人參銹腐病及疫病生防放線(xiàn)菌篩選

張鴻雁++劉勇++任勇洋

摘要：為獲得對(duì)人參銹腐病、疫病具有拮抗活性的土壤放線(xiàn)菌，利用平板稀釋培養(yǎng)法從黑龍江省人參基地和西北地區(qū)分離獲得578株放線(xiàn)菌，用瓊脂塊法初篩，用生長(zhǎng)速率法、懸滴法對(duì)抑菌效果較好的菌株進(jìn)行抑菌活性復(fù)篩。結(jié)果獲得5株對(duì)病原菌具有顯著拮抗性的生防放線(xiàn)菌，其中Act11、Act12菌株的拮抗效果尤為顯著，Act12最大抑菌圈直徑達(dá)20.15 mm，其發(fā)酵液對(duì)病原菌菌絲的抑制率最大為83.4%，對(duì)人參銹腐病孢子萌發(fā)抑制率最高為 99.8%。

關(guān)鍵詞：人參；生防放線(xiàn)菌；篩選；誘腐?。灰卟?/p>

中圖分類(lèi)號(hào)： S435.675文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A文章編號(hào)：1002-1302（2016）02-0173-04

收稿日期：2015-03-20

基金項(xiàng)目：黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)博士啟動(dòng)基金（編號(hào)：XDB2015-17）。

作者簡(jiǎn)介：張鴻雁（1970—），女，黑龍江寶清人，博士，教授，研究方向?yàn)槲⑸镔Y源與利用。E-mail：zhy2219@163.com。人參根系病害包括根腐病、銹腐病、立枯病、疫病、菌核病等，其中銹腐病、疫病危害嚴(yán)重。人參根系病害雖可以采用農(nóng)藝措施預(yù)防[1-2]，但目前主要通過(guò)化學(xué)農(nóng)藥防治[3]，該方法會(huì)造成人參藥用部分農(nóng)藥大量殘留，嚴(yán)重影響人體健康及療效。因此，利用生物技術(shù)防治人參根系病害較之于其他作物更為重要，是保證人參藥材安全性的必要措施。生物制劑具有施用安全、不污染環(huán)境、不產(chǎn)生抗性等優(yōu)點(diǎn)，具有良好的應(yīng)用前景。目前國(guó)內(nèi)外關(guān)于人參根系病害的生物防治研究主要集中在生防細(xì)菌[4]、生防真菌方面[5]，對(duì)生防放線(xiàn)菌研究的報(bào)道較少。放線(xiàn)菌作為抗生素的主要產(chǎn)生菌，在自然界中分布廣泛，產(chǎn)生活性物質(zhì)的能力強(qiáng)，活性物質(zhì)種類(lèi)多，是值得關(guān)注的生防菌資源。本研究篩選對(duì)人參銹腐病、疫病病原菌有拮抗作用的生防放線(xiàn)菌，旨在為人參根系病害生物防治提供有較強(qiáng)拮抗作用的放線(xiàn)菌菌株。

1材料與方法

1.1材料

1.1.1供試菌株供試病原菌共 5 株，分別為人參銹腐病菌3.3591（Cylindrocarpon destructans 3.359 1，以下簡(jiǎn)稱(chēng)3.3591），人參銹腐病菌R2（以下簡(jiǎn)稱(chēng)R2），西洋參銹腐病菌81782（C. destructans 81782，以下簡(jiǎn)稱(chēng)81782），西洋參銹腐病菌81783（C. destructans 81783，以下簡(jiǎn)稱(chēng)81783），西洋參惡疫霉81805（Phytophthora cactorum 81805，以下簡(jiǎn)稱(chēng)81805）。其中81782、81783 為相同病原菌的不同菌株，選用不同菌株的目的是研究不同生防放線(xiàn)菌對(duì)同一菌種不同菌株抑制作用的差別。供試放線(xiàn)菌共578株，其中408株分離自黑龍江省鐵力市桃山鎮(zhèn)人參土壤，170株篩選自青海、西藏、新疆等地區(qū)土壤的拮抗放線(xiàn)菌，由西北農(nóng)林科技大學(xué)微生物資源研究室提供。

1.1.2培養(yǎng)基用馬鈴薯蔗糖瓊脂培養(yǎng)基（PDA）分離、純化、活化、保存病原菌。用高氏1號(hào)瓊脂培養(yǎng)基（GA）活化、拮抗性瓊脂塊制備培養(yǎng)放線(xiàn)菌。用GA液體培養(yǎng)基制備放線(xiàn)菌發(fā)酵液。

1.2方法

1.2.1皿內(nèi)拮抗性篩選平皿初篩采用瓊脂塊法[6]。將制備好的病原菌菌懸液均勻涂布于PDA平板上，用打孔器從培養(yǎng)7 d的待篩放線(xiàn)菌平皿中打取直徑5 mm的放線(xiàn)菌瓊脂塊，正置于PDA平板上，28℃培養(yǎng)5～7 d，測(cè)定抑菌圈直徑及抑菌圈透明度。皿內(nèi)復(fù)篩：將初篩得到的具有良好拮抗效果的放線(xiàn)菌菌株進(jìn)行2次皿內(nèi)拮抗復(fù)篩，方法同皿內(nèi)初篩。計(jì)算不同抑菌程度的拮抗菌占供試放線(xiàn)菌的比例（S）和占拮抗放線(xiàn)菌的比例（A）。根據(jù)拮抗環(huán)寬度、透明度、放線(xiàn)菌產(chǎn)孢量，挑選出有應(yīng)用價(jià)值的拮抗菌。

S=不同抑菌程度拮抗菌株數(shù)供試放線(xiàn)菌株數(shù)×100%；

A=不同抑菌程度拮抗菌株數(shù)供試拮抗放線(xiàn)菌株數(shù)×100%。

1.2.2無(wú)菌發(fā)酵濾液抑菌率測(cè)定無(wú)菌發(fā)酵濾液制備：將供試放線(xiàn)菌以一定比例接種到液體培養(yǎng)基中，28℃、150 r/min搖床振蕩培養(yǎng)9 d。將發(fā)酵液4 000 r/min離心5 min后，用0.45 μm滅菌微孔濾膜過(guò)濾除菌，得無(wú)菌濾液。

采用生長(zhǎng)速率法[7]測(cè)定相對(duì)抑菌率。將濾液與冷卻至40℃左右的PDA培養(yǎng)基按體積比1 ∶4混勻倒平板，以同比例加入無(wú)菌水的PDA培養(yǎng)基為對(duì)照。用5 mm打孔器分別打取5株病原菌菌餅，置于PDA平板中央，每個(gè)處理3次重復(fù)，25℃培養(yǎng)7 d，定時(shí)測(cè)量菌落直徑，計(jì)算相對(duì)抑菌率（X）。

抑菌率（X）=（對(duì)照菌落直徑-5）-（處理菌落直徑-5）對(duì)照菌落直徑-5。

1.2.3無(wú)菌發(fā)酵濾液對(duì)病原菌孢子萌發(fā)的影響病原菌孢子懸液制備：將活化好的病原菌接種到PDA培養(yǎng)基上，28℃培養(yǎng)6～9 d，加入無(wú)菌水沖洗孢子至50 mL三角瓶中，用血球計(jì)數(shù)板測(cè)數(shù)，制得濃孢子懸液。按發(fā)酵液、無(wú)菌水體積比分別為1 ∶2、1 ∶3、1 ∶4、1 ∶5配制不同濃度的發(fā)酵濾液；加入病原菌孢子，使孢子濃度約為10億個(gè)/mL，每個(gè)處理3 次重復(fù)。25℃培養(yǎng)，用懸滴法[8]測(cè)定孢子萌發(fā)率。計(jì)算孢子萌發(fā)率（R）、抑制率（I）。

萌發(fā)率（R）=萌發(fā)孢子數(shù)總孢子數(shù)×100%；

抑制率（I）=（對(duì)照萌發(fā)率-處理萌發(fā)率）對(duì)照萌發(fā)率×100%。

1.2.4生防放線(xiàn)菌對(duì)病原菌菌絲的作用采用對(duì)峙培養(yǎng)法[9]測(cè)定菌絲相互作用。用特制金屬“U”形鏟在PDA平板兩側(cè)挖約0.5 cm寬的小槽，在小槽一側(cè)先接種放線(xiàn)菌，28℃培養(yǎng)4 d后在小槽另一側(cè)接種病原菌，然后在小槽上放置無(wú)菌蓋玻片，28℃繼續(xù)培養(yǎng)4 d，取出蓋玻片，于40倍顯微鏡下觀察菌絲間的相互作用。

2結(jié)果與分析

2.1放線(xiàn)菌對(duì)病原菌的皿內(nèi)拮抗作用

從578 株生防放線(xiàn)菌中篩選到134株具有廣譜拮抗性的放線(xiàn)菌，其中來(lái)自西北地區(qū)土壤的菌株58株，占供試放線(xiàn)菌的10.0%，占廣譜拮抗菌的43.3%；來(lái)自人參基地的菌株76株，占供試放線(xiàn)菌的13.1%，占全部拮抗菌的56.7%。

試驗(yàn)表明，在134株拮抗菌中，對(duì)5株病原菌81782、81783、3.3591、R2、81805的皿內(nèi)抑菌圈≥20 mm，且抑制圈透明的放線(xiàn)菌分別有11、14、6、9、21株，分別占全部拮抗菌總數(shù)的8.2%、10.4%、4.5%、6.7%、15.7%。由表1可見(jiàn)，對(duì)5株病原菌拮抗性強(qiáng)的菌株（抑菌圈≥15 mm）分別為38、40、40、33、67株，占全部廣譜拮抗菌的28.4%、29.9%、29.9%、24.6%、50.0%。從表1還可見(jiàn)，篩選出的拮抗菌對(duì)81805的拮抗性最強(qiáng)，對(duì)R2的拮抗作用最弱。

從表1可見(jiàn)，在篩選到的 134 株具有廣譜拮抗性的放線(xiàn)菌中，對(duì)西洋參銹腐病菌同一菌種不同菌株81782、81783而言，拮抗性強(qiáng)和無(wú)抗性放線(xiàn)菌在拮抗放線(xiàn)菌總數(shù)中所占比例相當(dāng)，分別為28.4%、29.9%和3.0%、5.2%。說(shuō)明同一拮抗菌對(duì)同一病原菌的不同菌株拮抗性略有差異。

表1中，從來(lái)源于黑龍江省人參產(chǎn)區(qū)的76株廣譜拮抗菌對(duì)5株病原菌的拮抗性看，對(duì)81805拮抗性強(qiáng)的菌株最多（26.1%），其次是81782（20.1%）、81783（19.4%），對(duì)分離自黑龍江省人參產(chǎn)區(qū)的毀滅柱孢菌R2 抗性強(qiáng)的拮抗菌最少（14.2%），但對(duì)該菌具有中等拮抗性的放線(xiàn)菌最多（25.4%）。

經(jīng)初篩，有9株拮抗菌拮抗作用較強(qiáng)，分別為來(lái)源于黑龍江省人參產(chǎn)區(qū)土壤的6株拮抗菌114、184-3、224、15-2、23-2、110-2和來(lái)源于西北地區(qū)土壤的3株拮抗菌Act11、Act12、Act1。9株拮抗菌對(duì)5株病原菌的抑制作用均很強(qiáng)，且拮抗環(huán)完全透明、產(chǎn)孢量較高。

2.29株放線(xiàn)菌無(wú)菌發(fā)酵濾液對(duì)供試病原菌的抑制作用

從表2可見(jiàn)，9株生防菌無(wú)菌發(fā)酵濾液對(duì)5株病原菌均有抑制作用，即均能產(chǎn)生抗菌物質(zhì)，抑制病原菌生長(zhǎng)，其中來(lái)源于黑龍江省人參產(chǎn)區(qū)土壤的114、184-3、224和來(lái)源于西北地區(qū)土壤的Act11、Act12抑菌效果表現(xiàn)突出。

從表2可見(jiàn)，7 d時(shí)9株拮抗放線(xiàn)菌對(duì)81782、81783的抑制效果相當(dāng)，抑菌率分別為14.9%～57.0%和16.6%～54.2%，其中114、184-3、224、Act11、Act12菌的抑菌效果較好。7 d 時(shí)9株拮抗放線(xiàn)菌對(duì)人參銹腐病菌3.3591的抑制率為16.6%～64.2%，其中Act11、114、Act12菌的抑菌效果較好，Act12放線(xiàn)菌在6 d時(shí)的抑菌率達(dá)69.4%。7 d 時(shí)9株拮抗放線(xiàn)菌對(duì)毀滅柱孢菌R2的抑制率為7.8%～66.9%，Act12、Act11、114、184-3、224菌的抑制效果較好；在5 d時(shí)，184-3菌的抑菌率為80.9%。7 d 時(shí)9株拮抗菌對(duì)81805的抑制效果優(yōu)于其他4株病原菌，抑菌率為31.4%～73.4%，Act12菌在6 d時(shí)的抑菌率為83.4%。

2.3無(wú)菌發(fā)酵濾液對(duì)病原菌孢子萌發(fā)率的影響

率達(dá)到65%以上，其中Act11、Act12菌對(duì)81782孢子和224、Act11菌對(duì)81783孢子萌發(fā)的抑制作用較強(qiáng)。在發(fā)酵液、無(wú)菌水體積比為1 ∶2時(shí)，Act11、Act12菌對(duì)81782孢子萌發(fā)的抑制率分別為80.9%、89.3%，224、Act11菌對(duì)81783孢子萌發(fā)的抑制率分別為90.9%、90.7%。110-2、15-2菌的抑制能力最差，在發(fā)酵液、無(wú)菌水體積比為1 ∶5時(shí)，這2株菌還有促進(jìn)81782孢子萌發(fā)的作用。

從表3可見(jiàn)，114、184-3、224、Act11、Act12菌對(duì)人參銹腐病菌3.3591、毀滅柱孢菌R2孢子萌發(fā)的抑制率達(dá)到65%以上。這5株拮抗菌發(fā)酵液對(duì)3.3591、R2的拮抗能力超過(guò)81782、81783。其中Act11、Act12菌的抑制作用最強(qiáng)，在發(fā)酵液、無(wú)菌水體積比為1 ∶2時(shí)，Act12放線(xiàn)菌對(duì)3.3591、R2孢子萌發(fā)的抑制率分別達(dá)98.0%、99.8%。對(duì)于病原菌81805，孢子萌發(fā)的抑制率強(qiáng)的菌株同其他4株病原菌，在發(fā)酵液、無(wú)菌水體積比為1 ∶2時(shí)，Act11菌的抑制率為97.1%，Act12、184-3、114抑制率分別為87.7%、87.4%、87.4%。

3結(jié)論與討論

針對(duì)人參根部病害的生物防治研究集中于細(xì)菌、真菌，有關(guān)放線(xiàn)菌的研究較少，且現(xiàn)有放線(xiàn)菌研究主要在韓國(guó)及吉林省人參產(chǎn)區(qū)進(jìn)行，尚未見(jiàn)黑龍江省人參產(chǎn)區(qū)銹腐病及疫病生防放線(xiàn)菌的研究。Shim 等從韓國(guó)人參土壤中分離出3株鏈霉菌（S. variabilis、S. virgincae、S.grisedus），發(fā)現(xiàn)其對(duì)人參銹腐病菌有拮抗作用[10]。周淑香等從吉林省人參根際土壤中篩選到2 株對(duì)人參銹腐菌均有較強(qiáng)抑制作用的放線(xiàn)菌，施用該放線(xiàn)菌后人參銹腐病病情指數(shù)顯著降低，防治效果達(dá)40%以上，人參產(chǎn)量比對(duì)照有所增加，對(duì)參根成活率、株高和莖粗影響不顯著[11]。馬廷會(huì)從吉林省人參地篩選到對(duì)銹腐病有拮抗性的放線(xiàn)菌菌株MS32，抑菌率為76.45%，并對(duì)其進(jìn)行了發(fā)酵條件研究和菌株鑒定，認(rèn)為其可能是S. naraensi[12]。

本研究篩選出5株生防放線(xiàn)菌，對(duì)人參根系病害病原菌表現(xiàn)出良好的拮抗性，其中Act12、Act12放線(xiàn)菌的拮抗效果尤為明顯，其他3株生防放線(xiàn)菌對(duì)病原菌也表現(xiàn)出一定拮抗性。

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