金門高粱酒釀造副產(chǎn)物黃水的抗酪氨酸酶性質(zhì)

陳志敏,崔 沂,張維友,胡泳華,王 勤,陳清西(廈門大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院,濱海濕地生態(tài)系統(tǒng)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,福建廈門361102)

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金門高粱酒釀造副產(chǎn)物黃水的抗酪氨酸酶性質(zhì)

陳志敏,崔 沂,張維友,胡泳華,王 勤,陳清西*
(廈門大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院,濱海濕地生態(tài)系統(tǒng)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,福建廈門361102)

摘要:在金門高粱酒的釀造過(guò)程中,采用金選、兩糯、興湘、紅梗和紅糯5種高粱作為原料,收集得到副產(chǎn)物黃水,分析其成分.研究了5種黃水對(duì)蘑菇酪氨酸酶二酚酶的抑制作用,其導(dǎo)致酶活力下降一半的抑制劑質(zhì)量濃度分別為130,178, 104,301,230 ng/m L.5種黃水對(duì)蘑菇酪氨酸酶二酚酶均表現(xiàn)為可逆的抑制作用,其中金選、紅梗、紅糯的黃水表現(xiàn)為混合性抑制,兩糯和興湘的黃水表現(xiàn)為非競(jìng)爭(zhēng)性抑制.探討了5種黃水對(duì)小鼠黑色素瘤細(xì)胞B16的細(xì)胞增殖率、酪氨酸酶活力和黑色素含量變化的影響.結(jié)果表明,100 mg/m L兩糯和興湘的黃水對(duì)酪氨酸酶活力的抑制效果較好,抑制率分別為52.7%和40.9%,黑色素含量的抑制率分別為44.5%和46.1%.綜上所述,黃水不僅對(duì)酪氨酸酶活力有很好的抑制作用,還可以很好地抑制黑色素生成,具有很好的應(yīng)用前景.

關(guān)鍵詞:黃水;成分分析;酪氨酸酶;B16細(xì)胞

酒醅在發(fā)酵過(guò)程中,淀粉由糖變酒的同時(shí)產(chǎn)生CO2,單位酒醅的重量相對(duì)減少,結(jié)晶水游離出來(lái),原料中的單寧、色素、可溶性淀粉、酵母自溶物、還原糖等溶于水中,并沉積于窖池底部而形成黃水[1-2].而黃水中含有豐富的有機(jī)酸、酒精,還有糖類和微生物菌體及活細(xì)胞等,黃水中的許多物質(zhì)對(duì)提高白酒質(zhì)量,增加白酒香氣,改善白酒風(fēng)味有著重要的作用.

近年來(lái),關(guān)于對(duì)黃水資源的再利用開展了大量研究,主要包括利用黃水釀醋[3],制備乙酸乙酯[4],以及利用黃水中的乳酸制備乳酸鈣、合成復(fù)合有機(jī)酸鈣[5]等.徐傳鴻等[6]對(duì)黃水進(jìn)行常規(guī)的成分分析發(fā)現(xiàn)其中含有0.13%～ 0.23%的單寧,而Chai等[7]報(bào)道單寧物質(zhì)具有抗酪氨酸酶的作用.我們對(duì)金門高粱酒釀造副產(chǎn)物黃水的成分進(jìn)行了分析,同時(shí)探討了其對(duì)酪氨酸酶活力的抑制作用及對(duì)小鼠黑色素瘤細(xì)胞B16產(chǎn)生黑色素的影響.

1 材料與方法

1.1材 料

黃水收集自金門高粱酒釀造過(guò)程中產(chǎn)生的副產(chǎn)物;蘑菇酪氨酸酶(tyrosinase)、L-3,4-二羥基苯丙氨酸(L-DOPA)均購(gòu)自Sigma公司;其他試劑為國(guó)產(chǎn)分析純?cè)噭?使用的蒸餾水為去離子重蒸水.

1.2方 法

1.2.1樣品制備

收集新鮮釀造黃水,25℃培養(yǎng)24 h;將可發(fā)酵物分解后,待酒精度不再增加,真空抽取以去除酒精; 0.45μm膜過(guò)濾后,真空濃縮,冷凍干燥待用.

1.2.2黃水的成分分析

淀粉及還原糖測(cè)定采用斐林試劑[8],蛋白質(zhì)以總氮分析儀測(cè)定,總固形物采用質(zhì)量測(cè)定法.用二甲基甲酰胺溶液振蕩提取單寧,過(guò)濾后取濾液,在氨存在的條件下,與檸檬酸鐵銨形成棕色絡(luò)合物,用分光光度計(jì)在525 nm處測(cè)定其吸光度值,與標(biāo)準(zhǔn)系列比較定量[9].取黃水200 m L,經(jīng)蒸餾后,取100 m L以酒精計(jì)測(cè)定酒精.

1.2.3黃水對(duì)蘑菇酪氨酸酶活力的影響

參考文獻(xiàn)[10]方法,在磷酸鹽緩沖液(PBS,p H 6.8)中,以L-DOPA為底物測(cè)定酪氨酸酶二酚酶的活book=199,ebook=56力.先加入0.1 m L不同濃度的黃水于比色杯中,再加入2.8 m L預(yù)先30℃恒溫水浴的底物溶液(含PBS和L-DOPA),然后加入0.1 m L酪氨酸酶水溶液,即刻混勻;在30℃恒溫條件下檢測(cè)波長(zhǎng)475 nm下的吸光度值(OD(475))隨時(shí)間的增長(zhǎng)曲線,從曲線斜率計(jì)算出酶的活力,產(chǎn)物的消光系數(shù)以3 700 L/(mol·cm)計(jì)算.通過(guò)Lineweaver-Burk雙倒數(shù)作圖,比較酶催化反應(yīng)的動(dòng)力學(xué)參數(shù),包括表觀米氏常數(shù)(Km)和最大反應(yīng)速度(Vm)的變化,判斷抑制作用機(jī)理.

1.2.4黃水對(duì)小鼠黑色素瘤細(xì)胞B16的影響

參照文獻(xiàn)[11]的方法,采用RPMI1640培養(yǎng)基, 在37℃的CO2孵箱培養(yǎng)細(xì)胞.待細(xì)胞生長(zhǎng)至近融合狀態(tài),經(jīng)胰蛋白酶消化收集并調(diào)整細(xì)胞濃度;在96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中加入小鼠B16黑素瘤細(xì)胞的單細(xì)胞懸液,每孔180μL,培養(yǎng)過(guò)夜;待細(xì)胞完全貼壁后,加入20μL含黃水的培養(yǎng)液,繼續(xù)培養(yǎng)72 h,于結(jié)束前4 h棄培養(yǎng)液,用p H 7.4的PBS洗滌,加入10μL噻唑藍(lán)(MTT)和90μL RPMI1640培養(yǎng)液;在37℃的CO2孵箱培養(yǎng)細(xì)胞4 h后,棄上清液,加入200μL二甲亞砜(DMSO),在37℃條件下震蕩,使甲替結(jié)晶完全溶解,立即于酶標(biāo)儀測(cè)定570 nm下的吸光度值(OD570),計(jì)算出細(xì)胞增殖率.

按上述相同的條件培養(yǎng)細(xì)胞,72 h后棄培養(yǎng)液, 用PBS洗滌,加入含1%(體積分?jǐn)?shù))Triton X-100的PBS 90μL;然后加入10μL 1.0 mg/m L L-DOPA,置于30℃反應(yīng)30 min,測(cè)定OD475.相對(duì)酪氨酸酶剩余活力為:OD475/OD570×100%.

待細(xì)胞生長(zhǎng)至近融合狀態(tài),經(jīng)胰蛋白酶消化收集并調(diào)整細(xì)胞濃度,接種過(guò)夜;待貼壁后換液,加入新鮮培養(yǎng)液和含不同濃度效應(yīng)物的培養(yǎng)液,繼續(xù)培養(yǎng)72 h后棄培養(yǎng)液,用PBS洗滌;加入DMSO的NaOH溶液,80℃反應(yīng)2 h,12 000 r/min離心10 min,上清液分別用于蛋白質(zhì)濃度測(cè)定和405 nm處吸光度值(OD405)的測(cè)定,計(jì)算出黑色素含量.相對(duì)黑色素含量為:OD405/OD570×100%.

2 結(jié) 果

2.1黃水的常規(guī)成分分析

測(cè)定5種高粱在釀酒過(guò)程中產(chǎn)生的副產(chǎn)物黃水(YW1～YW5)的成分,包括p H值以及淀粉、蛋白質(zhì)、總固形物、總氮、單寧、色素、還原糖、總糖和酒精的含量(質(zhì)量濃度或質(zhì)量分?jǐn)?shù)),結(jié)果列于表1.從表中可見,5種黃水均呈酸性,在淀粉、蛋白質(zhì)、總氮、還原糖含量方面差異不大,而單寧及色素含量有較大差異.

2.2黃水對(duì)蘑菇酪氨酸酶二酚酶活力的影響

以L-DOPA為底物,測(cè)定5種黃水對(duì)酪氨酸酶二酚酶活力的影響.酪氨酸酶二酚酶的反應(yīng)進(jìn)程曲線斜率隨效應(yīng)物的質(zhì)量濃度(ρI)增大而下降,說(shuō)明5種黃水均對(duì)二酚酶活力有抑制作用.由此得到5種黃水抑制酪氨酸酶二酚酶活力的濃度效應(yīng)曲線(圖1),可得YW1～YW5導(dǎo)致酶活力下降一半的濃度(半抑制濃度,IC50)分別為130,178,104,301,230 ng/m L.

圖1　5種黃水對(duì)酪氨酸酶二酚酶活力的影響Fig.1 Effect of five types of yellow water on the diphenolase activity of tyrosinase

表1　5種高粱產(chǎn)生的黃水(YW1～YW5)的成分分析Tab.1 The component analyses of YW1-YW5

2.3黃水對(duì)蘑菇酪氨酸酶二酚酶活力的抑制作用測(cè)定

固定底物L(fēng)-DOPA濃度(ρS),改變反應(yīng)體系中的酶量(質(zhì)量濃度,ρE),測(cè)得的酶活力對(duì)酶量作圖,得到一組通過(guò)原點(diǎn)的直線(圖2).由圖可見隨著金選黃水(YW1)質(zhì)量濃度的增大,直線斜率降低,說(shuō)明YW1對(duì)酶的抑制作用屬于可逆過(guò)程,它是通過(guò)降低酶的催化效率導(dǎo)致酶活力的下降,而不是通過(guò)減少有效的酶量引起酶活力的下降.經(jīng)測(cè)定,其他4種黃水對(duì)酪氨酸酶的抑制作用均屬于可逆抑制.

2.4黃水對(duì)蘑菇酪氨酸酶二酚酶活力的抑制作用類型

以Lineweaver-Burk雙倒數(shù)作圖法來(lái)判斷不同黃水對(duì)蘑菇酪氨酸酶的抑制作用類型,結(jié)果如圖3所示.圖3(a)為YW1的Lineweaver-Burk雙倒數(shù)圖,得到相交在第三象限的一組直線,由此說(shuō)明隨著YW1質(zhì)量濃度的增大,Km值和Vm值均變小,其抑制機(jī)理表現(xiàn)為混合Ⅱ型.以不同質(zhì)量濃度YW1下測(cè)定的雙倒數(shù)圖直線的截距和斜率分別對(duì)YW1質(zhì)量濃度作圖各為一條直線(圖3(a)插圖Ⅰ和Ⅱ),從直線的斜率可以求得抑制常數(shù)KI為196 ng/m L,酶-底物絡(luò)合物抑制常數(shù)KIS為89 ng/m L;同理可得其他4種黃水的Lineweaver-Burk雙倒數(shù)圖(圖3(b)～(e)),判斷得相應(yīng)的抑制類型并計(jì)算得抑制常數(shù)(表2).

圖2　不同質(zhì)量濃度金選黃水(YW1)對(duì)酪氨酸酶活力的影響Fig.2 Effect of different concentrations of YW1 on the activity of tyrosinase

圖3　5種黃水對(duì)酪氨酸酶的抑制類型分析Fig.3 Inhibition type analyses of five types of yellow water on tyrosinase

2.5黃水對(duì)小鼠黑色素瘤細(xì)胞B16的細(xì)胞學(xué)效應(yīng)

以5種黃水為效應(yīng)物,蒸餾水為陰性對(duì)照,分別研究其對(duì)小鼠黑色素瘤細(xì)胞B16作用72 h后,細(xì)胞增殖率、細(xì)胞中的酪氨酸酶活力和黑色素含量的變化,結(jié)果如圖4所示.當(dāng)YW1質(zhì)量濃度達(dá)到100 mg/m L時(shí),酪氨酸酶剩余活力為49.5%;同時(shí),黑色素含量也隨著YW1的增加而減少,抑制率為30.2%.隨著YW2和YW3的質(zhì)量濃度增加,酪氨酸酶活力和黑色素含量均明顯降低;當(dāng)YW2質(zhì)量濃度達(dá)到100 mg/m L時(shí),細(xì)胞增殖率、酪氨酸酶剩余活力和黑色素含量分別為15.7%,52.7%和44.5%.當(dāng)YW3質(zhì)量濃度達(dá)到100 mg/mL時(shí),細(xì)胞增殖率、酪氨酸酶剩余活力和黑色素含量分別為17.1%,40.9%和46.1%.當(dāng)YW4質(zhì)量濃度大于25 mg/mL時(shí),其對(duì)酪氨酸酶活力和黑色素含量有一定程度的抑制,但在測(cè)定的質(zhì)量濃度范圍內(nèi)抑制率不超過(guò)30%.當(dāng)YW5質(zhì)量濃度僅為1 mg/m L 時(shí),酪氨酸酶活力就已被抑制了12.9%,但隨著YW5質(zhì)量濃度增大,酪氨酸酶活力在測(cè)定的質(zhì)量濃度范圍內(nèi)抑制率不超過(guò)20.1%;而當(dāng)YW5質(zhì)量濃度達(dá)到100 mg/m L時(shí),其對(duì)黑色素含量影響不大.

表2　5種黃水對(duì)酪氨酸酶的抑制效應(yīng)Tab.2 Inhibitory effects of five types of yellow water on the activity of tyrosinase

3 討 論

上述研究結(jié)果表明釀酒的副產(chǎn)物黃水具有很好的抑制酪氨酸酶活力的作用,不同品種高粱產(chǎn)生的黃水對(duì)酪氨酸酶的抑制效果不同,這可能是由于其成分存在一定差異所致.由于黃水中含有單寧,我們推測(cè)其對(duì)酪氨酸酶的抑制作用隨著單寧含量的不同而不同.5種高粱釀酒的副產(chǎn)物黃水按單寧的含量高低依次為YW1>YW3>YW2>YW5>YW4,而對(duì)蘑菇酪氨酸酶二酚酶的半抑制濃度由高到低依次為YW3>YW1 >YW2>YW5>YW4,兩者排序基本一致.Chai等從鳳凰木的葉、果實(shí)和樹皮中提取單寧,探討其對(duì)蘑菇酪氨酸酶的抑制作用,半抑制濃度分別為38,73和54 μg/m L[12];而在我們研究結(jié)果中,黃水對(duì)酪氨酸酶的半抑制濃度分別為130,178,104,301和230 ng/m L.由此我們推測(cè)黃水中對(duì)酪氨酸酶起抑制作用的不僅僅是單寧.黃水是由曲霉發(fā)酵釀酒時(shí)產(chǎn)生的副產(chǎn)物,曲霉發(fā)酵時(shí)會(huì)產(chǎn)生曲酸,Choi等研究發(fā)現(xiàn)曲酸的衍生物對(duì)酪氨酸酶具有很好的抑制作用[13],所以我們推測(cè)黃水對(duì)酪氨酸酶的抑制作用是其中單寧與曲酸共同作用的結(jié)果,這有待于進(jìn)一步研究探討.

圖4　5種黃水對(duì)小鼠B16細(xì)胞增殖率、細(xì)胞中的酪氨酸酶活力和黑色素含量的影響Fig.4 The effects of five types of yellow water on cell vability,activity of tyrosinase and content of melanin in mouse B16 cells

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Antityrosinase Properties of Yellow Water Byproduct of Kinmen Kaoliang Making

CHEN Chihmin,CUI Yi,ZHANG Weiyou,HU Yonghua,WANG Qin,CHEN Qingxi*
(Key Laboratory of the Coastal and Wetland Ecosystems,Ministry of Education, School of Life Sciences,Xiamen University,Xiamen 361102,China)

Abstract:The Kinmen Kaoliang was brewed using five species of sorghums,Jinxuan,Liangnuo,Xingxiang,Honggeng and Hongnuo.The byproduct during brewing,the yellow water,was collected,and its inhibitory effect on mushroom tyrosinase was investigated.The results showed that the IC(50)values of five types of yellow water were 130,178,104,301 and 230 ng/m L,respectively, and their inhibition kinetics was reversible,in which the yellow water of Jinxuan,Honggen and Hongnuo displayed a mixed type reversible mechanism,while the one of Liangnuo and Xingxiang displayed an uncompetitive reversible mechanism.Meanwhile,the cell proliferation rate,tyrosinase activity and melanin concentration of mouse B16 melanoma cells were also investigated with five types of yellow water.The data showed that the five types of yellow water had no effect on proliferation of B16 cells.However,the yellow water of Liangnuo and Xingxiang could inhibit the tyrosinase activity of B16 cell at a rate of 52.7%and 40.9%respectively,and could also inhibit the melanin concentration of B16 cells at rates of 44.5%and 46.1%respectively.In all,this study demonstrated that the yellow water not only inhibited the tyrosinase activity,but also inhibited the production of melanin in the B16 cells,implying its potential applications in the cosmetic industry.

Key words:yellow water;component analysis;tyrosinase;B16 cell

*通信作者:chenqx@xmu.edu.cn

基金項(xiàng)目:國(guó)家自然科學(xué)基金(31271952)

收稿日期:2015-03-14 錄用日期:2015-04-29

doi:10.6043/j.issn.0438-0479.2016.02.009

中圖分類號(hào):Q 356.1

文獻(xiàn)標(biāo)志碼:A

文章編號(hào):0438-0479(2016)02-0198-05

引文格式:陳志敏,崔沂,張維友,等.金門高粱酒釀造副產(chǎn)物黃水的抗酪氨酸酶性質(zhì)[J].廈門大學(xué)學(xué)報(bào)(自然科學(xué)版),2016,55 (2):198-202.

Citation:CHEN C M,CUI Y,ZHANG W Y,et al.Antityrosinase properties of yellow water byproduct of Kinmen Kaoliang making[J].Journal of Xiamen University(Natural Science),2016,55(2):198-202.(in Chinese)