深海細菌Psychrobacter submarinus 1A01998的次級代謝產(chǎn)物研究

馬小妮，苗子，程軒軒，楊全

(1 .廣東藥學(xué)院 中藥學(xué)院，廣東 廣州 510006； 2.國家海洋局第三海洋研究所 海洋生物資源遺傳重點實驗室，福建 廈門 361005)

?

深海細菌Psychrobactersubmarinus1A01998的次級代謝產(chǎn)物研究

馬小妮1，2，苗子1，2，程軒軒1，楊全1

(1 .廣東藥學(xué)院 中藥學(xué)院，廣東 廣州 510006； 2.國家海洋局第三海洋研究所 海洋生物資源遺傳重點實驗室，福建 廈門 361005)

摘要:目的 對來自深海沉積物中的海洋細菌Psychrobacter submarinus 1A01998的次級代謝產(chǎn)物進行研究。方法 采用大孔吸附樹脂、硅膠、ODS和Sephadex LH-20凝膠等柱層析色譜分離方法，對海洋細菌Psychrobacter submarinus 1A01998進行次級代謝產(chǎn)物的分離純化，根據(jù)1H NMR、13C NMR和MS 等波譜數(shù)據(jù)分析并結(jié)合相關(guān)文獻對化學(xué)結(jié)構(gòu)進行鑒定。結(jié)果 從深海細菌Psychrobacter submarinus 1A01998的發(fā)酵粗提物中分離得到4個化合物，分別鑒定為環(huán)(L-脯氨酸-L-酪氨酸)(1)、環(huán)(D-脯氨酸-L-酪氨酸)(2)、3-吲哚甲醛(3)、2′-O-甲氧基尿嘧啶核苷(4)。結(jié)論 化合物1～4均為首次從該屬中分離得到，其中化合物1、2為環(huán)二肽類化合物。

關(guān)鍵詞:海洋細菌； Psychrobacter submarinus 1A01998； 次級代謝產(chǎn)物

自1960年以來，從海洋生物及微生物中已發(fā)現(xiàn)了20 000多種化合物[1]，它們大多具有新穎的結(jié)構(gòu)和較好的生物活性，例如一些從海洋微生物中得到的次級代謝產(chǎn)物對目前的超級細菌(耐甲氧西林金黃色葡萄球菌，耐萬古霉素腸球菌)具有很強的抑制活性[2]，新近發(fā)現(xiàn)的apratoxin H、decaturin E和decaturin F等均具有很強的抗腫瘤活性[3]。據(jù)統(tǒng)計，截止至2010年，約有45個來自海洋的天然產(chǎn)物已經(jīng)或者正在進行Ⅰ～Ⅲ期臨床研究，其中80%以上均為抗腫瘤藥物[4]。據(jù)文獻[3]報道，2013年全世界從海洋(包括紅樹林)中發(fā)現(xiàn)的新化合物來自海洋放線菌的有116個，來自海洋真菌的有302個，而來自海洋細菌的僅有53個。由此可見，目前對海洋微生物研究的對象主要還是海洋真菌和海洋放線菌，對細菌的研究相對較少。因此，對海洋細菌，尤其是深海細菌進行深入研究具有廣闊的前景。本課題組前期從西太平洋海底沉積物中分離得到1株嗜冷桿菌(Psychrobactersubmarinus1A01998)，其粗提物表現(xiàn)出較好的抗腫瘤活性，本文對其次級代謝產(chǎn)物進行系統(tǒng)的研究，擬從中發(fā)現(xiàn)抗腫瘤活性成分。

1儀器與材料

1.1菌株

深海細菌菌株P(guān)sychrobactersubmarinus1A01998于2006年12月分離自西太 平洋海底沉積物(-1 914 m;E 142°30′,S 8°00′)，菌落呈黃色，表面濕潤，與模式菌株P(guān)sychrobactersubmarinusKMM 225(T) AJ309940相似性為99.5%，鑒定為Psychrobactersubmarinus1A01998，該菌株保藏于國家海洋微生物菌株保藏中心(保藏號：MCCC1A01998)。

1.2細胞

H1299(人肺癌細胞)購自中國科學(xué)院上海生化細胞所。

1.3培養(yǎng)基

2216E培養(yǎng)基：蛋白胨0.5%，酵母粉0.1%，陳海水，pH 7.4～7.6(培養(yǎng)基121 ℃高壓滅菌30 min，待冷卻至30 ℃左右使用)。

1.4儀器與材料

Bruker AV500核磁共振波譜儀(美國Bruker公司)；Bruker AV400核磁共振波譜儀(美國Bruker公司)；Xevo G2 Q-Tof四極桿飛行時間質(zhì)譜儀(美國Waters公司)；Eyela旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(日本東京理化公司)；IS-RDS3C恒溫振蕩器(美國精騏有限公司)；分析型、制備型薄層色譜硅膠板和柱色譜硅膠(煙臺江友硅膠有限公司)；Sephadex LH-20凝膠(40～70 μm，Amersham Pharmacia公司)；其余試劑均為市售分析純。

2菌株發(fā)酵和次級代謝產(chǎn)物分離

2.1發(fā)酵

將適量的培養(yǎng)皿上的深海細菌Psychrobactersubmarinus1A01998接入到300 mL的液體培養(yǎng)基中(置于1 L錐形培養(yǎng)瓶)，28 ℃、180 r/min培養(yǎng)2 d，將一級種子培養(yǎng)液以5%(體積分數(shù)，下同)的接種量接種到1 L的液體培養(yǎng)基(置于5 L錐形培養(yǎng)瓶)中，28 ℃、180 r/min培養(yǎng)2 d，將二級種子培養(yǎng)液以5%的接種量接種到40 L液體發(fā)酵培養(yǎng)基(置于50 L發(fā)酵罐)中，接種量為1%(體積分數(shù))，設(shè)置28 ℃、180 r/min連續(xù)培養(yǎng)發(fā)酵5 d，最終得到發(fā)酵液35 L。

2.2次級代謝產(chǎn)物分離

發(fā)酵液離心后，濾液用大孔吸附樹脂梯度洗脫(乙醇-水，體積比10∶90→95∶5)，洗脫液減壓蒸干；菌絲體用水混懸,混懸液經(jīng)1 200～1 300 kPa均質(zhì)，16 000 r/min離心，上清液用等體積乙酸乙酯萃取3次，萃取液減壓濃縮蒸干。兩部分粗提物經(jīng)TLC檢測后合并得總浸膏6 g。浸膏經(jīng)過ODS中壓硅膠柱(甲醇-水，體積比5∶95→100∶0)，得到8個流分(Fr.1～ Fr.8)，其中Fr.5依次經(jīng)過Sephadex LH-20(甲醇)、正相硅膠柱層析反復(fù)得到化合物4(1.2 mg)，F(xiàn)r.7依次經(jīng)過Sephadex LH-20(甲醇)、正相硅膠柱層析純化得到化合物1(17.0 mg)和2(47.0 mg)，F(xiàn)r.8依次經(jīng)過Sephadex LH-20(甲醇)、正相硅膠柱層析純化得到化合物3(1.7 mg)。

3結(jié)構(gòu)鑒定

化合物1為白色粉末(甲醇)。ESI-MSm/z: 259.108 2 [M-H]-(理論值為259.108 8)，分子式為C14H15N2O3。1H NMR (MeOD,400 MHz)δ: 7.05 (2H,d,J=8.4 Hz,H-5′,H-9′),6.71 (2H,d,J=8.5 Hz,H-6′,H-8′),4.35 (1H,m,H-2′),4.05 (1H,m,H-2),3.56 (1H,m,H-5),3.36 (1H,m,H-5),3.06 (2H,m,H-3′),2.10 (1H,m,H-3a),1.80 (2H,m,H-4),1.21 (1H,m,H-3b)。13C NMR (MeOD,125 MHz)δ: 170. 8 (C,C-1),166.9 (C,C-1′),157.6 (C,C-7′),132.1 (CH,C-5′,C-9′),127.6 (C,C-4′),116.2 (CH,C-6′,C-8′),60.0 (CH,C-2),57.9 (CH,C-2′),45.9 (CH2,C-5),37.6 (CH2,C-3′),29.4 (CH2,C-3),22.7 (CH2,C-4)。以上數(shù)據(jù)與文獻[5-7]報道一致，故確定化合物1為環(huán)(L-脯氨酸-L-酪氨酸)[cylco(L-Pro-L-Tyr)]。

化合物2為白色粉末(甲醇)。ESI-MSm/z: 259.108 2[M-H]-(理論值為259.108 8)，分子式為C14H15N2O3。1H NMR (500 MHz,MeOD)δ: 6.98 (2H,d,J=8.5 Hz,H-5′,H-9′),6.73 (2H,d,J=8.4 Hz,H-6′,H-8′),4.15 (2H,t,J=8.9 Hz,4.4 Hz,H-2),3.52 (1H,m,H-2′),3.31 (1H,m,H-5),3.10 (1H,dd,J=13.9 Hz,4.5 Hz,H-3b′),2.88 (1H,dd,J=13.9 Hz,4.5 Hz,H-3a′),2.63 (1H,m,H-5),2.05 (1H,m,H-4),1.89 (1H,m,H-4),1.64 (2H,m,H-3a,H-3b)。13C NMR (MeOD,125 MHz)δ: 171.5 (C,C-1),167. 7 (C,C-1′),158.3 (C,C-7′),132.4 (CH,C-5′,C-9′),127.1 (C,C-4′),116.5 (CH,C-6′,C-8′),60.0 (CH,C-2),59.3 (CH,C-2′),46.2 (CH2,C-5),40.3 (CH2,C-3′),29.9 (CH2,C-3),22.6 (CH2,C-4)。以上數(shù)據(jù)與文獻[5]報道一致，故確定化合物2為環(huán)(D-脯氨酸-L-酪氨酸)[cylco(D-Pro-L-Tyr)]。

化合物3為淡黃色針晶(甲醇)。ESI-MSm/z: 144.044 5[M-H]-(理論值為144.044 5)，分子式為C9H6NO；146.058 5[M+H]+(理論值為144.060 0)，分子式為C9H8NO。1H NMR (500 MHz,MeOD)δ: 9.89 (1H,s,CHO),8.16 (1H,d,J=7.5 Hz,H-4),8.10 (1H,s,H-2),7.48 (1H,d,J=7.9 Hz,H-7),7.28 (1H,t,H-6,J=15.0 Hz,7.25 Hz),7.24 (1H,t,H-5,J=15.0 Hz,7.5 Hz)。13C NMR (125 MHz,MeOD)δ: 187.6 (CH,CHO),139.8 (CH,C-2),125.2 (CH,C-5),123.8 (CH,C-6),122.5 (CH,C-4),113.3 (CH,C-7)。以上數(shù)據(jù)與文獻[8-9]報道一致，故確定化合物3為3-吲哚甲醛(1H-indole-3-carboxaldehyde)。

化合物4為白色粉末(甲醇)。ESI-MSm/z: 257.076 9[M-H]-(理論值為257.077 9)，分子式為C10H13N2O6。1H-NMR (400 MHz,MeOD)δ: 8.10 (1H,d,J=8.1 Hz,H-6),5.95 (1H,d,J=3.6 Hz,H-1′),5.7 (1H,d,J=8.1 Hz,H-5),4.25 (1H,m,H-3′),3.98 (1H,m,H-4′),3.86 (2H,m,H-5′),3.75 (1H,dd,J=12.0 Hz,4.0 Hz,H-2′),3.53 (3H,s,-OCH3)。13C-NMR (125 MHz,MeOD)δ: 166.4 (C,C-4),152.3 (C,C-2),142.6 (CH,C-6),102.7 (CH,C-5),88.9 (CH,C-1′),86.3 (CH,C-4′),85.2 (CH,C-2′),69.9 (CH,C-3′),61.8 (CH2,C-5′),58.9 (CH3,2′-OCH3)。以上波譜數(shù)據(jù)與文獻[10-11]報道一致，故確定化合物4為2′-O-甲基尿嘧啶核苷(2′-O-methyluridine)。

以上4個化合物的結(jié)構(gòu)式見圖1。

環(huán)(L-脯氨酸-L-酪氨酸)cylco(L-Pro-L-Tyr)環(huán)(D-脯氨酸-L-酪氨酸)cylco(D-Pro-L-Tyr)3-吲哚甲醛(1H-indole-3-carboxaldehyde)2'-O-甲基尿嘧啶核苷(2'-O-methyluridine)

圖1深海細菌Psychrobactersubmarinus1A01998中分離得到的4個次級代謝產(chǎn)物

Figure 14 secondary metabolites isolated fromPsychrobactersubmarinus1A01998

4體外細胞毒活性測試結(jié)果

人肺癌細胞H1299以每孔(200 μL)2～5×103個細胞接種到96孔板上，以不含細胞的空白培養(yǎng)液作為對照。37 ℃、體積分數(shù)5%CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，分別加入1、5、10、20 μmol/L的化合物繼續(xù)培養(yǎng) 72 h。每孔加5 mg/mL MTT 10 μL，37 ℃避光反應(yīng)3 h。小心吸去上清液后，每孔加入DMSO 150 μL，振蕩10 min，使結(jié)晶物充分溶解。用酶標儀測定570 nm波長下各孔的吸收值。結(jié)果顯示，在最高濃度20 μmol/L下，化合物1～4對人肺癌細胞H1299并未表現(xiàn)出生長抑制活性。

5討論

據(jù)文獻報道，嗜冷桿菌屬的次級代謝產(chǎn)物主要含有膽汁酸衍生物和環(huán)二肽化合物[12-13]。本研究從海洋來源細菌Psychrobactersubmarinus1A01998中分離得到4個化合物，其中化合物1、2為該菌的主要次級代謝產(chǎn)物。這2個化合物此前在海洋來源的放線菌(Actinomadurasp. 01119[7]、Streptomycessp. 3275[5])和真菌(AspergillusaculeatusCGD12[14])中分離得到，且化合物1對金黃色葡萄球菌顯示一定的抑制效果(MIC為32 mg/L)[14]。化合物3此前主要在細菌(StreptomycesaxinellaeSCSIO02208[15]和Pseudomonassp. WP168[16])中分離得到，有報道[17]在真菌中也存在?；衔?～4均為首次從嗜冷桿菌屬中分離得到。

致謝：深海細菌Psychrobactersubmarinus1A01998由國家海洋局第三海洋研究所湯熙祥博士鑒定；另外，國家海洋局第三海洋研究所的夏金梅博士在MS測試期間給予了很大的幫助，在此致以誠摯的感謝。

參考文獻:

[1] HU Guping,YUAN Jie,SUN Li,et al. Statistical research on marine natural products based on data obtained between 1985 and 2008[J]. Mar Drugs,2011,9(12):514-525.

[2] RAHMAN H,AUSTIN B,MITCHELL W J,et al. Novel anti-infective compounds from marine bacteria[J]. Mar Drugs,2010,8(3):498-518.

[3] BLUNT J W,COPP B R,KEYZERS R A,et al. Marine natural products[J]. Nat Prod Rep,2015,32(2):116-211.

[4] 史清文,李力更,霍長虹,等.天然藥物化學(xué)研究與新藥開發(fā)[J].中草藥,2010,41(10):1583-1589.

[5] 林己,林秀,艾文,等.深海放線菌Actinomadurasp. 01119的代謝產(chǎn)物研究[J].天然產(chǎn)物研究與開發(fā),2014,26(7):1026-1029.

[6] 熊江,周俊,戴好富,等.多蕊商陸的化學(xué)成分[J].云南植物研究,2002,24(3):401-405.

[7] 趙文英,朱天驕,古靜燕,等.海洋來源放線菌3275化學(xué)成分及抗腫瘤活性研究[J].天然產(chǎn)物研究與開發(fā),2006,18(3):405-407.

[8] 李文林,毛士龍,易楊華,等.豐頭皮海綿化學(xué)成分研究[J].中國海洋藥物,2000(3):1-4.

[9] 王業(yè)玲,李占林,劉濤,等.石見穿化學(xué)成分的分離與鑒定[J].沈陽藥科大學(xué)學(xué)報,2009,26(2):110-111.

[10] LI Guoqiang,DENG Zhiwei,LI Jun,et al. Chemical constituents from starfishAsteriasrollestoni[J]. J Chin Pharm Sci,2004,13(2):81-86.

[11] 杜文鵬,徐彭,劉波,等.毛竹筍化學(xué)成分研究[J].中草藥,2015,46(3):334-338.

[12] LI Huayue,LEE B C,KIM T S,et al. Bioactive cyclic dipeptides from a marine sponge-associated bacteriumPsychrobactersp[J].Biomol Ther,2008,16(4):356-363.

[13] LI Huayue,SHINDE P B,LEE H J,et al. Bile acid derivatives from a sponge-associated bacteriumPsychrobactersp[J]. Arch Pharmacal Res,2009,32(6):857-862.

[14] 李英新,焦偉華,周興春,等.紅樹共附生棘孢曲霉CGD12的次級代謝產(chǎn)物及其抑菌活性[J].中國實驗方劑學(xué)雜志,2013,19(19):71-75.

[15] AI Wen,LIN Xiuping,TU Zhengchao,et al. Axinelline A,a new COX-2 inhibitor fromStreptomycesaxinellaeSCSIO02208[J].Nat Prod Rep,2014,28(16):1219-1224.

[16] ZENG Xiang,XIAO Xiang,LI Dehai,et al. Isolation,identification and screening of microorganisms for cytotoxic activities from deep sea sediments at different pacific stations[J].World J Microbiol Biotechnol,2010,26(12):2141-2150.

[17] CHEN Jintong,SU H J,HUANG J W. Isolation and identification of secondary metabolites ofClitocybenudaresponsible for inhibition of zoospore germination ofPhytophthoracapsici[J].J Agric Food Chem,2012,60(30):7341-7344.

(責(zé)任編輯：陳翔)

Study on the secondary metabolites from the marine bacteriumPsychrobactersubmarinus1A01998

MA Xiaoni1，2,MIAO Zi1,2,CHENG Xuanxuan1,YANG Quan1

(1.SchoolofTraditionalChineseMedicine,GuangdongPharmaceuticalUniversity,Guangzhou510006,China; 2.KeyLaboratoryofMarineBiogeneticResources,ThirdInstituteofOceanography,StateOceanicAdministration,Xiamen361005,China)

Abstract:Objective To study the secondary metabolites of Psychrobacter submarinus 1A01998,a deep-sea derived bacterium isolated from Pacific Ocean sediments. Methods Secondary metabolites were isolated and purified by column chromatography over macroporous resin,silica gel,ODS and Sephadex LH-20. The structures of secondary metabolites were identified by1H NMR,13C NMR,MS and reference data. Results Four secondary metabolites were obtained and identified as cylco (L-Pro-L-Tyr) (1),cylco(D-Pro-L-Tyr) (2), 1H-indole-3-carboxaldehyde (3), and 2′-O-methyluridine (4). Conclusion Compounds 1-4 were isolated from genus of Psychrobacter for the first time,and compounds 1 and 2 were cyclic dipeptides．

Key words:marine bacterium; Psychrobacter submarinus 1A01998; secondary metabolites

DOI:10.16809/j.cnki.1006-8783.2015110901

中圖分類號：R284.2

文獻標志碼：A

文章編號:1006-8783(2016)01-0025-04

作者簡介：馬小妮(1990—)，女，2013級碩士研究生，Email:maxnym@163.com；通信作者：楊全(1972—)，男，博士，教授，主要從事中藥資源方面研究，Email:yangquan7208@vip.163.com。

基金項目：國家海洋局第三海洋研究所基本科研業(yè)務(wù)費專項資金資助項目(2015028)；海洋經(jīng)濟創(chuàng)新發(fā)展區(qū)域示范專項經(jīng)費資助項目(GD2012-D01-001)

收稿日期：2015-11-09

網(wǎng)絡(luò)出版時間：2016-01-18 9:43網(wǎng)絡(luò)出版地址：http://www.cnki.net/kcms/detail/44.1413.R.20160118.0943.002.html