維生素B6營養(yǎng)缺乏小鼠模型的構(gòu)建及其對生長、血糖的影響

沈珊齊++錢炳俊+++索庚++呂穎芳++趙艷云

摘要：以維生素B6正常、缺乏、恢復、增強型食物飼喂小鼠，以血漿中維生素B6主要形式磷酸吡哆醛水平為評價指標，以小鼠體質(zhì)量和血糖水平為考察因素，通過飲食營養(yǎng)缺乏構(gòu)建獲得維生素B6營養(yǎng)缺乏小鼠模型。結(jié)果表明，維生素B6營養(yǎng)缺乏小鼠血漿中磷酸吡哆醛未能檢測，恢復組小鼠血漿中磷酸吡哆醛水平（215.67 pg/mL）得到較大的恢復，與對照組（157.00 pg/mL）之間沒有顯著性差異（P>0.05）；且維生素B6營養(yǎng)增強組小鼠血漿中磷酸吡哆醛水平（341.67 pg/mL）顯著高于其他各組（P<0.05）；維生素B6營養(yǎng)缺乏4周后小鼠平均體質(zhì)量（15.62 g）顯著低于維生素B6正常小鼠（18.31 g），補充維生素B6后小鼠體質(zhì)量迅速恢復；同時，缺乏期維生素B6營養(yǎng)缺乏小鼠的空腹血糖水平始終低于正常小鼠，補充維生素B6后其水平恢復緩慢。

關鍵詞：維生素B6；缺乏模型；小鼠；生長；血糖

中圖分類號：S852.21文獻標志碼：A文章編號：1002-1302（2016）02-0266-03

收稿日期：2014-10-13

基金項目：上海市自然科學基金（編號：11ZR1416200）。

作者簡介：沈珊齊（1989—），女，湖北荊州人，碩士研究生，主要從事食品營養(yǎng)、保藏與加工研究。Tel：（021）34206613；E-mail：asd@sjtu.edu.cn。

通信作者：錢炳俊，博士，助理研究員，主要從事食品營養(yǎng)研究。Tel：（021）34206613；E-mail：bjqianfd@sjtu.edu.cn。維生素B6是一種水溶維生素，包括吡哆醇（pyridoxine，PN）、吡哆醛（pyridoxal，PL）和吡哆胺（pyridoxamine，PM ）3種形式，活化形式主要是5-磷酸吡哆醛（Pyridoxal 5′-phosphate，PLP ）。它是維持人體生理功能必需的微量營養(yǎng)素，以輔酶形式參與糖、蛋白質(zhì)和脂肪酸的正常代謝，并與白細胞、血紅蛋白的合成相關。近年來研究還顯示，維生素B6有一定的抗氧化能力，能夠清除氧自由基[1]。在生活中，維生素B6的攝入常被忽視，維生素B6缺乏在中國人群中比較普遍，2012年深圳市居民膳食結(jié)構(gòu)調(diào)查顯示，人們對核黃素、硫胺素、維生素B6、葉酸和鈣等微量元素攝入量偏低，其中維生素B6缺乏最為嚴重，僅為推薦攝入量的16%[2-3]。維生素B6缺乏雖然不會直接造成嚴重癥狀，但會導致虛弱、失眠、神經(jīng)紊亂、唇干裂、舌炎、口腔炎、動脈硬化、貧血以及細胞介導免疫損壞等一系列容易被忽視的慢性健康問題。通常，維生素B6亦是糖代謝、氨基酸和DNA合成不可或缺的輔酶[4]，對人體生長發(fā)育具有重要的影響。因此，闡述維生素B6對人體免疫等生理功能的影響的分子機制，獲得其營養(yǎng)缺乏型的小鼠模型尤為重要。本研究采用自建配方，手工烘焙加工維生素B6正常、缺乏、恢復、增強型小鼠飼料，通過4周的缺乏飼喂和4周的恢復飼喂試驗，以血漿中維生素B6活化形式磷酸吡哆醛水平為評價指標，以小鼠體重和血糖水平為考察因素，通過飲食營養(yǎng)缺乏構(gòu)建獲得維生素B6營養(yǎng)缺乏小鼠模型，進一步豐富維生素B6在生理功能調(diào)節(jié)中作用的理論。

1材料與方法

1.1材料

正常雄性3周齡Blab/c小鼠28只購自上海史萊克動物中心。

1.2試劑

飼料中的蔗糖、鹽、植物油等均為食品級，購自歐尚超市，纖維素購自阿拉?。ㄔ噭┥虾Ｓ邢薰?，維生素A、D、E、B1、B2、B6、B16購自上海信誼藥業(yè)有限公司，煙酸和泛酸來自上海捷瑞生物技術有限公司，硒和微生素選用美國斯旺森公司保健品，礦質(zhì)元素為相應化學純試劑。強生穩(wěn)豪型血糖試紙（ONETOUCH Ultra Test Strips）購自強生公司，標準品磷酸吡哆醛購自美國Sigma公司。

1.3方法

1.3.1試驗設計將28只雄性3周齡BALB/c小鼠隨機分為2組：缺乏組（21只）和對照組（7只）。分別采用維生素B6缺乏和正常的自制飼料飼喂4周。然后，將缺乏組隨機再分為3組：缺乏組、恢復組和增強組，每組7只，分別采用維生素B6缺乏、正常、增強的自制飼料繼續(xù)飼喂4周，對照組喂完全飼料，構(gòu)建維生素B6缺乏小鼠模型。

1.3.2維生素B6缺乏飼料的配制參照Miller等試驗配方[5-7]和國家標準GB 14924.3—2001《實驗動物小鼠大鼠配合飼料》，在小鼠飼料基本營養(yǎng)構(gòu)成的基礎上，根據(jù)飼料成品的特性，對飼料中的成分比例進行調(diào)整，添加了淀粉，最終形成的配方見表1。

除維生素B6外，其他礦物質(zhì)和維生素組成則參照國家標準GB 14924.3—2001《實驗動物小鼠大鼠配合飼料》，具體見表2和表3。水溶性維生素片研磨成粉末后，溶解于水中；化學級礦物質(zhì)試劑原料稱量后溶解于水中。在蛋白、糖、油等組要成分按比例混合后，加入適當比例維生素水和礦物質(zhì)水，加入適量脂溶性維生素，同時加入各組對應的維生素B6的量，補充一定水分，捏成面團，分割成直徑1 cm的粗棒狀或者長圓柱形的顆粒，微波加熱，淀粉糊化后冷卻成型，每日早上投喂。由于水溶性維生素加熱易分解，在飲用水也按照相同配方添加水溶性維生素，定時定量補充。

小鼠飼養(yǎng)在上海交通大學實驗動物中心完成，飼養(yǎng)環(huán)境條件為：光照/黑暗時間為12 h/12 h，溫度（24±1） ℃，濕度（60±5）%。

1.3.3小鼠生長指標的測定小鼠飼養(yǎng)期間，每周四下午對所有小鼠進行稱質(zhì)量，比較不同組小鼠質(zhì)量變化。

1.3.4小鼠血糖的測定小鼠飼養(yǎng)期間，每周五上午投喂飼料前，尾部取血，采用強生血糖儀（強生穩(wěn)豪倍易型血糖儀）配合強生試紙測定空腹血糖。

1.3.5小鼠血漿磷酸吡哆醛水平分析飼喂8周后，參考Miduttun等對B族維生素的測定方法[8]，使用液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜（LC/MS/MS）分析小鼠血漿中維生素B6活化形式磷酸吡哆醛含量。儀器采用上海交通大學分析測試中心的超高效液相色譜（ACQUITY UPLC system，MA，USA）串聯(lián)三段四級質(zhì)譜儀（AB SCIEX，Toronto，Ontario，Canada）。

采樣：每組小鼠取3個平行，毛細管眼眶取血，冰上保存，1 h內(nèi)2 000 g、4 ℃離心10 min，取上清。樣品的前處理：60 μL 血樣加入等體積三氯乙酸（TCA，60 g/L），冰上混合 1 h，5 800 g、4 ℃離心15 min。轉(zhuǎn)移上清至新的EP管中，氮吹吹干后100 μL甲醇定容。

色譜條件如下，色譜柱：Agilent Zorbax SB-C18。測定離子對：246.00/97.00。流動相：組分A，650 mmol/L 乙酸；組分B，100 mmol/L七氟丁酸溶解于流動相A；組分C，90%乙腈。流速，1.3 mL/min。標準品用甲醇溶解，配制100 ng/mL，半數(shù)稀釋制作標準曲線。得到R2=0.997 5，0.304～100 ng/mL的檢測限。

2結(jié)果與分析

2.1不同處理小鼠生長水平差異

由圖1可見，飼養(yǎng)初期，各組小鼠體質(zhì)量基本一致。飼養(yǎng)3周，缺乏組各組小鼠體質(zhì)量都顯著低于對照組小鼠（P<005），第4周繼續(xù)保持該趨勢。當恢復組和增強組小鼠恢復維生素B6補充后，小鼠體質(zhì)量迅速增長，接近對照組水平。此時，缺乏組小組體質(zhì)量仍然顯著低于其他各組。維生素B6增強飼養(yǎng)2周后，增強組體質(zhì)量高于恢復組，但差異不明顯。最后2周，恢復組和增強組小鼠體質(zhì)量基本沒有差別，略低于對照。說明補充日常所需維生素B6即可以滿足生長需求，迅速恢復生長水平。

2.2維生素B6缺乏對小鼠血糖的影響

由圖2可見，試驗初期，維生素B6缺乏組小鼠空腹血糖水平低于正常的對照組小鼠。第2周時，這種現(xiàn)象最為明顯，對照組小鼠的空腹血糖水平顯著高于其他各組小鼠。整個試驗期，維生素B6缺乏小鼠的平均血糖水平都低于對照組。當缺乏小鼠開始補充維生素B6時1周（試驗第5周），可以看到，其他各組小鼠平均空腹血糖水平仍低于對照組。但之后的6～8周，增強組小鼠空腹血糖水平始終略高于對照組，恢復組小鼠與對照組基本一致，只有缺乏組小鼠平均空腹血糖水平始終低于其他各組?？梢姡S生素B6對于機體維持空腹血糖水平有一定影響，缺乏后再補充可逐漸回復正常水平。

2.3維生素B6缺乏對血漿中PLP的影響

PLP是體內(nèi)維生素B6水平的重要指標。圖3結(jié)果顯示，在維生素B6缺乏飲食小鼠中，PLP沒有檢測到。其他3組，PLP含量從大到小依次為增強組（341.67 pg/mL）>恢復組（215.67 pg/mL）>對照組（157.00 pg/mL），表明在4周的恢復期后，小鼠體內(nèi)的維生素B6水平得到了很好的恢復，甚至是伴隨大劑量增強得到提升。但是，10倍增強的飲食并未在PLP水平上體現(xiàn)出相應的放大倍數(shù)。同時，恢復組的小鼠血漿中PLP水平表現(xiàn)要優(yōu)于對照組。結(jié)果表明維生素B6缺乏后，補充日常飲食建議維生素B6劑量即可。

3結(jié)論與討論

由于維生素B6是碳水化合物、脂肪、蛋白質(zhì)代謝的重要輔酶，維生素B6對機體健康生長有重要影響。早在1945年，對維生素B6進行飼喂研究發(fā)現(xiàn)，維生素B6缺乏小鼠體質(zhì)量會低于正常小鼠[5]。近期Doke等的研究也顯示維生素B6缺乏會影響組織生長[6]。本試驗也發(fā)現(xiàn)維生素B6缺乏小鼠體質(zhì)量顯著低于正常小鼠，這與Lewicka等研究認為補充維生素B6可以顯著增加大鼠的體質(zhì)量[9]類似。Huge等研究也發(fā)現(xiàn)缺乏維生素B6會導致大鼠的生長率比正常飲食低一半[10]，而本研究則進一步闡明，缺乏維生素B6導致的生長緩慢，是可以通過及時補充日常所需的維生素B6得到迅速改善的。

碳水化合物代謝在2種類型的糖尿病中都有重要影響。血糖主要由胰島素調(diào)控。維生素B6的缺乏會導致胰腺和血循環(huán)中的胰島素量減少[11]?？崭寡堑乃街饕梢苑从骋葝u素對血糖的調(diào)節(jié)作用。空腹血糖量越低，表明胰島素對血糖的調(diào)節(jié)能力減弱，胰島素功能下降。維生素B6可能對血糖調(diào)節(jié)有影響。Solomon等研究表明補充吡哆醇可以降低鏈霉素引起的糖尿病動物的血糖水平[12]；在高血糖癥的情況下，磷酸吡哆醛和總的維生素B6及其衍生物水平也會顯著下降[13]；在機理上，Toyota等的研究則顯示，維生素B6缺乏小鼠胰島素B細胞的功能會退化[14]?？梢钥吹皆谌狈ζ?，缺乏維生素B6的小鼠空腹血糖含量普遍低于對照組。維生素B6缺乏小鼠胰島素調(diào)節(jié)能力下降。

維生素B6缺乏小鼠血液循環(huán)中磷酸吡哆醛缺失，體質(zhì)量生長變緩，血糖調(diào)節(jié)能力下降，試驗采取的飼料和飼養(yǎng)方法可以有效得到維生素B6缺乏小鼠模型。在維生素B6長期缺乏的情況下，繼續(xù)缺乏、恢復維生素B6供應、10倍增強維生素B6可以補充每日飲食所需的維生素B6，就能逐漸恢復正常生長和提高血糖調(diào)節(jié)能力。

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