重組人胸腺肽α1在大腸桿菌中的表達純化與鑒定

尹鳳紅,肖清江,周衛(wèi)東,陳清西(1.廈門大學生命科學學院,福建廈門36110;.廈門特寶生物工程股份有限公司,福建廈門3610)

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重組人胸腺肽α1在大腸桿菌中的表達純化與鑒定

尹鳳紅1,2,肖清江2,周衛(wèi)東2,陳清西1*
(1.廈門大學生命科學學院,福建廈門361102;2.廈門特寶生物工程股份有限公司,福建廈門361022)

摘要:采用大腸桿菌作為宿主表達重組人胸腺肽α1(rh Tα1)融合蛋白,純化獲得rh Tα1并對其鑒定.于300 L發(fā)酵罐進行中試發(fā)酵表達rh Tα1融合蛋白;經(jīng)異丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷(IPTG)誘導,離心發(fā)酵液收集菌體,菌體經(jīng)破碎、離心、親和層析捕獲,獲得融合蛋白;每升發(fā)酵液可獲得約170 mg硫氧環(huán)蛋白-胸腺肽α1融合蛋白.融合蛋白經(jīng)腸激酶酶切后,再經(jīng)親和層析、反相層析、體積排阻層析等純化步驟,獲得高純度rh Tα1;通過本純化工藝獲得的rh Tα1原液經(jīng)十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)和高效液相色譜-排阻法(HPLC-SEC)的檢測純度均大于99%;采用玫瑰花環(huán)形成率測定rh Tα1活性與市售化學合成標準品一致;質(zhì)譜分析分子質(zhì)量為3 066.59 u,與去乙?；膔h Tα1理論分子質(zhì)量(3 066 u)一致;N端測序結(jié)果與理論值一致.綜上結(jié)果,說明本工藝可實現(xiàn)工業(yè)化規(guī)模生產(chǎn).

關(guān)鍵詞:重組人胸腺肽α1(rh Tα1);表達;純化

胸腺素α1(thymosin-alpha 1,Tα1)作為免疫調(diào)節(jié)因子,可以啟動T淋巴細胞的成熟,刺激分泌干擾素及各種淋巴細胞介素,以及增強自然殺傷細胞介導的細胞毒性.對Tα1的臨床研究主要集中在治療乙型肝炎及丙型肝炎方面,能夠顯著增強機體免疫力,對肝炎病毒的復制繁殖具有顯著抑制作用[1-3];也有關(guān)于Tα1治療肺癌等腫瘤及其他免疫缺陷疾病的報道[4-5]. 1977年Goldstein等首次在胸腺組織內(nèi)發(fā)現(xiàn):人的Tα1是由28個氨基酸組成、N端乙?；乃嵝远嚯?其分子質(zhì)量為3 108 u,等電點為4.2,分子中有6對重復氨基酸殘基;氨基酸序列為Ser-Asp-Ala-Ala-Val-Asp-Thr-Ser-Ser-Glu-Ile-Thr-Thr-Lys-Asp-Leu-Lys-Glu-Lys-Lys-Glu-Val-Val-Glu-Glu-Ala-Glu-Asn[6].

目前Tα1生產(chǎn)工藝主要有兩種:一種是生化提取法,另一種是化學合成法.生化提取材料來源受限,有效成分Tα1含量低(質(zhì)量分數(shù)小于1%),成本高;化學合成的Tα1雖然已經(jīng)臨床應用,但價格昂貴,在合成過程中污染環(huán)境.當前臨床用藥以合成法生產(chǎn)的胸腺五肽和Tα1為主[7].通過查詢中國食品藥品監(jiān)督管理局(CFDA)官網(wǎng),采用基因工程技術(shù)生產(chǎn)的重組人胸腺肽α1(rh Tα1)暫未有獲批產(chǎn)品.有關(guān)基因工程技術(shù)表達純化的rh Tα1暫時還停留在實驗室水平,發(fā)酵規(guī)模從搖瓶至20 L發(fā)酵罐不等[8-9].本文采用基因工程技術(shù),構(gòu)建高效表達rh Tα1的表達菌株,在中試規(guī)模下,發(fā)酵表達并分離純化,獲得高純度、高活性的rh Tα1,為工業(yè)化規(guī)模生產(chǎn)打下基礎(chǔ).

1 材料和方法

1.1材 料

大腸桿菌(Escherichia coli)基因工程菌株TOP10/p Thio His A-Tα1由本實驗室構(gòu)建并保存;酵母提取物和蛋白胨為Oxoid公司產(chǎn)品,丙烯酰胺為Promega公司產(chǎn)品;Chelating Sepharose Fast Flow (CS)、Q Sepharose Fast Flow(QFF)、SOURCE 30RPC及Sephadex G-25 Medium(G-25)填料為GE公司產(chǎn)品;Tα1標準品(日達仙)購自SciClone公司;其他試劑均為國產(chǎn)分析純.

主要儀器:30和300 L全自動發(fā)酵罐,B.Braun Biotech公司;全溫振蕩器,哈爾濱東明醫(yī)療器械廠;離心機,Beckman公司;P2B005A01超濾膜,Millipore公司;Basic 100蛋白純化儀,GE公司;基質(zhì)輔助激光解吸電離/飛行時間質(zhì)譜儀(MALDI-TOF MS), Bruker公司;N端蛋白序列分析儀,日本島津公司.

1.2方 法

1.2.1rhTα1融合蛋白的發(fā)酵表達

取工程菌株TOP10/p Thio His A-Tα1,按1∶400(體積比,下同)接種至150 m L LB培養(yǎng)基,于1 L三角瓶中,37℃,200～250 r/min培養(yǎng)6～8 h為一級種;一級種子按1∶200接種至24 L LB培養(yǎng)基,于30 L種子罐中,37℃,200～250 r/min培養(yǎng)6～8 h為二級種.

二級種按1∶6接種到含150 L LB培養(yǎng)基的D300發(fā)酵罐中,37℃,溶氧量(DO)30%～60%(體積分數(shù))培養(yǎng);待菌液在600 nm下吸光度(OD600)達到3.0,將1.5 L含1 mmol/L異丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷(IPTG)的氮源(10%酵母粉+20%蛋白胨,質(zhì)量分數(shù))補料液以750 m L/h的流速補進發(fā)酵罐中誘導表達,過程中補加碳源(50%葡萄糖,質(zhì)量分數(shù))或2 mol/L NaOH以維持p H 7.0,誘導總時長約7 h.

1.2.2菌體收集和破碎

發(fā)酵完畢,離心收集菌體,菌體用p H 8.0的含20 mmol/L NaCl的50 mmol/L Tris-HCl緩沖液重懸后采用35 MPa高壓破碎2次;再用高速冷凍離心機以10℃,10 000 r/min離心40 min,獲得上清液.

1.2.3rhTα1融合蛋白的捕獲初步純化

離心上清液,上樣CS層析柱,采用p H 8.0的含20 mmol/L NaCl的50 mmol/L Tris-HCl緩沖液和p H 8.0的含20 mmol/L NaCl和50 mmol/L咪唑的50 mmol/L Tris-HCl緩沖液,以線性梯度方式洗脫目的蛋白,按峰收集目的樣.

1.2.4rhTα1融合蛋白的酶解

親和層析捕獲的rh Tα1融合蛋白,用截留分子質(zhì)量為5 ku的超濾膜(0.1 m2)濃縮,通過超濾將溶液替換成p H 8.0的含1 mmol/L CaCl2的50 mmol/L Tris-HCl緩沖體系,收集樣品,并調(diào)節(jié)質(zhì)量濃度至1 mg/m L;按摩爾比為1∶30(酶∶底物)的比例,加入腸激酶(EK)并混勻,4～8℃酶切16 h.

1.2.5rh Tα1的分離純化

取EK酶切后的樣品,首先通過CS層析柱初步純化,上樣至預先用p H 8.0的含20 mmol/L NaCl的50 mmol/L Tris-HCl緩沖液平衡的CS柱,根據(jù)214 nm的紫外檢測譜圖收集樣品.進一步應用QFF層析柱純化,將CS柱穿透樣上樣至預先用p H 8.0的含20 mmol/L NaCl的50 mmol/L Tris-HCl緩沖液平衡的QFF層析柱,用p H 8.0的含250 mmol/L NaCl 的50 mmol/L Tris-HCl緩沖液洗脫目的多肽.然后將經(jīng)QFF柱純化后的目的多肽通過SOURCE 30RPC層析柱進行精細純化,用流動相0.07%(體積分數(shù),下同)三氟乙酸、2.0%乙腈和流動相0.07%三氟乙酸、80.0%乙腈梯度洗脫,按峰收集目的多肽.再用QFF層析柱純化,采用p H 8.0的含400 mmol/L NaCl的50 mmol/L Tris-HCl緩沖液洗脫目的樣品,收集獲得rh Tα1.最后,精細分離純化后的樣品以不高于20%柱床體積上樣至G-25分子篩,用p H 7.0的10 mmol/L磷酸鈉緩沖液洗脫,收集目的樣;0.22μm過濾膜過濾除菌,分裝即得rh Tα1原液,-65℃以下凍存.

1.2.6rhTα1的純度檢測和理化性質(zhì)鑒定

參考脫E受體法[10]測定Tα1活性,顯微鏡下計數(shù)不少于200個淋巴細胞的玫瑰花環(huán),計算玫瑰花環(huán)形成率.rh Tα1融合蛋白發(fā)酵菌體誘導表達、菌體破碎及CS柱捕獲情況采用甘氨酸-十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(glycine-SDS-PAGE)檢測;rh Tα1的純度鑒定采用三甲基甘氨酸(tricine)-SDS-PAGE及高效液相色譜-排阻法(HPLC-SEC)分析檢測. Tricine-SDS-PAGE電泳的積層膠濃度為5%(質(zhì)量分數(shù),下同),間隙膠濃度10%,分離膠濃度16%;上樣量20μg,電壓80～160 V,考馬斯亮藍G250染色.用于HPLC-SEC分析的樣品稀釋至0.2 mg/m L,取50μL上樣(10μg),按面積歸一化法[11]計算其純度.

1.2.7rhTα1的氨基酸序列分析及分子質(zhì)量質(zhì)譜鑒定

采用Edman降解法[12]檢測rh Tα1的N末端15個氨基酸序列,檢測分析委托中國醫(yī)學科學院基礎(chǔ)醫(yī)學研究所中國協(xié)和醫(yī)科大學基礎(chǔ)醫(yī)學院中心實驗室進行,儀器為PE/ABI PROCISE 491測序儀,檢測程序為PL-PVDF-protein.

采用Bruker公司REFLEXTMⅢ型MALDI-TOF MS測定rh Tα1分子質(zhì)量;基質(zhì)為α-氰基-4-羥基肉桂酸(HCCA).

2 結(jié)果與分析

2.1rhTα1融合蛋白的發(fā)酵表達

不同誘導時間的發(fā)酵液進行取樣,掃描后取相同OD600的菌體,高溫破碎,15% glycine-SDS-PAGE檢測,結(jié)果見圖1(a).rh Tα1融合蛋白表觀分子質(zhì)量約為19ku,隨著誘導時間的延長,目的產(chǎn)物逐漸增加,誘導4 h后表達穩(wěn)定,隨著時間的延長可獲得更多生物量的積累.利用軟件Smart View2001分析計算得到細胞裂解蛋白中融合蛋白所占比例為40%(質(zhì)量分數(shù)).300 L發(fā)酵罐最終可獲得發(fā)酵液約190 L,離心可獲得3.3 kg菌體.

2.2菌體破碎

菌體破碎后進行g(shù)lycine-SDS-PAGE電泳檢測,結(jié)果見圖1(b).在高壓破碎的離心沉淀(泳道7,菌體高壓破碎的離心沉淀重懸后進行煮沸裂解)中無目標蛋白檢出,而破碎后上清(泳道8)中含有rh Tα1融合蛋白,證明細胞破碎完全,破碎條件合適.

2.3rhTα1融合蛋白的捕獲初步純化

通過基因工程設(shè)計與構(gòu)建,發(fā)酵表達的rh Tα1融合蛋白N末端帶有6個組氨酸(His),可特異地與CS層析填料結(jié)合,基于這個原理,采用CS層析填料來捕獲rh Tα1融合蛋白,并與其他蛋白或雜質(zhì)分離.含有rh Tα1融合蛋白的破碎上清通過CS層析柱后,rh Tα1融合蛋白特異地結(jié)合到層析柱上,而其他蛋白或雜質(zhì)則穿透或被沖洗去除,然后通過洗脫液洗脫獲得高純度的rh Tα1融合蛋白.

電泳檢測結(jié)果見圖1(b),從中可看出:CS柱穿透樣(泳道9)及層析柱清洗樣(泳道3)均為雜質(zhì);目的洗脫樣(泳道10)為高純度的rh Tα1融合蛋白.純化洗脫譜圖見圖2(a),結(jié)果顯示在該純化條件下,采用CS層析柱捕獲分離效果良好,可獲得高純度的rh Tα1融合蛋白.3.3 kg菌體破碎并經(jīng)親和層析捕獲后可獲得融合蛋白約33 g,由此推算每升發(fā)酵液可獲得目的蛋白173 mg,產(chǎn)量基本滿足工業(yè)化規(guī)模生產(chǎn).

圖1　rh Tα1融合蛋白發(fā)酵菌體誘導表達、菌體破碎及CS柱捕獲的glycine-SDS-PAGE檢測Fig.1 Glycine-SDS-PAGE analyses of induced expression, bacteria crushing of rh Tα1 fermentation strain and CS column capture of the rh Tα1 fusion protein

圖2　rh Tα1的分離純化層析譜圖Fig.2 Chromatographic spectra for isolation and purification of rh Tα1

2.4rhTα1融合蛋白的酶切

通過基因工程設(shè)計,表達的rh Tα1融合蛋白N末端的6個His純化標簽通過EK酶切識別氨基酸序列與rh Tα1連接,因此采用EK酶切rh Tα1融合蛋白以獲得rh Tα1.

EK酶切的rh Tα1融合蛋白tricine-SDS-PAGE檢測圖譜見圖3(a),由泳道1和泳道3可見,4～8℃酶切16 h后融合蛋白酶切效率達85%以上.

2.5rhTα1的純化

2.5.1rh Tα1的初步分離純化

rh Tα1融合蛋白經(jīng)EK酶切后,目的蛋白rh Tα1 與His純化標簽斷裂分開,因此采用CS層析柱結(jié)合His純化標簽,則穿透樣為rh Tα1.由于穿透樣品濃度低且體積大,不利于進行后續(xù)純化處理,因此采用QFF層析柱濃縮CS層析柱穿透樣品.因Tα1一級結(jié)構(gòu)中無含苯環(huán)的氨基酸,280 nm檢測收集樣品不靈敏,故改用214 nm.

CS及QFF層析柱純化洗脫譜圖分別見圖2(b) 和(c),電泳檢測圖譜見圖3(a).由圖可見:CS層析柱的穿透樣表觀分子質(zhì)量大于2.5 ku,為rh Tα1;經(jīng)QFF層析柱濃縮后,無明顯雜質(zhì).

2.5.2rh Tα1的精細分離純化

為了獲得高純度的rh Tα1,進一步采用反相分離技術(shù)分離去除rh Tα1的相關(guān)蛋白或雜質(zhì)后,再用QFF層析柱去除有機溶劑和濃縮目的樣品.純化洗脫譜圖見圖2(d)和(e),電泳檢測圖譜見圖3(b),由圖可見精細純化后再濃縮可獲得高純度的rh Tα1.

2.5.3rhTα1的原液制備

QFF層析柱精細純化后的rh Tα1用G-25分子篩脫鹽替換為p H 7.0的10 mmol/L磷酸鈉緩沖液,收集目的樣,其洗脫譜圖見圖2(f).由圖可見,目的樣品峰與電導率(cond)峰分離效果良好,脫鹽充分.G-25層析柱收集到的樣品用0.22μm過濾膜過濾除菌,分裝即得rh Tα1原液,-65℃以下凍存.

2.6rhTα1原液的活性、純度檢測及理化性質(zhì)鑒定

2.6.1rhTα1原液活性檢測

胸腺肽可使脫E受體后的胸腺T細胞恢復其E受體功能,從而反映胸腺肽的生物活性.參考脫E受體法[10]測定玫瑰花環(huán)增加率反映Tα1活性,結(jié)果見表1.自制rh Tα1的玫瑰花環(huán)增加率為50.0%,市售化學合成Tα1標準品(日達仙)的玫瑰花環(huán)增加率為53.3%,相比空白均有明顯提高;自制樣品花環(huán)增加率為標準品的95.5%,表明兩者活性相當.

圖3　rh Tα1分離純化樣品的tricine-SDS-PAGE檢測Fig.3 Tricine-SDS-PAGE analyses of isolation and purification of rh Tα1

表1　rh Tα1活性檢測Tab.1 Activety assay of rh Tα1　%

2.6.2rhTα1純度檢測

采用tricine-SDS-PAGE檢測rh Tα1的純度,結(jié)果如圖4所示.以市售Tα1標準品作為參照,分別控制上樣量5%,2%,1%(質(zhì)量分數(shù)),電泳結(jié)果表明:原液樣品中無可見雜蛋白,樣品的電泳純度大于99%.

圖4　rh Tα1原液樣品的tricine-SDS-PAGE檢測Fig.4 Tricine-SDS-PAGE analysis of purity of rh Tα1 product sample

采用HPLC-SEC進行樣品的關(guān)鍵純度檢測(圖5),結(jié)果顯示檢測樣品中rh Tα1的峰面積占總面積的99.84%,表明有關(guān)雜質(zhì)遠小于5%的注冊標準[13].

2.6.3rh Tα1鑒定

N端序列測定是蛋白質(zhì)及多肽一級結(jié)構(gòu)確認的重要組成部分,也是重組蛋白藥物質(zhì)量控制的必檢項目.經(jīng)測定rh Tα1樣品N端15個氨基酸序列為SDAAVDTSSEITTKD,與已知的rh Tα1 N端氨基酸序列一致.此外,用MALDI-TOF MS測定分子質(zhì)量,結(jié)果顯示原液樣品rh Tα1分子質(zhì)量為3 066.59 u(圖6),大小與去乙?；腡α1理論分子質(zhì)量(3 066 u)一致.

圖5　rh Tα1原液樣品的HPLC-SEC檢測圖Fig.5 HPLC-SEC analysis of purity of rh Tα1 product sample

圖6　MALDI-TOF MS測定rh Tα1分子質(zhì)量Fig.6 Identification of molecular weight of rh Tα1 by MALDI-TOF MS

3 討 論

目前常用的制備低分子質(zhì)量多肽的基因工程重組技術(shù)有2種:1)通過串聯(lián)多個目標基因來獲得高表達,雖然該方法已有較多成功例子,但是本實驗室嘗試使用4段或2段多肽串聯(lián)表達,結(jié)果均未成功獲得目的蛋白,因此放棄該方法;2)通過融合表達,其優(yōu)點是融合蛋白攜帶純化標簽,可通過親和層析高效獲得高純度的目的蛋白,大大簡化了下游純化工作,因此本實驗室采用第2種方法制備rh Tα1.

本方法主要分為3個階段:1)采用CS親和層析捕獲帶有純化標簽的目標蛋白,快速與細胞破碎后釋放的酶、核酸、菌體蛋白、內(nèi)毒素以及色素分離,有利于融合蛋白的穩(wěn)定;2)EK酶切后的蛋白首先用CS親和層析純化,存在于酶解混合物中的硫氧還蛋白以及少量未被酶解的融合蛋白,由于分子中仍存在His標簽序列被吸附于CS柱上,而酶解釋放出來的游離rh Tα1則出現(xiàn)在穿透樣中;3)將穿透目標樣品用QFF柱濃縮后,再經(jīng)RPC反相層析進行精細純化,用QFF柱再次濃縮后替換緩沖體系,即為rh Tα1純品.

樣品的活性檢測、純度分析及鑒定:參考脫E受體法測定活性,與市售標準品(日達仙)活性相當;用MALDI-TOF MS檢測rh Tα1分子質(zhì)量為3 066.59 u,與去乙酰化的Tα1理論分子質(zhì)量相符; rh Tα1樣品N端15個氨基酸序列為SDAAVDTSSEITTKD,鑒定結(jié)果與已知Tα1的N端氨基酸序列一致;SDS-PAGE檢測結(jié)果表明rh Tα1純度超過99%;HPLC-SEC檢測純度達99.84%,遠小于5%的注冊標準.

相關(guān)報道采用基因工程重組技術(shù)得到N端未乙?；腡α1,其全部化學性質(zhì)和體外生物活性與化學合成的Tα1及天然的Tα1相一致[14],本實驗室結(jié)論與其一致.用該方法生產(chǎn)Tα1比用化學合成生產(chǎn)的成本大為降低;與生化提取方法相比,又具有操作簡單、易于放大、工藝取材不受限制以及活性高等優(yōu)點.本研究方法可獲得高純度的rh Tα1,為其工業(yè)化生產(chǎn)提供了可靠的技術(shù)支持.

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Expression,Purification and Identification of Recombinant Human Thymosin-alpha 1 in Escherichia coli

YIN Fenghong1,2,XIAO Qingjiang2,ZHOU Weidong2,CHEN Qingxi1*
(1.School of Life Science,Xiamen University,Xiamen 361102,China; 2.Amoytop Biotechnique Company of Xiamen,Xiamen 361022,China)

Abstract:In the present study,expression,purification and identification of recombinant human thymosin-alpha 1(rh Tα1)in Escherichia coli were reported.Firstly,bacteria expressing the rh Tα1 fusion protein were utilized in the 300 L fermentator,and protein was induced by IPTG.Then,bacteria were harvested by centrifugation,and cell lysate was obtained using high pressure crushes.The crude protein was purified using the affinity chromatograghy,and the yield of the fusion protein was up to 170 mg per 1 L culture. Furthermore,the crude protein was processed by enterokinase(EK)proteolysis,affinity chromatography,reversed phase chromatography and exclusion chromatography to obtain the high purity of rh Tα1.SDS-PAGE and HPLC-RPC analysis indicated that rh Tα1 could reach the purity of more than 99%.Additionally,rosette formation assay demonstrated that the activity of rh Tα1 was quite similar to that of the commercial standard product.Molecular weight of rh Tα1 by MALDI-TOF MS was 3 066.59 u,which agreed with the theoretic result(3 066 u),and the analysis of N-terminal of rh Tα1 showed an accordance with the theoretic data,which all implied a potential for the industrialization of rh Tα1.

Key words:recombinant human thymosin-alpha 1(rh Tα1);expression;purification

*通信作者:chenqx@xmu.edu.cn

基金項目:國家高技術(shù)研究發(fā)展計劃(863)項目(2007AA021604)

收稿日期:2015-03-30 錄用日期:2015-05-07

doi:10.6043/j.issn.0438-0479.2016.02.008

中圖分類號:Q 356.1

文獻標志碼:A

文章編號:0438-0479(2016)02-0192-06

引文格式:尹鳳紅,肖清江,周衛(wèi)東,等.重組人胸腺肽α1在大腸桿菌中的表達純化與鑒定[J].廈門大學學報(自然科學版), 2016,55(2):192-197.

Citation:YIN F H,XIAO Q J,ZHOU W D,et al.Expression,purification and identification of recombinant human thymosinalpha 1 in Escherichia coli[J].Journal of Xiamen University(Natural Science),2016,55(2):192-197.(in Chinese)