不同基質(zhì)酵母浸膏對(duì)cAMP合成菌生長(zhǎng)的影響

李俊惺,徐曉靜,李會(huì)軍,劉景良,陳延慧,常景玲

（1.現(xiàn)代生物育種河南省協(xié)同創(chuàng)新中心,河南新鄉(xiāng)453003；2.河南科技學(xué)院,河南新鄉(xiāng)453003；3.輝縣市北云門鎮(zhèn)人民政府,河南輝縣453631）

不同基質(zhì)酵母浸膏對(duì)cAMP合成菌生長(zhǎng)的影響

李俊惺1,2,徐曉靜1,2,李會(huì)軍3,劉景良1,2,陳延慧1,2,常景玲1,2

（1.現(xiàn)代生物育種河南省協(xié)同創(chuàng)新中心,河南新鄉(xiāng)453003；2.河南科技學(xué)院,河南新鄉(xiāng)453003；3.輝縣市北云門鎮(zhèn)人民政府,河南輝縣453631）

選取7種不同基質(zhì)酵母浸膏配制種子培養(yǎng)基,設(shè)定8、10、12 g/L三個(gè)質(zhì)量濃度,搖床培養(yǎng)cAMP合成菌,對(duì)菌落密度、種子液pH、菌體濃度（OD值）和葡萄糖比消耗率等參數(shù)進(jìn)行綜合分析,研究不同基質(zhì)酵母浸膏種子培養(yǎng)基對(duì)cAMP合成菌生長(zhǎng)的影響.結(jié)果表明：cAMP合成菌的種子培養(yǎng)基中酵母膏最佳質(zhì)量濃度為8 g/L,以使用啤酒廢酵母浸膏和蔗糖糖蜜酵母浸膏更為適宜.

酵母浸膏；cAMP合成菌；菌落密度；OD值；葡萄糖比消耗率

環(huán)磷酸腺苷（cAMP）是人體內(nèi)廣泛存在的一種具有重要生理活性的物質(zhì)[1-3],作為細(xì)胞內(nèi)的第二信使,對(duì)糖、脂肪的代謝,核酸、蛋白質(zhì)的合成起著重要的調(diào)節(jié)作用.cAMP在醫(yī)藥及動(dòng)物飼料添加劑領(lǐng)域用途廣泛,發(fā)揮著重要作用[4-6].當(dāng)前,利用微生物發(fā)酵生產(chǎn)cAMP是最高效、最節(jié)能的方法之一,發(fā)酵過(guò)程中菌種的活性和穩(wěn)定性是決定發(fā)酵水平的關(guān)鍵因素.酵母浸膏是cAMP發(fā)酵種子培養(yǎng)基中的主要成分之一,為cAMP發(fā)酵種子生長(zhǎng)提供重要營(yíng)養(yǎng).酵母抽提物是一種以酵母細(xì)胞作為原料,通過(guò)酵母細(xì)胞自溶破壁和酵母自身的酶系對(duì)酵母細(xì)胞質(zhì)進(jìn)行水解,或以酶制劑進(jìn)行水解后再經(jīng)一系列抽提濃縮等精制工序得到的產(chǎn)物,其主要成分為多種氨基酸、肽類物質(zhì)、核苷酸、D族維生素等,是一類營(yíng)養(yǎng)豐富的有機(jī)氮源[7].本試驗(yàn)主要研究了不同基質(zhì)酵母浸膏對(duì)cAMP合成菌生長(zhǎng)的影響,以確定cAMP合成菌種子培養(yǎng)基中最佳酵母浸膏的類型和用量.

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

菌種：節(jié)桿菌（Arthrobacter sp.）A.sp01,河南科技學(xué)院生命科技學(xué)院發(fā)酵工程實(shí)驗(yàn)室保存菌株.

試劑：葡萄糖、蛋白胨、牛肉膏、NaCl、尿素、酵母浸膏、瓊脂、NaCl、HCl,均為生化試劑.

酵母浸膏：A,大豆基質(zhì)酵母浸膏；B,生化試劑酵母浸膏；C,甜菜基質(zhì)酵母浸膏；D,純大豆浸膏；E,啤酒廢酵母浸膏；F,大豆蛋白胨；G,蔗糖糖蜜酵母浸膏.

儀器：LDZX-50KBS高壓滅菌鍋（上海申安醫(yī)療器械廠）,雙人垂直凈化工作臺(tái)（蘇凈集團(tuán)安泰公司制造）,DNP-9082-1A電熱恒溫培養(yǎng)箱（上海圣科儀器設(shè)備有限公司）,DHG-9140A電熱鼓風(fēng)干燥箱（上海三發(fā)實(shí)驗(yàn)儀器廠）,ZWF-2112搖床（上海智城分析儀器制造有限公司）,UV-5800紫外分光光度計(jì)（上海元析科技儀器有限公司）,SGD-Ⅳ全自動(dòng)還原糖測(cè)定儀（山東省科學(xué)院）.

培養(yǎng)基：斜面培養(yǎng)基：葡萄糖1 g,蛋白胨1 g,牛肉膏1 g,NaCl 0.3 g,尿素0.4 g,酵母膏1 g,瓊脂2 g,加蒸餾水至100 mL,調(diào)pH值至7.0,121℃、高壓蒸汽滅菌30 min.

種子培養(yǎng)基：葡萄糖1 g,蛋白胨1 g,牛肉膏1 g,NaCl 0.3 g,尿素0.4 g,酵母浸膏設(shè)置0.8、1.0、1.2 g三種處理,加蒸餾水至100 mL,調(diào)pH值至7.2,121℃、高壓蒸汽滅菌30 min.

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 菌種活化將保藏菌種接種于斜面培養(yǎng)基上,在30℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h,觀察其生長(zhǎng)情況.可活化2次,備用.

1.2.2 種子培養(yǎng)挑取斜面菌種接種于裝有30 mL種子培養(yǎng)基的250 mL錐形瓶中,于搖床上30℃、110 r/min培養(yǎng)24 h.

1.2.3 菌種生長(zhǎng)活性檢測(cè)采用平板菌落觀察、分光光度法測(cè)定540 nm波長(zhǎng)處種子培養(yǎng)液OD值增長(zhǎng)、種子培養(yǎng)液pH和殘?zhí)亲兓卸ňN的生長(zhǎng)活性[8].

2 結(jié)果與分析

2.1 不同基質(zhì)酵母浸膏培養(yǎng)基種子生長(zhǎng)菌落密度

cAMP發(fā)酵種子搖床培養(yǎng)24 h涂平板,不同基質(zhì)酵母浸膏培養(yǎng)基種子生長(zhǎng)菌落特征表現(xiàn)基本一致,菌落凸起,半透明,呈乳白色,沒有氣味,易于挑起,但平板中菌落密度差異較大,結(jié)果見表1.

表1 不同基質(zhì)酵母浸膏種子培養(yǎng)平板菌落密度Tab.1 Comparison of different substrate yeast extract seed culture plate colony density

由表1可知,隨著cAMP發(fā)酵種子培養(yǎng)基中不同基質(zhì)酵母浸膏質(zhì)量濃度的增加,菌落密度逐漸降低.種子培養(yǎng)基中酵母浸膏質(zhì)量濃度在8.0 g/L時(shí),菌落密度都較大.7種酵母浸膏中以啤酒廢酵母浸膏（E）和蔗糖糖蜜酵母浸膏（G）培養(yǎng)的菌落密度最大,表明種子培養(yǎng)基中使用啤酒廢酵母浸膏和蔗糖糖蜜酵母浸膏時(shí)菌種活性更強(qiáng).

2.2 不同基質(zhì)酵母浸膏液體培養(yǎng)菌體的OD值

cAMP發(fā)酵種子搖床培養(yǎng)24 h后,使用紫外分光光度法測(cè)定波長(zhǎng)540 nm處的菌體OD值,結(jié)果見表2.酵母浸膏種類、質(zhì)量濃度對(duì)種子生長(zhǎng)影響的顯著性分析結(jié)果見表3.

表2 不同基質(zhì)酵母浸膏種子培養(yǎng)菌體的OD值Tab.2 OD value of different substrate yeast extract seed culture concentration

表3 酵母浸膏對(duì)菌體OD值影響的方差分析結(jié)果Tab.3 The variance analysis results of cell OD value by different substrate yeast extract seed culture

由表2、表3可知,隨著cAMP發(fā)酵種子培養(yǎng)基中不同基質(zhì)酵母浸膏質(zhì)量濃度的增加,菌體的OD值基本呈降低趨勢(shì).種子培養(yǎng)基中酵母浸膏質(zhì)量濃度在8.0 g/L時(shí),菌體的OD值都較大.7種酵母浸膏中以啤酒廢酵母浸膏（E）和蔗糖糖蜜酵母浸膏（G）培養(yǎng)的菌體OD值最大,表明種子培養(yǎng)基中使用啤酒廢酵母浸膏和蔗糖糖蜜酵母浸膏時(shí)菌種的活性更強(qiáng).方差分析結(jié)果顯示,酵母浸膏的種類和質(zhì)量濃度對(duì)菌體OD值的影響均為極顯著.

2.3 不同基質(zhì)酵母浸膏種子培養(yǎng)液的pH

cAMP發(fā)酵種子搖床培養(yǎng)24 h后,種子液的pH變化見表4.

表4 種子液pH的變化Tab.4 pH changes of seed liquid

由表4可知,不同處理?xiàng)l件下cAMP發(fā)酵種子培養(yǎng)液的pH值均在8.5左右,表明同一菌種在不同基質(zhì)酵母浸膏質(zhì)量濃度種子培養(yǎng)基中的生長(zhǎng)代謝基本穩(wěn)定.

2.4 不同基質(zhì)酵母浸膏種子培養(yǎng)液中的殘?zhí)呛?/p>

cAMP發(fā)酵種子搖床培養(yǎng)24 h后,種子液中殘?zhí)堑馁|(zhì)量分?jǐn)?shù)見表5.

表5 種子液中殘?zhí)堑馁|(zhì)量分?jǐn)?shù)Tab.5 The mass fraction of residual sugar in seed liquid%

由表5可知,cAMP發(fā)酵種子培養(yǎng)基中不同基質(zhì)酵母浸膏質(zhì)量濃度為8.0 g/L時(shí),種子培養(yǎng)液殘?zhí)堑馁|(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.20%～0.27%；不同基質(zhì)酵母浸膏質(zhì)量濃度為10.0 g/L時(shí),種子培養(yǎng)液殘?zhí)堑馁|(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.22%～0.32%；不同基質(zhì)酵母浸膏濃度12.0 g/L時(shí),種子培養(yǎng)液殘?zhí)堑馁|(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.27%～0.29%.種子培養(yǎng)基中酵母浸膏質(zhì)量濃度在8.0 g/L時(shí),種子培養(yǎng)液殘?zhí)堑馁|(zhì)量分?jǐn)?shù)都較低,其中以啤酒廢酵母浸膏（E）和蔗糖糖蜜酵母浸膏（G）的種子培養(yǎng)液殘?zhí)琴|(zhì)量分?jǐn)?shù)為最低.

菌種培養(yǎng)過(guò)程中的耗糖量,不能直觀判斷菌種的活力大小,需計(jì)算葡糖糖消耗比速率來(lái)判斷,不同基質(zhì)酵母浸膏種子培養(yǎng)葡萄糖消耗比速率見表6.酵母浸膏種類、質(zhì)量濃度對(duì)種子生長(zhǎng)的影響的方差分析結(jié)果見表7.

表6 不同基質(zhì)酵母浸膏種子培養(yǎng)的葡萄糖消耗比速率Tab.6 Rate of the glucose consumption in seed culture

表7 酵母浸膏種子培養(yǎng)的葡萄糖消耗比速率方差分析結(jié)果Tab.7 The variance analysis of rate of glucose consumption in seed culture

由表6可知,種子培養(yǎng)基中酵母浸膏質(zhì)量濃度為8.0 g/L時(shí),不同基質(zhì)酵母浸膏種子培養(yǎng)的葡萄糖消耗比速率均較高,其中以啤酒廢酵母浸膏（E）和蔗糖糖蜜酵母浸膏（G）的種子培養(yǎng)葡萄糖消耗比速率為最高.表明種子培養(yǎng)基中使用啤酒廢酵母浸膏（E）和蔗糖糖蜜酵母浸膏（G）時(shí)菌種菌體量最大,活性最強(qiáng).方差分析結(jié)果顯示,酵母浸膏的種類和質(zhì)量濃度對(duì)葡糖糖消耗比速率的影響均為極顯著,對(duì)菌體濃度的影響也為極顯著.

3 小結(jié)

通過(guò)對(duì)不同基質(zhì)酵母浸膏在種子培養(yǎng)基中的應(yīng)用可知,酵母浸膏的種類和質(zhì)量濃度都對(duì)cAMP產(chǎn)生菌的生長(zhǎng)有極其顯著的影響.對(duì)菌落密度、種子液的pH、菌體濃度（OD值）和糖代謝（糖度）等參數(shù)的綜合分析結(jié)果表明,cAMP產(chǎn)生菌的種子培養(yǎng)基中酵母浸膏質(zhì)量濃度以8.0 g/L為最佳,供試的酵母浸膏中,啤酒廢酵母浸膏和蔗糖糖蜜酵母浸膏最適宜.

[1]ANTONI F A.Molecular diversity of cyclic AMP signalling[J].Frontiers in Neuroendocrinology,2000,21（2）：103-132.

[2]MAGHAZACHI A.Choleratoxin inhibits interleukin-2-induced,but enhances pertussis toxin-induced T-cell proliferation：regulation by cyclic nucleotides[J].Immunology,1992,75（1）：103-107.

[3]徐曉靜,余筱敏,李俊惺,等.添加次黃嘌呤對(duì)環(huán)磷酸腺苷發(fā)酵產(chǎn)苷的影響[J].河南科技學(xué)院學(xué)報(bào)（自然科學(xué)版）,2016, 44（3）：22-25.

[4]SHANKAR R,ZHU J S,BARON A.Glucosamine infusion in rats mimics the β-cell dysfunction of non-insulin-dependent diabetes mellitus[J].Metabolism,1998,47（5）：573-577.

[5]MCPHEE I,GIBSON L C,KEWNEY J,et al.Cyclic nucleotide signalling：a molecular approach to drug discovery for Alzheimer’s disease[J].Biochemical Society Transactions,2005,33（6）：1330-1332.

[6]MOUTINHO A,HUSSEY P J,TREWAVAS A J,et al.cAMP acts as a second messenger in pollen tube growth and reorientation[J]. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America,2001,98（18）：10481-10486.

[7]胡成遠(yuǎn),陳雄,唐冠群,等.幾種不同來(lái)源酵母抽提物對(duì)兩株乳桿菌生長(zhǎng)的比較研究[J].中國(guó)釀造,2009（7）：50-53.

[8]伍國(guó)明.酵母浸膏蛋白胨與pH對(duì)草菇培養(yǎng)與生物學(xué)效率影響[J].中國(guó)食用菌,2009,28（1）：27-29.

（責(zé)任編輯：鄧天福）

Effect of yeast extract with different substrates on the growth of cAMP synthesis Bacteria

LI Junxing1,2,XU Xiaojing1,2,LI Huijun3,LIU Jingliang1,2,CHEN Yanhui1,2,CHANG Jingling1,2
（1.Cllabortive Innovation Center of Modern Biological Breeding,Xinxiang 453003,China；2.Henan Institute of Science and Technology,Xinxiang 453003,China；3.The People’s Government of Beiyunmen Town,Huixian 453631,China）

The effects of yeast extract medium with different substrates on the growth of cAMP synthesis bacteria was investigated and yeast extract with 7 different substrates were selected for seed medium preparation with concentrations of 8,10,12 g/L,respectively.The results showed that yeast extract concentration of 8 g/L was the optimal content and the combination of waste beer yeast extract and sugar molasses yeast extract was most appropriate for cAMP synthesis bacteria growing via comprehensive analysis of various parameters including colonies density,pH,cell concentration（OD）and glucose consumption rate and so on.

yeast extract；cAMP synthesis bacteria；colony density；OD value；glucose consumption rate

S858.31

A

1008-7516（2016）06-0009-04

10.3969/j.issn.1008-7516.2016.06.003

2016-03-15

國(guó)家級(jí)大學(xué)生創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)訓(xùn)練計(jì)劃項(xiàng)目（201410467001）

李俊惺（1993―）,女,河南平頂山人,本科生.

常景玲（1963―）,女,河南新鄉(xiāng)人,教授.主要從事發(fā)酵制藥研究.