192天津，中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院生物醫(yī)學(xué)工程研究所，天津市生物醫(yī)學(xué)材料重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室

·論著·

膠原模擬多肽-PEG雜化水凝膠及用于兔骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的三維培養(yǎng)

張洋王靜潔任穎劉玲蓉

300192天津，中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院生物醫(yī)學(xué)工程研究所，天津市生物醫(yī)學(xué)材料重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室

目的構(gòu)建一種模擬細(xì)胞外基質(zhì)的膠原模擬多肽-聚乙二醇（PEG）雜化水凝膠并應(yīng)用于兔骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞（rBMSCs）的三維（3D）培養(yǎng)。方法利用膠原模擬多肽末端的半胱氨酸與馬來(lái)酰亞胺修飾的多臂PEG偶聯(lián)形成雜化水凝膠，圓二色譜表征膠原模擬多肽的三螺旋結(jié)構(gòu)及其熱穩(wěn)定性，流變學(xué)檢測(cè)和掃描電鏡觀察研究雜化水凝膠的成膠過(guò)程、機(jī)械強(qiáng)度及水凝膠內(nèi)部結(jié)構(gòu)。將rBMSCs包埋于雜化水凝膠中進(jìn)行3D培養(yǎng)，檢測(cè)水凝膠的細(xì)胞相容性及其對(duì)rBMSCs分化的影響。結(jié)果膠原模擬多肽能自發(fā)形成天然膠原的三螺旋結(jié)構(gòu)，其熱變性溫度為49.4℃。膠原模擬多肽-PEG雜化水凝膠成膠迅速，內(nèi)部呈現(xiàn)多孔的網(wǎng)絡(luò)狀纖維結(jié)構(gòu)；雜化水凝膠3D培養(yǎng)rBMSCs 24 h后，絕大部分細(xì)胞保持存活狀態(tài)，基因表達(dá)分析結(jié)果顯示該水凝膠體系構(gòu)建的3D培養(yǎng)環(huán)境能影響rBMSCs的分化。結(jié)論膠原模擬多肽-PEG雜化水凝膠制備條件溫和，具有良好的機(jī)械強(qiáng)度和細(xì)胞相容性，有利于rBMSCs的軟骨分化。

膠原模擬多肽；水凝膠；兔骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞

Fund program:National Natural Science Foundation of China(31170917)

0 引言

細(xì)胞外基質(zhì)對(duì)組織細(xì)胞起支持、保護(hù)和營(yíng)養(yǎng)作用，對(duì)細(xì)胞的增殖、分化等生命活動(dòng)具有重要影響[1]。水凝膠能模擬天然細(xì)胞外基質(zhì)的結(jié)構(gòu)和理化特性，允許細(xì)胞生存的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)和代謝產(chǎn)物的滲透和擴(kuò)散，為細(xì)胞提供類似軟組織的三維（three-dimension，3D）微環(huán)境，因而成為研究和應(yīng)用廣泛的生物醫(yī)用材料[2]。合成的水凝膠——聚乙二醇（polyethylene glycol，PEG）及其衍生物水凝膠，具有良好的生物相容性、結(jié)構(gòu)和性能可控等特點(diǎn)，但存在生物活性差的缺點(diǎn)，故需要通過(guò)生物活性分子修飾以改善其降解性能、促細(xì)胞生長(zhǎng)和分化的生物活性[3]。

膠原是細(xì)胞外基質(zhì)的主要成分，其參與細(xì)胞的極化、分化、形態(tài)發(fā)生等行為和創(chuàng)傷愈合、血栓形成、免疫系統(tǒng)調(diào)節(jié)等過(guò)程，且可生物降解，是一種應(yīng)用廣泛的生物材料[4]。隨著多肽固相合成技術(shù)的發(fā)展和應(yīng)用，研究者根據(jù)膠原的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)設(shè)計(jì)了膠原模擬多肽（collagen mimetic peptides），這些短肽通常由單純Gly-Xaa-Yaa重復(fù)序列或Gly-Xaa-Yaa重復(fù)序列整合某些生物活性序列組成，可以形成膠原典型的三螺旋構(gòu)象[5]。近年來(lái)，基于膠原模擬多肽水凝膠體系的研究越來(lái)越多，Lee等[6]為了提高PEG光敏水凝膠的生物活性，通過(guò)接枝膠原模擬多肽促進(jìn)其3D培養(yǎng)的軟骨細(xì)胞分泌細(xì)胞外基質(zhì)、抑制軟骨細(xì)胞的脫分化。Kumar等[7]利用賴氨酸、天冬氨酸之間的鹽橋作用使含有黏性末端的膠原模擬多肽發(fā)生橫向、縱向交聯(lián)作用而形成多肽水凝膠，該水凝膠可激活血小板，加速止血而不引起強(qiáng)烈的炎癥反應(yīng)。

本研究設(shè)計(jì)合成了包含Gly-Xaa-Yaa重復(fù)序列和細(xì)胞黏附序列精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸（Arg-Gly-Asp，RGD）的膠原模擬多肽，通過(guò)膠原模擬多肽與多臂PEG偶聯(lián)構(gòu)建了一種新型膠原模擬多肽-PEG雜化水凝膠，同時(shí)具備膠原模擬多肽良好的生物活性和PEG的機(jī)械加工性能，從而為細(xì)胞生長(zhǎng)提供有利的微環(huán)境，將該水凝膠體系用于兔骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞（rabbit bone marrow mesenchymal stem cells, rBMSCs）的3D培養(yǎng)并評(píng)價(jià)其細(xì)胞相容性及對(duì)細(xì)胞分化的影響，為發(fā)展新型生物活性水凝膠體系提供現(xiàn)論基礎(chǔ)和實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 主要材料與儀器

膠原模擬多肽（GPO）8-CG-RGDS（序列為GPOGPOGPOGPOGPOGPOGPOGPOCGRGDS，純度＞90%）（吉爾生化（上海）有限公司，相對(duì)分子質(zhì)量為40ku的馬來(lái)酰亞胺修飾的4臂PEG（4臂PEG-MAL-40k）（北京鍵凱科技有限公司），日本大耳白兔骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞（筆者通過(guò)全骨髓貼壁法分離制得），DMEM高糖培養(yǎng)基（美國(guó)HyClone公司），磷酸鹽緩沖液（phosphate buffered saline，PBS）（北京索萊寶科技有限公司），胎牛血清、LIVE/DEAD活力/細(xì)胞毒性試劑盒（美國(guó)Invitrogen公司），24孔板用Millicell細(xì)胞培養(yǎng)小室（1μm耐高溫聚酯薄膜）（美國(guó)Millipore公司），E.Z.N.A.?HP總RNA提取試劑盒（美國(guó)Omega公司），GoScriptTM反轉(zhuǎn)錄試劑盒、GoTaq qPCR Master Mix（美國(guó)Promega公司）。

J-815圓二色譜儀（日本Jasco公司），MCR302高級(jí)旋轉(zhuǎn)流變儀（奧地利Anton Paar公司），SUPRA 55VP掃描電子顯微鏡（德國(guó)Carl Zeiss公司），DMIL倒置熒光顯微鏡（德國(guó)Leica公司），7500實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀（美國(guó)Applied Biosystems公司）。

1.2 方法

1.2.1 膠原模擬多肽的圓二色譜

用純水配制質(zhì)量濃度為0.3 mg/ml的膠原模擬多肽溶液，并于4℃平衡12 h以上，用圓二色譜儀測(cè)定膠原模擬多肽的圓二色譜，再將圓二色譜測(cè)試結(jié)果用如下公式換算為氨基酸殘基平均摩爾橢圓率（mean residual ellipticity,MRE）[θ]

式中：θ為樣品的橢圓率值（mdeg），m為樣品的摩爾質(zhì)量（g/mol），c為樣品的質(zhì)量濃度（mg/ml），l為石英比色皿的光程（cm），nr為樣品的氨基酸個(gè)數(shù)。

常溫圓二色譜：掃描范圍為190～260 nm，掃描速度100 nm/min，帶寬1 nm，每隔0.1 nm取1個(gè)點(diǎn)，橢圓率取3次掃描的平均值，并自動(dòng)去基線；先將純水注入石英比色杯，測(cè)基線；然后將膠原模擬多肽溶液注入石英比色杯，潤(rùn)洗1次后，檢測(cè)樣品。變溫圓二色譜：檢測(cè)波長(zhǎng)為225 nm，帶寬1 nm，起始溫度20℃，終止溫度80℃，升溫速率0.1℃/min，等待時(shí)間4 s，每隔0.2℃取1個(gè)點(diǎn)；將純水注入石英比色杯，測(cè)基線；將膠原模擬多肽溶液注入石英比色杯，檢測(cè)樣品。熱變性曲線用Adjacent-averaging法平滑后求一階導(dǎo)數(shù)，一階導(dǎo)數(shù)拐點(diǎn)對(duì)應(yīng)的溫度為熱變性溫度Tm。

1.2.2 膠原模擬多肽-PEG雜化水凝膠的流變學(xué)特征

用PBS分別配制質(zhì)量濃度為24 mg/ml的膠原模擬多肽溶液和96 mg/ml的4臂PEG-MAL-40k溶液，將兩者等體積混合，得6%膠原模擬多肽-PEG雜化水凝膠。在高級(jí)旋轉(zhuǎn)流變儀的樣品臺(tái)上原位制備膠原模擬多肽-PEG雜化水凝膠，并使用25 mm、2°錐角的椎板測(cè)量夾具依次進(jìn)行時(shí)間掃描（time sweep）、頻率掃描（frequency sweep）和振幅掃描（amplitude sweep）。

時(shí)間掃描：設(shè)置溫度為25℃，掃描頻率1 Hz，掃描振幅0.1%應(yīng)變，取等體積的膠原模擬多肽溶液和PEG溶液于樣品臺(tái)混合后，迅速降下椎板，觀察樣品儲(chǔ)能模量（G'）、損耗模量（G''）隨時(shí)間的變化。頻率掃描：時(shí)間掃描完成后，設(shè)置掃描頻率100～0.1 rad/s，掃描振幅0.1%應(yīng)變，觀察樣品G'、G''隨頻率的變化。振幅掃描：設(shè)置溫度為25℃，掃描頻率10 rad/s，掃描振幅0.01～100%應(yīng)變，觀察樣品G'、G''隨振幅的變化。

1.2.3 膠原模擬多肽-PEG雜化水凝膠的掃描電子顯微鏡觀察

用PBS分別配制質(zhì)量濃度為24 mg/ml的膠原模擬多肽溶液和96 mg/ml的4臂PEG-MAL-40k溶液，等體積混合形成水凝膠后，冷凍干燥，然后撕下一小塊貼在導(dǎo)電膠上，噴金后用掃描電子顯微鏡進(jìn)行觀察。

1.2.4 rBMSCs的3D培養(yǎng)

rBMSCs長(zhǎng)滿后用胰酶消化并離心，加入1 ml培養(yǎng)基重懸調(diào)細(xì)胞濃度約為4.3×106/ml；向放有多肽的1.5 ml離心管中加入適量細(xì)胞懸液，配制成質(zhì)量濃度為24 mg/ml的膠原模擬多肽溶液，記為A；向存有PEG-MAL-40k的1.5 ml離心管中加入適量PBS，配制成質(zhì)量濃度為96 mg/ml的4臂PEGMAL-40k溶液，記為B；各取90 μl A、B于Millicell細(xì)胞培養(yǎng)小室內(nèi)混合，靜置10～15 s等待水凝膠形成；將細(xì)胞培養(yǎng)小室轉(zhuǎn)移至24孔板，外側(cè)加800 μl培養(yǎng)基，設(shè)3個(gè)平行樣，另做3孔平板培養(yǎng)作為對(duì)照；最后將細(xì)胞置于37℃的CO2恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.2.5 膠原模擬多肽-PEG雜化水凝膠中的細(xì)胞活力分析和基因表達(dá)檢測(cè)

從-20℃冰箱取出LIVE/DEAD?細(xì)胞活力/毒性試劑盒，恢復(fù)至室溫；取5 ml PBS加入10 μl溴乙啡錠二聚體，混勻后得A；向A中加入2.5 μl鈣黃綠素-AM，混勻得LIVE/DEAD染色液（2 μmol/L鈣黃綠素-AM、4 μmol/L溴乙啡錠二聚體）；取3D培養(yǎng)1 d的rBMSCs，用PBS洗滌Millicell細(xì)胞培養(yǎng)小室外側(cè)3次，將細(xì)胞培養(yǎng)小室轉(zhuǎn)移至干凈的培養(yǎng)孔，外側(cè)加800 μl染色液，將24孔板置于37℃的CO2恒溫培養(yǎng)箱孵育40 min后，用倒置熒光顯微鏡觀察，實(shí)驗(yàn)操作應(yīng)盡可能避光。

rBMSCs在雜化水凝膠中包載2 d后，用PBS重懸膠，收集細(xì)胞并提取RNA，逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA后，用實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀分析檢測(cè)軟骨分化標(biāo)志基因COL2A1、ACAN、SOX9和肥大分化標(biāo)志基因COL1A2、COL10A1、MMP13的表達(dá)變化。（表1）

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS16.0統(tǒng)計(jì)軟件學(xué)處理數(shù)據(jù)，數(shù)據(jù)以均值±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示，組間均數(shù)比較采用獨(dú)立樣本的t檢驗(yàn)，以P＜0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果與討論

2.1 膠原模擬多肽的三螺旋結(jié)構(gòu)及其熱穩(wěn)定性

本研究設(shè)計(jì)合成的膠原模擬多肽包含膠原三螺旋重復(fù)序列（Gly-Xaa-Yaa）n和促細(xì)胞黏附序列RGD，同時(shí)多肽末端加入半胱氨酸。利用圓二色譜表征了設(shè)計(jì)合成的膠原模擬多肽的三螺旋結(jié)構(gòu)及其熱穩(wěn)定性，天然膠原由3條呈聚L-脯氨酸Ⅱ型左手螺旋構(gòu)象的α鏈纏繞形成右手超螺旋，在圓二色譜上表現(xiàn)為196.5 nm的負(fù)峰和220 nm處的正峰[8]。圖1A為膠原模擬多肽的常溫圓二色譜，其最大負(fù)吸收峰位于198.1 nm，最大正吸收峰位于225.5 nm，色譜峰呈倒“S”形，說(shuō)明膠原模擬多肽在溶液中能形成類似于天然膠原的三螺旋構(gòu)象。

表1 相關(guān)基因引物序列

天然膠原的三螺旋結(jié)構(gòu)在高溫條件下會(huì)發(fā)生解螺旋，即熱變性反應(yīng)。膠原的熱穩(wěn)定性可用變性溫度Tm表示，當(dāng)溫度高于Tm時(shí)，膠原的三螺旋構(gòu)象去折疊，解旋為α單鏈。膠原模擬多肽和天然膠原有類似的熱變性反應(yīng)，其熱穩(wěn)定性常用圓二色譜225 nm處橢圓率隨溫度的變化來(lái)評(píng)價(jià)。膠原模擬多肽的熱變性曲線中（圖1B），橢圓率在20～35℃變化不大，35～65℃急劇下降，65～80℃又趨于平穩(wěn)，三螺旋結(jié)構(gòu)的解旋主要發(fā)生在35～65℃。對(duì)熱變性曲線平滑后求導(dǎo)（圖1C），MRE一階導(dǎo)數(shù)的拐點(diǎn)位于49.4℃附近，即膠原模擬多肽的Tm為49.4℃。本研究室曾測(cè)定了天然膠原在體積分?jǐn)?shù)為0.3%的丙二酸溶液中的熱變性曲線，當(dāng)升溫速率為0.5℃/min時(shí)，膠原的Tm為43℃。另外，天然膠原的熱變性是不可逆的，而膠原模擬多肽的熱變性是可逆的，可通過(guò)低溫退火重新組裝為三螺旋結(jié)構(gòu)[9]。

2.2 膠原模擬多肽-PEG雜化水凝膠的流變學(xué)和結(jié)構(gòu)特征

本研究制備的膠原模擬多肽-PEG雜化水凝膠是利用膠原模擬多肽末端的半胱氨酸與4臂PEGMAL每個(gè)高分子臂末端的馬來(lái)酰亞胺官能團(tuán)發(fā)生偶聯(lián)反應(yīng)，進(jìn)而通過(guò)膠原模擬多肽的三螺旋結(jié)構(gòu)自組裝形成物理交聯(lián)的水凝膠網(wǎng)絡(luò)，制備條件溫和，適合應(yīng)用于細(xì)胞培養(yǎng)。水凝膠的力學(xué)性質(zhì)對(duì)包載細(xì)胞的表型、細(xì)胞吸附和基因表達(dá)有重要影響，是評(píng)價(jià)水凝膠是否適合特定生物應(yīng)用的重要指標(biāo)[10]。

流變學(xué)檢測(cè)是研究水凝膠物理性質(zhì)的基本方法。流變學(xué)用G'和G''來(lái)描述材料的黏彈性，當(dāng)G'＜G''時(shí)，材料更多地表現(xiàn)為流體特性，可視為流體；G'＞G''時(shí)，材料更多地表現(xiàn)為固體特性，可視為水凝膠[11]。采用時(shí)間掃描、頻率掃描和振幅掃描檢測(cè)研究了膠原模擬多肽-PEG雜化水凝膠的流變學(xué)特性。時(shí)間掃描用于研究水凝膠的形成過(guò)程，結(jié)果如圖2A所示，開(kāi)始階段G'＜G''，表現(xiàn)為流體；在成膠過(guò)程中，G'不斷增大，直到G'＞G''，表現(xiàn)為固體（凝膠），G'繼續(xù)增大至平臺(tái)期，凝膠化過(guò)程完成，膠原模擬多肽-PEG雜化水凝膠形成過(guò)程約需要30 min。頻率掃描用于評(píng)價(jià)材料在高剪切力和低剪切力條件下材料的機(jī)械特性（圖2B）。振幅掃描可以確定測(cè)試樣品的線性黏彈區(qū)間，由圖2C可知，膠原模擬多肽-PEG雜化水凝膠的線性黏彈區(qū)在0.01%～10%附近。

圖1 膠原模擬多肽的圓二色譜圖

圖3 膠原模擬多肽-聚乙二醇雜化水凝膠的掃描電鏡圖

圖5 膠原模擬多肽-聚乙二醇雜化水凝膠培養(yǎng)48 h對(duì)免骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞分化的影響

為了解膠原模擬多肽-PEG雜化水凝膠的形貌結(jié)構(gòu)，將水凝膠凍干后噴金進(jìn)行了掃描電鏡觀察，如圖3所示，水凝膠呈現(xiàn)多孔的網(wǎng)絡(luò)狀纖維結(jié)構(gòu)。2.3膠原模擬多肽-PEG雜化水凝膠中的細(xì)胞活力分析

膠原模擬多肽-PEG雜化水凝膠的細(xì)胞相容性用LIVE/DEAD?活力/細(xì)胞毒性試劑盒檢測(cè)。死細(xì)胞在綠色激發(fā)光下表現(xiàn)為紅色熒光，活細(xì)胞在藍(lán)色激發(fā)光下表現(xiàn)為綠色熒光。rBMSCs在水凝膠中培養(yǎng)24 h后用試劑盒染色，由圖4可看出，藍(lán)光激發(fā)下，呈現(xiàn)大量綠色熒光；綠光激發(fā)下，存在少量紅色熒光，說(shuō)明rBMSCs絕大部分保持存活狀態(tài)，膠原模擬多肽-PEG雜化水凝膠具有良好的細(xì)胞相容性。2.4膠原模擬多肽-PEG雜化水凝膠中3D培養(yǎng)對(duì)rBMSCs基因表達(dá)的影響

與傳統(tǒng)的二維（two-dimension，2D）培養(yǎng)相比，3D培養(yǎng)能更好地模擬細(xì)胞在體內(nèi)的狀態(tài)，促進(jìn)細(xì)胞間、細(xì)胞與細(xì)胞外基質(zhì)間的相互作用，影響細(xì)胞的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)，進(jìn)而影響細(xì)胞的形態(tài)功能[12-13]。膠原模擬多肽-PEG雜化水凝膠包埋rBMSCs培養(yǎng)48 h后，考察了水凝膠體系構(gòu)建的3D培養(yǎng)環(huán)境對(duì)rBMSCs COL2A1、ACAN、SOX9、COL1A2、COL10A1和MMP13 6種基因表達(dá)的影響，相對(duì)于2D培養(yǎng)，3D培養(yǎng)的rBMSCs的COL2A1、ACAN、COL10A1和MMP13表達(dá)增加，SOX9和COL1A2表達(dá)降低，但只有COL1A2表達(dá)差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。（圖5）

骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞（bone marrow mesenchymal stem cells，BMSCs）可在體內(nèi)或體外特定的誘導(dǎo)條件下分化為脂肪、骨、軟骨等多種組織細(xì)胞[14-15]，因其來(lái)源廣泛、易于分離培養(yǎng)且具有較強(qiáng)的分化潛能和可自體移植等優(yōu)點(diǎn)，被認(rèn)為是用于病缺損組織再生修復(fù)治療較理想的細(xì)胞來(lái)源。BMSCs誘導(dǎo)分化來(lái)源的軟骨細(xì)胞存在去分化的肥大表型趨勢(shì)，終末分化的軟骨細(xì)胞也存在這種分化趨勢(shì)[16]。COL2A1、ACAN和SOX9為軟骨分化標(biāo)志基因[17-18]，而COL1A2、COL10A1和MMP13[18-19]為肥大標(biāo)志基因。研究結(jié)果顯示，相對(duì)于2D培養(yǎng)，水凝膠體系構(gòu)建的3D培養(yǎng)環(huán)境中rBMSCs的COL1A2表達(dá)顯著降低，初步提示其對(duì)rBMSCs的分化有影響，更有利于軟骨分化。然而，膠原模擬多肽-PEG雜化水凝膠的強(qiáng)度不足，在培養(yǎng)基中只能維持體系的完整性2～3 d，導(dǎo)致培養(yǎng)時(shí)間尚不足以維持rBMSCs的誘導(dǎo)分化，后續(xù)將考慮改善水凝膠體系構(gòu)建的3D培養(yǎng)體系，尤其是水凝膠的強(qiáng)度。

3 結(jié)論

本研究利用膠原模擬多肽和多臂PEG構(gòu)建了一種模擬天然細(xì)胞外基質(zhì)的水凝膠體系，制備方法具有反應(yīng)快速和條件溫和的特點(diǎn)，制得的水凝膠具有良好的機(jī)械強(qiáng)度和多孔網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)，適合應(yīng)用于細(xì)胞的3D培養(yǎng)。膠原模擬多肽-PEG雜化水凝膠包埋rBMSCs 24 h后，細(xì)胞大部分保持存活狀態(tài)，表明該水凝膠具有良好的細(xì)胞相容性；與2D培養(yǎng)相比，水凝膠體系構(gòu)建的3D培養(yǎng)環(huán)境對(duì)rBMSCs的分化有影響，更有利于軟骨分化。

利益沖突無(wú)

（圖2、4見(jiàn)封三）

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Collagen mimetic peptide-PEG hybrid hydrogel for 3D culture of rabbit bone marrow mesenchymal stem cells

Zhang Yang,Wang Jingjie,Ren Ying,Liu Lingrong
Institute of Biomedical Engineering,Chinese Academy of Medical Sciences&Peking Union Medical College,Tianjin 300192,China;Key Laboratory of Biomedical Materials of Tianjin,Tianjin 300192,China

ObjectiveTo construct a extracellular matrix-like collagen mimetic peptide-PEG hybrid hydrogel and to study the usage of this hydrogel in 3D culture of rabbit bone marrow mesenchymal stem cells (rBMSCs).MethodsThe hybrid hydrogel was synthesised by conjugating the cysteine at the end of the collagen mimetic peptide with the maleimine-modified multi-arm PEG.The circular dichroism spectra were used to characterize the triple helix structure and thermal stability of the collagen mimetic peptides.The rheology test and scanning electron microscopy were used to study the gelation process,mechanical strength and internal structure of the hydrogel.The rBMSCs were embedded in the hybrid hydrogel for 3D culture.The cell compatibility of the hydrogel and its effect on differentiation of the cells was studied.ResultsCollagen mimetic peptides could promote spontaneous formation of triple helix structure in the natural collagen,and the thermal transition temperature was 49.4℃.The formation process of the collagen mimetic peptides-PEG hybrid hydrogel was rapid,in which the porous network-like fibrous structure was formed.After the encapsulation of rBMSCs within the hydrogel for 24 h,most of the cells remained viable.Gene expression analysis showed that the hybrid hydrogel could affect the differentiation of rBMSCs.ConclusionsThe collagen mimetic peptide-PEG hybrid hydrogel possesses the characteristics of mild preparation condition,good mechanical strength and good cell compatibility,and is favorable to chondrocyte differentiation of rBMSCs.

Collagen mimetic peptide;Hydrogel;Rabbit bone marrow mesenchymal stem cells

Liu Lingrong,Email:liu_lingrong@126.com

國(guó)家自然科學(xué)基金面上項(xiàng)目（31170917）

2016-10-12）

劉玲蓉，Email:liu_lingrong@126.com

10．3760/cma．j．issn．1673-4181．2016．06．001