不同外植體及激素組合對貼梗海棠愈傷組織誘導(dǎo)的影響

賈曉梅++周悅++曹柳青++黃璞璐

摘要：以當(dāng)年生幼嫩枝條、2～3年生枝條的葉片為試驗(yàn)材料，分別采用0.1%HgCl2溶液、2%NaClO溶液進(jìn)行消毒處理，運(yùn)用對比試驗(yàn)的方法進(jìn)行貼梗海棠愈傷組織的誘導(dǎo)研究，結(jié)果表明，誘導(dǎo)愈傷組織的最適外植體為葉片，最適培養(yǎng)基為MS+0.5 mg/L 6-BA+0.3 mg/L NAA。

關(guān)鍵詞：貼梗海棠；外植體；激素組合；愈傷組織；誘導(dǎo)

中圖分類號： S685.990.4+3文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A

文章編號：1002-1302（2016）02-0054-02

收稿日期：2015-03-31

基金項(xiàng)目：河北省高等學(xué)?？茖W(xué)技術(shù)研究項(xiàng)目（編號：Z2013008）；保定學(xué)院本科教學(xué)工程建設(shè)項(xiàng)目（編號：20120205、Xk20130601）；保定學(xué)院科研基金（編號：2012Z08）；保定學(xué)院科研團(tuán)隊(duì)（編號：KYTD2013001）；河北省科技計(jì)劃（編號：15227527）。

作者簡介：賈曉梅（1978—），女，碩士，副教授，主要從事植物生理和生物技術(shù)研究。E-mail：jxmqiang@aliyun.com。

貼梗海棠[Chaenomeles speciosa（Sweet）Nakai]是薔薇科木瓜屬植物，為落葉灌木，耐旱、喜光、耐寒，抗逆性極強(qiáng)。其花色艷麗，氣味芳香，被廣泛應(yīng)用于城鄉(xiāng)綠化、庭院美化；其果實(shí)別稱皺皮木瓜，富含多種營養(yǎng)成分[1]，為常用中藥，可舒筋活絡(luò)、驅(qū)風(fēng)止痛[2]；其葉片具有抗氧化和保肝功效[3]?？梢?，貼梗海棠是一種具有多用途的優(yōu)良園林綠化植物。

貼梗海棠的繁殖多采用傳統(tǒng)的種子繁殖和無性繁殖（扦插、嫁接、壓條等）[4]。為提高貼梗海棠的品質(zhì)，部分學(xué)者已對其育苗[5]、花期調(diào)控[6]、嫁接技術(shù)[7]、栽培管理[8]等方面進(jìn)行了研究；為突破繁殖材料的數(shù)量限制、加快推廣速度，部分學(xué)者已將組織培養(yǎng)技術(shù)應(yīng)用于貼梗海棠的快速繁殖[9-10]，初步建立了快繁體系，但關(guān)于貼梗海棠愈傷組織培養(yǎng)的研究鮮有報道。通過研究不同外植體和激素組合對其愈傷組織誘導(dǎo)的影響，以期為貼梗海棠的遺傳轉(zhuǎn)化育種開辟一條有效途徑，為該品種的開發(fā)和推廣奠定技術(shù)基礎(chǔ)。

1材料與方法

1.1試驗(yàn)材料

試驗(yàn)材料由三禾苗圃提供，取貼梗海棠當(dāng)年生幼嫩枝條、2～3年生枝條的葉片為外植體。

1.2試驗(yàn)方法

1.2.1材料消毒將新生幼嫩枝條用加入少量皂粉的自來水浸泡30 min，再用自來水沖洗1.0～1.5 h，去除肉眼可見的灰塵及其他雜質(zhì)。在無菌操作臺內(nèi)，將試驗(yàn)材料用75%乙醇消毒30 s后分為兩半，一半轉(zhuǎn)入0.1% HgCl2溶液中浸泡7～8 min，再用無菌水沖洗3～4次；另一半轉(zhuǎn)入2% NaClO溶液中浸泡15 min，再用無菌水沖洗3～4次。將消毒后的材料置于無菌濾紙上，吸干接種材料表面的多余水分。將葉片切成0.5 cm2的小塊，或在完整葉片上劃出網(wǎng)格狀傷口，嫩莖、幼芽的長度均為0.5～1.0 cm，分別接種于誘導(dǎo)愈傷培養(yǎng)基上。每種外植體分別在各體積分?jǐn)?shù)梯度激素的培養(yǎng)基上接種10瓶，葉片每瓶接種4塊，莖段每瓶接種4段，幼芽每瓶接種3個。

1.2.2培養(yǎng)基以MS為基本培養(yǎng)基，附加不同種類激素體積分?jǐn)?shù)配比組成的9種培養(yǎng)基（表1）。培養(yǎng)基均附加蔗糖 30 g/L、瓊脂8 g/L，pH值為5.8，培養(yǎng)溫度為（25±2） ℃，光照度為2 000 lx，每天光照8 h。

2結(jié)果與分析

2.1不同消毒方法對污染率的影響

在對外植體的消毒過程中，分別選用2% NaClO溶液、0.1% HgCl2溶液進(jìn)行消毒處理。由表2可知，選用0.1% HgCl2溶液進(jìn)行浸泡消毒的外植體污染率遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于選用2% NaClO溶液消毒的外植體，2% NaClO溶液處理后污染率均在10%及以上，而0.1% HgCl2溶液處理后消毒效果明顯改善，葉片、莖段、幼芽污染率分別為2.5%、2.5%、0。

2.2不同處理方式對誘愈結(jié)果的影響

由表3可知，在誘愈培養(yǎng)基上接種20 d后，通過誘導(dǎo)過程發(fā)現(xiàn)劃有網(wǎng)格狀傷口的全葉外植體出愈率（22%）遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于切成小塊的葉片外植體（67%）， 故將經(jīng)過處理的全葉外植

2.3不同激素組合對莖段愈傷組織的影響

莖段愈傷組織產(chǎn)生于兩端切面處，誘導(dǎo)初期質(zhì)地松軟、呈半透明乳白色。在誘愈培養(yǎng)基上接種20 d后，有84%莖段均誘導(dǎo)出愈傷組織，與葉片、嫩芽等外植體相比，莖段愈傷組織出現(xiàn)最早。將莖段產(chǎn)生的愈傷組織繼代轉(zhuǎn)接，均能增殖。培養(yǎng)20 d發(fā)現(xiàn)大部分培養(yǎng)基中增殖的愈傷組織與誘導(dǎo)初期一樣質(zhì)地松軟、沒有光澤，并隨培養(yǎng)時期的延長而褐變死亡，僅3、5、9號培養(yǎng)基上的愈傷組織出現(xiàn)生長，其中9號培養(yǎng)基上的愈傷組織狀態(tài)最好，出現(xiàn)質(zhì)地松脆的綠色愈傷組織（表4）。

2.4不同激素組合對葉片愈傷組織的影響

葉片愈傷組織多發(fā)生于切面，少數(shù)愈傷組織由葉片表層細(xì)胞產(chǎn)生，多數(shù)呈乳白色，少數(shù)呈綠色。由表5可知，接種 20 d 后約80%葉片能誘導(dǎo)出愈傷組織，但4、5、7號培養(yǎng)基出愈率較低，僅為60%。在轉(zhuǎn)接愈傷組織繼代培養(yǎng)的過程中，2、3、6號培養(yǎng)基中愈傷組織的增殖能力遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于其他培養(yǎng)基；其他培養(yǎng)基上的愈傷組織雖能增殖，但表現(xiàn)松、軟、過于散碎，并隨培養(yǎng)時間的延長陸續(xù)褐變死亡。在3號培養(yǎng)基上誘導(dǎo)出的綠色愈傷組織與莖段、幼芽等外植體誘導(dǎo)出的狀態(tài)良好的愈傷組織相比質(zhì)地更松脆。

2.5不同激素組合對幼芽誘導(dǎo)的影響

在誘愈培養(yǎng)基上接種10 d左右，幼芽開始伸長生長；20 d后部分培養(yǎng)基中的幼芽平均可長至3.3 cm。在誘導(dǎo)過程中幼芽基部長出叢芽，而幼芽所誘導(dǎo)的愈傷組織多在叢芽部位，

其質(zhì)地松軟，轉(zhuǎn)接后增殖培養(yǎng)，褐化率高達(dá)97%，短時期內(nèi)均褐變死亡。由表6可知，在幼芽誘導(dǎo)與繼代增殖的過程中，接種于8號培養(yǎng)基的幼芽生長速度最為迅速，且形成的叢芽數(shù)量也多于其他培養(yǎng)基，與接種于其他培養(yǎng)基的幼芽相比具有明顯優(yōu)勢。

3結(jié)論

本試驗(yàn)選擇貼梗海棠的葉片、莖段、幼芽作為外植體，研究不同外植體及激素組合對貼梗海棠愈傷組織誘導(dǎo)的影響。結(jié)果表明，在選擇消毒劑時，0.1% HgCl2溶液處理遠(yuǎn)遠(yuǎn)好于2% NaClO溶液處理；葉片進(jìn)行0.5 cm2的分割處理出愈率高于劃有網(wǎng)格狀傷口的全葉。在所有外植體愈傷組織的誘導(dǎo)和繼代增殖過程中，莖段、葉片、幼芽的愈傷組織出愈率分別為84%、80%、11%，而幼芽的褐化率最高（97%）、葉片最低（37%），且由葉片產(chǎn)生的綠色愈傷組織質(zhì)地更為松脆，增殖能力比莖段和幼芽產(chǎn)生的更強(qiáng)。由此確定誘導(dǎo)愈傷組織的最適外植體為葉片，最適培養(yǎng)基為MS+0.5 mg/L 6-BA+0.3 mg/L NAA。

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