基于受體配體-HPLC-MS聯(lián)用技術篩選五味子鎮(zhèn)靜催眠成分方法學的研究

王有娣，楊圓圓，李佳虹，高思遠，楊晨，臧林泉

(廣東藥學院　1.中藥學院； 2.藥科學院，廣東 廣州 510006)

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天然藥物化學

基于受體配體-HPLC-MS聯(lián)用技術篩選五味子鎮(zhèn)靜催眠成分方法學的研究

王有娣1，楊圓圓2，李佳虹1，高思遠2，楊晨1，臧林泉2

(廣東藥學院1.中藥學院； 2.藥科學院，廣東 廣州 510006)

摘要:目的 建立基于受體配體結(jié)合競爭試驗和HPLC-MS分析技術聯(lián)用初步確認五味子鎮(zhèn)靜催眠成分的方法學，為快速高效地分析五味子鎮(zhèn)靜催眠活性有效成分并確認作用靶標奠定方法學基礎，也為簡便迅速地研究中藥中有效物質(zhì)基礎和作用機理提供新的研究思路和方法。方法 運用受體配體結(jié)合原理，先制備大鼠腦組織中包含GABA(γ-氨基丁酸)受體的蛋白質(zhì)提取物，構建供藥物與GABA受體結(jié)合的體外模型，采用已知具有通過結(jié)合GABA受體發(fā)揮鎮(zhèn)靜催眠作用的地西泮，與五味子競爭性結(jié)合同一受體成分GABA的方法，用地西泮競爭置換出結(jié)合GABA受體的五味子中單體成分，通過HPLC-MS分析表征，鑒定結(jié)合GABA受體的五味子成分，再通過檢索文獻確認該成分是否具有鎮(zhèn)靜催眠活性的作用。結(jié)果 利用受體配體結(jié)合技術和HPLC-MS聯(lián)用技術成功建立了快速篩選單味中藥中結(jié)合已知藥靶成分的方法。利用該方法研究五味子中鎮(zhèn)靜催眠活性有效成分，通過模型藥地西泮與五味子提取液競爭結(jié)合腦組織中的GABA受體，結(jié)合HPLC-MS檢測分析結(jié)果，初步篩選出五味子中結(jié)合GABA受體的成分可能為五味子甲素(分子式：C24H32O6，相對分子質(zhì)量：416.51)，對比文獻結(jié)果提示五味子甲素為五味子產(chǎn)生鎮(zhèn)靜催眠作用的有效成分。結(jié)論 初步建立了基于受體配體結(jié)合-HPLC-MS聯(lián)用技術篩選單味/復方中藥中有效成分的方法學，同時利用該方法初步分析出了五味子中結(jié)合GABA受體的成分為五味子甲素。

關鍵詞:受體配體結(jié)合； HPLC-MS； 五味子； 有效成分； 方法學

中藥成分復雜，作用機制不明確，提取工藝繁瑣等問題限制了中藥的發(fā)展[1]，快速篩選和發(fā)現(xiàn)中藥有效物質(zhì)是創(chuàng)制現(xiàn)代中藥的源頭工作，同時也是中藥現(xiàn)代化研究的重要任務。篩選和發(fā)現(xiàn)中藥有效物質(zhì)有助于研發(fā)創(chuàng)新中藥、詮釋中醫(yī)藥理論科學內(nèi)涵、提升中成藥質(zhì)量標準以及中藥制藥技術升級換代，為中藥二次開發(fā)提供依據(jù)[2]，同時也是創(chuàng)新藥物研究的重要源泉[3]。如何從宏觀的中醫(yī)理論進入分子水平階段，從分子水平去考察和解釋中藥的作用機制[4]，是中醫(yī)中藥的重要突破口。

五味子為木蘭科植物五味子Schisandrachinensis(Turcz.) Baill.或華中五味子SchisandrasphenantheraRehd. et Wils.的干燥成熟果實[5]。前者習慣稱為“北五味子”，后者習慣稱為“南五味子”?！氨蔽逦蹲印蹦壳爸饕糜谥委熒窠?jīng)衰弱、失眠等癥[6]。對五味子木脂素類成分研究發(fā)現(xiàn)，不同產(chǎn)地五味子藥材中均含有五味子甲素、五味子乙素、五味子丙素、五味子醇甲、五味子醇乙、五味子酯甲等6種木脂素類成分，且均以五味子醇甲的質(zhì)量分數(shù)最高，五味子丙素質(zhì)量分數(shù)最低[7]。

受體理論是藥效學的基本理論之一，是從分子水平解釋生命的生理和病理過程、藥物的藥理作用機制、藥物分子的結(jié)構效應關系的一個重要依據(jù)[8-9]。受體配體結(jié)合具有立體選擇性、飽和性、可逆性和高親和力的特點[10]。本研究聚焦于中藥有效物質(zhì)發(fā)現(xiàn)技術領域，著重研究基于化學生物學原理的中藥有效物質(zhì)快速發(fā)現(xiàn)新方法，創(chuàng)新提出并研究建立基于受體競爭性技術篩選五味子鎮(zhèn)靜催眠活性成分的方法學，采用已知通過結(jié)合GABA(γ-氨基丁酸)受體發(fā)揮鎮(zhèn)靜催眠作用的地西泮，與五味子競爭性結(jié)合同一受體成分GABA的方法，將五味子中與GABA受體結(jié)合的單體化合物競爭置換出來，通過HPLC-MS分析表征，鑒定出結(jié)合GABA受體的五味子中單體有效成分，再通過檢索文獻確認該成分是否具有鎮(zhèn)靜催眠的活性作用。

1儀器與材料

1.1儀器

FW177-中草藥粉碎機(天津市泰斯特儀器有限公司)；DT系列電子天平(常熟長青儀器儀表廠)；SY-5000旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器(上海亞榮生化儀器廠)；AUY120電子分析天平(日本島津公司)；DELTA 320 pH計[梅特勒-托利多(上海)分公司]；IKA-T10組織分散機(德國IKA公司)；Thermo240高速離心機(Thermo electron corporation)；THZ-82水浴恒溫振蕩器(江蘇金壇市宏華儀器廠)；KQ-100M超聲波清洗器(東莞市科橋超聲波設備有限公司)；TSQ Quantum Ult ra液質(zhì)聯(lián)用色譜儀(美國ThermoFisher公司)；AQUITY UPLC BEH C18色譜柱(1.7 μm，2.1 mm×50 mm，美國Waters公司)；SK8200LHC超聲波清洗器(上?？茖С晝x器公司)。

1.2藥材與試劑

五味子購于廣州市清平中藥材市場，經(jīng)廣東藥學院藥科學院王定勇老師鑒定為五味子Schisandrachinensis(Turcz.) Baill.。五味子提取液制備：中藥粉碎機粉碎，精密稱取50 g，按藥量的8～12倍加蒸餾水浸泡2 h潤濕，加熱煮沸2 h后，16層紗布濾過，取殘渣繼續(xù)加0.5倍水煮沸1.5 h，濾過，合并2次煎液，置旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀濃縮至生藥質(zhì)量濃度為5 g/mL，于4 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

地西泮注射液(天津藥業(yè)焦作有限公司)，試驗時用PBS緩沖液稀釋為所需濃度；BCA蛋白質(zhì)定量試劑盒[天根生化科技(北京)有限公司]；水為屈臣氏蒸餾水。

1.3動物

SPF級雄性Wistar大鼠3只，體質(zhì)量200～250 g，由廣州中醫(yī)藥大學實驗動物中心提供，合格證號：SCXK(粵)2013-0034。

2方法與結(jié)果

2.1牛血清白蛋白標準曲線的制備

用與待測樣品相同的稀釋液(三蒸水)根據(jù)表1中梯度稀釋方法將牛血清蛋白(BSA)標準品稀釋到所需要的各個不同濃度，并將稀釋好的各個濃度的BSA標準品分別裝在潔凈1 mL安瓿瓶中，每個1 mL安瓿的BSA標準品足夠用于制備下述所列出的任意一組稀釋范圍的標準品，并且每個稀釋濃度的標準品的體積足夠用于3次重復檢測。

表1　各個質(zhì)量濃度的BSA標準品制備方案

注：表格中B瓶樣品、C瓶樣品、E瓶樣品、F瓶樣品、G瓶樣品分別為配制得到的B、C、E、F、G安瓿瓶中的BSA標準品。

檢測各濃度BSA標準品吸光度值：取各個稀釋濃度的BSA標準品各25 μL，加入到微孔板中(檢測范圍為25～2 000 μg/mL)。在每一個孔中加入BCA工作液(A液∶B液體積比為50∶1)200 μL，并在振蕩器上振蕩30 s，使充分混合。將微孔板密封，在37 ℃孵育30 min，將微孔板冷卻至室溫，使用微孔板讀數(shù)儀，測量樣品在570 nm處的吸光度。以吸光度為縱坐標，質(zhì)量濃度為橫坐標繪制標準曲線，得回歸方程y=0.001 1x-0.071 9(r=0.998 4)，表明質(zhì)量濃度在25～2 000 μg/mL范圍內(nèi)與吸光度線性良好。

2.2腦組織蛋白受體制備[11]

取大鼠3只，處死，迅速取腦組織，置于預先冷凍的PBS液漂洗2次，用濾紙吸干，稱定質(zhì)量并記錄(操作要迅速)，將組織剪碎，放入50 mL離心管中，按勻漿液體積等于組織質(zhì)量的9倍的量加足PBS液，在冰浴中勻漿6次(15 s/次)，約2 min；勻漿液分裝在15 mL普通離心管，以3 500 r/min、4 ℃離心20 min，棄去沉淀，保留上清液，12 000 r/min、4 ℃離心30 min，取沉淀，棄去上清液，懸浮于5 mL PBS緩沖液中，取少量混懸液按“2.1”項下方法進行蛋白濃度的測定，其余存放于-20 ℃?zhèn)溆?，以上整個操作過程應保持在低溫下進行。

2.3藥物分子體外競爭性結(jié)合受體試驗[12]

試驗樣品共分為3組，分別為五味子組、地西泮組及五味子+地西泮組。

五味子組：組成成分為1 mL蛋白+1 mL五味子提取液(質(zhì)量濃度為5 mg/mL) +3 mL PBS液。處理方法：蛋白1 mL和五味子提取液1 mL，補充PBS至5 mL，充分混勻，將試管置37 ℃孵育1 h，用玻璃纖維微孔濾膜濾過，取下濾膜(濾膜中截留了與蛋白結(jié)合的成分)，將濾膜剪碎置于離心管中，加入體積分數(shù)50%甲醇5 mL，超聲助溶10 min，2 500 r/min高速離心15 min，取上清液，得到競爭后樣品，用0.22 μm一次性有機小濾膜濾過，即得。

地西泮組：組成成分為1 mL蛋白+2 mL地西泮溶液(質(zhì)量濃度為5 mg/mL) +2 mL PBS液。處理方法：蛋白1 mL和地西泮溶液2 mL，補充PBS至5 mL，充分混勻。后續(xù)處理與五味子組相同。

五味子+地西泮組：組成成分為1 mL蛋白+1 mL五味子提取液(質(zhì)量濃度為5 mg/mL) +2 mL地西泮(質(zhì)量濃度為5 mg/mL) +1 mL PBS液。處理方法：蛋白1 mL和五味子提取液1 mL，充分混勻，分別將試管置37 ℃孵育1 h，加入地西泮溶液2 mL，補充PBS至5 mL，充分混勻。后續(xù)處理與五味子組相同。

2.4HPLC-MS法對五味子提取液鎮(zhèn)靜催眠有效成分的表征

液相色譜條件：AQUITY UPLC BEH C18(1.7 μm，2.1 mm×50 mm)；進樣量為10 μL；流速為0.8 mL/min；以水為流動相A，乙腈為流動相B，如表2進行梯度洗脫。

表2　梯度洗脫程序

質(zhì)譜參數(shù)：ESI+，分子質(zhì)量掃描范圍(m/z)：100～1 500。

在上述條件下，將以上3組樣品進行HPLC-MS測定，總離子流色譜圖見圖1?？梢?，原本出現(xiàn)于五味子組的保留時間為6.83 min的色譜峰，在五味子+地西泮組的色譜圖中消失了。進一步對保留時間為6.83 min處的色譜峰進行質(zhì)譜分析，得該物質(zhì)的m/z為415，見圖2。為推斷該物質(zhì)是否是五味子中的鎮(zhèn)靜催眠有效成分，對五味子的各成分情況進行文獻調(diào)研，結(jié)果顯示該物質(zhì)的m/z值與五味子中的聯(lián)苯環(huán)辛烯類木脂素物質(zhì)五味子甲素(deoxyschizandrin，分子式為C24H32O6，相對分子質(zhì)量為416.51)吻合，而聯(lián)苯環(huán)辛烯類木脂素是南、北五味子鎮(zhèn)靜催眠的活性物質(zhì)[13]。

BAC1357911t/min0.040.670.661.092.072.593.224.134.635.556.226.837.57tR=6.83min，可能為五味子中與GABA受體蛋白結(jié)合成分8.949.319.5310.249.768.256.385.672.592.081.511.090.739.769.608.237.273.563.042.042.080.721.691.50

A．五味子組：1 mL蛋白+1 mL五味子提取液(5 mg/mL) +3 mL PBS液； B.地西泮組：1 mL蛋白+2 mL地西泮(5 mg/mL)+2 mL PBS液； C.五味子+地西泮組：1 mL蛋白+1 mL五味子提取液(5 mg/mL) +2 mL地西泮(5 mg/mL)+1 mL PBS液。

圖1　3組檢測樣品的HPLC圖譜

圖2五味子組樣品中保留時間為6.83 min的物質(zhì)的質(zhì)譜圖

Figure 2The MS chromatogram ofS.chinensisgroup(tR=6.83 min)

3討論

受體配體結(jié)合試驗既借鑒了蛋白質(zhì)分子印跡技術的原理[14]，又利用了高特異高選擇的受體配體結(jié)合理論作為試驗設計的重要依據(jù)。受體理論是分子藥理學的核心理論之一，是從分子水平闡明生命的生理病理過程、藥物的作用機制、藥物分子構效關系的一個重要依據(jù)[8-9]。某一個受體被研究清楚后，有可能會成為藥物設計的靶標。研究、確認與已知靶點有結(jié)合的成分有助于藥物有效成分的篩選[15]，尤其是為中藥有效分子的確認提供研究基礎，突破中藥有效物質(zhì)基礎和作用機理研究的瓶頸，加快中藥新藥有效成分、機制、代謝、轉(zhuǎn)運、排泄機制的研究及新藥研發(fā)的速度。

五味子是傳統(tǒng)的安神藥，對其鎮(zhèn)靜催眠作用的研究大部分是采用自主活動記數(shù)法和協(xié)同閾下劑量戊巴比妥鈉的鎮(zhèn)靜催眠法，成分鑒定大多采用HPL-MS聯(lián)用法，其中的木脂素類成分是活性成分[16]。徐麗華等[13]通過鎮(zhèn)靜催眠動物模型試驗，探討了南、北五味子各化學部位的鎮(zhèn)靜催眠藥效學活性，采用HPLC-MS聯(lián)用技術分析2種五味子鎮(zhèn)靜催眠活性部位的組成成分，結(jié)果表明，南、北五味子的鎮(zhèn)靜催眠有效部位均是木脂素。李曉光等[17]驗證了五味子的鎮(zhèn)靜催眠有效活性成分主要為五味子甲素、五味子乙素、五味子丙素、五味子醇乙、五味子酯乙、五味子醇甲等。

本文選用具有鎮(zhèn)靜催眠的中藥五味子與具有GABA受體結(jié)合的模型藥地西泮作為研究對象，先制備大鼠大腦皮質(zhì)腦組織蛋白勻漿，獲得具有GABA受體的蛋白質(zhì)，為地西泮產(chǎn)生鎮(zhèn)靜催眠作用提供印跡模板。同時，采用體外試驗可降低體內(nèi)反應對藥物的代謝影響，可以更明確參與反應的藥物分子的結(jié)構與分子質(zhì)量。由于受體配體結(jié)合的專一性、可逆性、可被競爭置換的性質(zhì)[18]，五味子鎮(zhèn)靜催眠有效成分與地西泮通過競爭置換性結(jié)合靶點，在藥靶定量的情況下，與受體蛋白結(jié)合的五味子成分隨地西泮加入而被競爭性置換，這也提示了五味子產(chǎn)生鎮(zhèn)靜催眠的作用機制可能與地西泮類似，即五味子鎮(zhèn)靜催眠有效成分與中樞BDZ受體結(jié)合而促進γ-氨基丁酸(GABA)的釋放或促進突觸傳遞功能，從而達到鎮(zhèn)靜催眠的藥理作用。本文HPLC-MS表征結(jié)果表明，五味子提取物與包含GABA蛋白質(zhì)結(jié)合表征的色譜圖中，保留時間為6.83 min的物質(zhì)可能為五味子產(chǎn)生鎮(zhèn)靜催眠作用的有效成分，其m/z為415，結(jié)合文獻[13]的報道，推測該物質(zhì)為中藥五味子中的木脂素類成分五味子甲素(deoxyschizandrin，分子式為C24H32O6，相對分子質(zhì)量為416.51)。

本文通過地西泮與五味子提取物受體配體競爭性結(jié)合-HPLC-MS聯(lián)用試驗，結(jié)果顯示本研究初步建立的基于受體配體-HPLC-MS聯(lián)用技術篩選五味子鎮(zhèn)靜催眠成分的方法是可行的，同時此方法可適用于大部分作用于藥靶為受體的中藥有效成分研究。該篩選方法具有如下優(yōu)點：活性有效成分篩選效率高，同時又明確了靶標，節(jié)約時間與試驗費用成本；受體配體結(jié)合試驗與質(zhì)譜或核磁共振分析聯(lián)合運用，不僅可直接篩選出作用于特定受體的候選化合物，而且能快速獲得這些候選化合物的結(jié)構信息。因此，本文初步建立了以蛋白質(zhì)分子印跡技術的原理和受體配體結(jié)合理論為基礎，以已知陽性對照藥物競爭性置換未知中藥特定受體結(jié)合成分的有效活性成分篩選的技術平臺。

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(責任編輯：陳翔)

A novel method for screening effective constituents ofSchisandrachinensis(Turcz.)Baill. by receptor ligand-HPLC-MS techniques

WANG Youdi1,YANG Yuanyuan2,LI Jiahong1,GAO Siyuan2,YANG Chen1,ZANG Linquan2

(1.SchoolofTraditionalChineseMedicine；2.SchoolofPharmacy,GuangdongPharmaceuticalUniversity,Guangzhou510006,China)

Abstract:Objective To establish a new method for screening effective components of Schisandra chinensis (Turcz.)Baill. by receptor ligand binding assays and HPLC-MS analysis techniques,which could lay the foundation for the rapid analysis and confirm method of the effective components in the single or compound traditional Chinese Medicine prescription. This method even provided a new research idea and method for the study of the effective material foundation and the mechanism or drug target of the traditional Chinese Medicine. Methods The protein extracts contained GABA receptors of brain tissue of rats were the prepared under the receptor ligand binding principle,which was used to establish the in vitro model of the combination of the GABA receptor and the drug. Diazepam was used to replace the monomer composition of S. chinensis combined with the GABA receptor competitively. The experiment was based on the method that diazepam played sedative and hypnotic effects by combining with GABA receptor and was competitively combined the same receptor as S. chinensis. The effective monomer of the S. chinensis which had combined with the GABA receptor was identified by means of HPLC-MS analysis techniques. The effect of the monomer on the activity of sedative and hypnotic was confirmed by literature retrieval. Results A rapid screening method for the effective components of the single traditional Chinese herb was established by receptor ligand binding assays and HPLC-MS analysis techniques. The application of this method to study the effective components with sedative and hypnotic activity of S. chinensis, showed that diazepam competitively replaced the aqueous extract of S. chinensis combined GABA receptor,and the HPLC-MS analysis result revealed that deoxyschizandrin (Molecular formula: C24H32O6,molecular weight: 416.51) maybe the monomer of the schisandra chinensis which combined with the GABA receptor. The literature retrieval result showed that deoxyschizandrin was the effective component with sedative and hypnotic effects of S. chinensis. Conclusion A novel method for screening effective components in the single or compound prescription of traditional Chinese Medicine by receptor ligand binding techniques has been initially established. Meanwhile,the method has preliminary confirmed that deoxyschizandrin maybe the monomer of the S.chinensis that combined with the GABA receptor.

Key words:receptor ligand binding; HPLC-MS; Schisandra chinensis (Turcz.) Baill.; effective component; methodology

DOI:10.16809/j.cnki.1006-8783.2015110202

中圖分類號：R284.2

文獻標志碼：A

文章編號:1006-8783(2016)01-0014-05

作者簡介：王有娣(1989—)，女，2013級碩士研究生，Email:13450260093@163.com；通信作者：臧林泉(1965—)，男，博士，教授，從事藥理學研究，Email:zanglq@yahoo.com。

基金項目：廣東省科技計劃項目(2015A020211028)；吳階平醫(yī)學基金會(320.6750.1208)；廣東省醫(yī)學科研基金(A2013320)

收稿日期：2015-11-02

網(wǎng)絡出版時間：2016-01-15 17:00網(wǎng)絡出版地址：http://www.cnki.net/kcms/detail/44.1413.R.20160115.1700.006.html