豬TGFβR和TGFβ1基因多態(tài)性與產(chǎn)活仔數(shù)的關(guān)聯(lián)分析

徐夢思++黃濤++馬亮++王斌虎++劉麗娟++翟騰蛟++馬力鵬

摘要：為探討豬轉(zhuǎn)化生長因子β1（TGFβ1）及其受體（TGFβRⅠ）基因多態(tài)性與大白豬和長白豬產(chǎn)活仔數(shù)的相關(guān)性。采用PCR-SSCP方法檢測了[WTBX][STBX]TGFβ1[WTBZ][STBZ]第6內(nèi)含子和TGFβR[QX（Y15]Ⅰ[QX）]第7內(nèi)含子中與豬繁殖力相關(guān)的2個突變位點在大白豬和長白豬（共計232頭）中的單核苷酸多態(tài)性，同時分析多態(tài)位點基因型與大白豬和長白豬產(chǎn)活仔數(shù)的關(guān)聯(lián)性。結(jié)果發(fā)現(xiàn)：[WTBX][STBX]TGFβ1[WTBZ][STBZ]基因第7外顯子上游的第9位堿基存在C→T突變，在大白豬和長白豬中均檢出CC和TT 2種基因型，且不同基因型對2豬種產(chǎn)活仔數(shù)的影響差異不顯著（P>0.05）；TGFβR[QX（Y15]Ⅰ[QX）]基因第7內(nèi)含子第808位堿基存在A→G突變，在大白豬中檢出AA、AG、GG 3種基因型，長白豬中未檢出GG基因型，大白豬中GG型母豬產(chǎn)活仔數(shù)極顯著高于AA型（P<0.01），長白豬中，AA型和AG型產(chǎn)活仔數(shù)的影響差異不顯著（P>0.05）。研究結(jié)果表明，[WTBX][STBX]TGFβ1基因的突變位點對大白豬和長白豬的產(chǎn)活仔數(shù)沒有顯著影響，TGFβR[QX（Y15]Ⅰ[QX）]基因多態(tài)位點與母豬產(chǎn)活仔數(shù)顯著相關(guān)，可作為豬分子遺傳育種的候選基因，加快豬育種進程。

關(guān)鍵詞：豬；基因；TGFβR[QX（Y15]Ⅰ[QX）]基因；PCR-SSCP；產(chǎn)活仔數(shù)

中圖分類號： S828.2文獻標志碼： A

文章編號：1002-1302（2016）02-0038-04

收稿日期：2015-03-20

基金項目：國家自然科學基金（編號：30901014、31460586）；留學回國人員科研啟動基金。

TGFβ1是轉(zhuǎn)化生長因子家族的重要成員之一，具有促進細胞生長、分化、遷移，參與免疫調(diào)節(jié)、細胞外間質(zhì)形成、創(chuàng)傷愈合、組織修復、胚胎發(fā)育等生物學功能[1]。其受體TGFβRⅠ屬于絲氨酸/蘇氨酸激酶受體家族，在大多數(shù)細胞和組織中普遍表達，其胞內(nèi)區(qū)具有絲氮酸/蘇氨酸激酶結(jié)構(gòu)域，即GS區(qū)，具有激酶活性。在TGFβ/SMAD信號通路的信號轉(zhuǎn)導是由有活性的TGFβ1首先和TGFβRⅡ結(jié)合形成異源二聚體復合物，該異源二聚體能夠使TGFβRⅠGS區(qū)的絲氨酸和蘇氨酸磷酸化，激活TGFβRⅠ激酶，活化的TGFβRⅠ激酶再與下游的SMADs蛋白家族發(fā)生磷酸化，從而將配體信號跨膜轉(zhuǎn)導入細胞核中，進而引起一系列的生物學效應(yīng)[2]。TGFβ1與其受體TGFβRⅠ直接參與下丘腦-垂體-卵巢軸的調(diào)控，在促進卵子成熟，黃體形成，及子宮內(nèi)膜及滋養(yǎng)細胞的增殖與分化方面起著重要的作用[3]。

已有研究證實，TGFβ1與動物繁殖有著密切的關(guān)系，TGFβ1在卵巢細胞內(nèi)的表達隨著動物物種、卵泡發(fā)育階段的不同而有所差異，但在多種動物卵泡發(fā)育階段都呈時空性表達[4]；Wimmers 等通過 PCR-SSCP 檢測到皮特蘭豬、柏林小型豬，在TGFβ1第 5 外顯子的 798 堿基（AF461808）存在1個單核苷酸多態(tài)（SNP）[5]；武艷萍等研究發(fā)現(xiàn)大白豬[WTBX][STBX]TGFβ1[WTBZ][STBZ]基因多態(tài)性與產(chǎn)仔數(shù)間呈顯著關(guān)聯(lián)（P<0.05）[6]；王嘉博發(fā)現(xiàn)[WTBX][STBX]TGFβ1[WTBZ][STBZ] 基因T4位點的 AA 型總產(chǎn)仔數(shù)最高，對母豬生產(chǎn)性狀的影響極顯著，對仔豬出生體質(zhì)量及斷奶體質(zhì)量影響不顯著[7]。李海晶等研究發(fā)現(xiàn)大白豬TGFβR[QX（Y15]Ⅰ[QX）]基因多態(tài)性與產(chǎn)仔數(shù)間呈顯著關(guān)聯(lián)（P<0.05）[8]。根據(jù)以上TGFβR[QX（Y15]Ⅰ[QX）]基因和[WTBX][STBX]TGFβ1[WTBZ][STBZ]基因?qū)Ψ敝车挠绊懀驹囼炓訲GFβR[QX（Y15]Ⅰ[QX）]和[WTBX][STBX]TGFβ1[WTBZ][STBZ]作為候選基因進行研究，選取大白豬111頭，長白豬121頭為研究材料，采用PCR-SSCP技術(shù)，對豬[WTBX][STBX]TGFβ1[WTBZ][STBZ]基因第6內(nèi)含子和TGFβR[QX（Y15]Ⅰ[QX）]基因第7內(nèi)含子進行多態(tài)性檢測，分析其多態(tài)性與豬產(chǎn)仔數(shù)之間的關(guān)聯(lián)性，為進一步提高豬繁殖性能，實現(xiàn)豬的遺傳改良提供理論依據(jù)。

1材料與方法

1.1試驗材料

本試驗選取健康無病的大白豬111頭和長白豬121頭，分別來自新疆科盛種豬場和新疆142團種豬場，用耳號鉗采集耳組織樣本0.1 g，置于70%乙醇溶液中，-80 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2試驗試劑

Taq MIX，購自CWBIO公司；DNA marker、DNA提取試劑盒、膠回收試劑盒，購自TIANGEN公司；pGEM-T Vector、T4 DNA連接酶，購自Promega公司；大腸桿菌DH5α感受態(tài)細胞，為石河子大學動物遺傳育種與繁殖實驗室保存。

1.3豬耳組織DNA的提取

取豬耳組織，用滅菌小剪刀充分剪碎，處理樣品過程中需注意剪刀的消毒，避免交叉污染。根據(jù)TIANGEN動物組織DNA提取試劑盒操作步驟提取豬耳組織基因組DNA。

1.4PCR-SSCP引物設(shè)計

根據(jù)已知的豬[WTBX][STBX]TGFβ1[WTBZ][STBZ]基因第6內(nèi)含子區(qū)的1 156 bp序列（序列：AJ621785中的第1 043位點）[6]和TGFβR[QX（Y15]Ⅰ[QX）]基因第7內(nèi)含子區(qū)的1 259 bp序列中突變位點（序列：DQ519377中的第65 753位點）[8]，利用Primer 50軟件設(shè)計擴增[WTBX][STBX]TGFβ1[WTBZ][STBZ]和TGFβR[QX（Y15]Ⅰ[QX）]的特異性上下游引物。引物由北京華大生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成，引物序列（表1）。

1.5PCR擴增

以豬耳組織DNA為模板，使用Taq Mix試劑進行PCR擴增，PCR反應(yīng)體系為20 μL：Mix 10 μL，上下游引物各0.8 μL（10 μmol/L），DNA 1 μL，補ddH2O 至總反應(yīng)體系為20 μL。PCR反應(yīng)條件：94 ℃預變性2 min；94 ℃變性30 s，退火30 s，72 ℃延伸30 s，共35個循環(huán)；72 ℃終延伸5 min；保存4 ℃。PCR產(chǎn)物經(jīng)2.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測。

1.6PCR-SSCP

根據(jù)PCR產(chǎn)物片段的大小，[WTBX][STBX]TGFβ1[WTBZ][STBZ]和TGFβR[QX（Y15]Ⅰ[QX）]基因分別使用10%和12%非變性聚丙烯酰胺凝膠進行檢測。取 3 μL 擴增條帶明亮單一、片段大小符合預期的PCR產(chǎn)物和 8 μL Loading buffer，瞬時離心混勻。PCR儀98 ℃變性 10 min 后迅速冰浴10 min，取10 μL變性后的PCR產(chǎn)物上樣。120 V穩(wěn)壓電泳12 h，銀染顯帶，確定純合子和雜合子帶型，并拍照記錄。

1.7PCR產(chǎn)物的克隆測序

利用普通瓊脂糖回收試劑盒對PCR-SSCP檢測到的同一引物不同帶型的PCR產(chǎn)物進行回收，將純化產(chǎn)物與pGEM-T載體連接，連接體系為：2×Rapid Ligation buffer 5 μL，PCR 產(chǎn)物3 μL，pGEM-T Vector 1 μL，T4 DNA Ligase 1 μL，PCR儀中16 ℃連接過夜。然后將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化到大腸桿菌DH5α感受態(tài)細胞，涂布平板，37 ℃過夜培養(yǎng)，挑選陽性菌落，37 ℃擴大培養(yǎng)8 h，將選取的陽性菌株送交北京華大生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司測序。

1.8數(shù)據(jù)統(tǒng)計

根據(jù)PCR-SSCP銀染顯影帶型的顯示，統(tǒng)計計算等位基因的基因頻率和基因型頻率，利用SPSS 17.0軟件中的 One-way ANOVA方法進行方差分析，LSD法進行組間差異顯著性檢驗，分析[WTBX][STBX]TGFβ1[WTBZ][STBZ]和TGFβR[QX（Y15]Ⅰ[QX）]不同基因型與大白豬和長白豬產(chǎn)活仔數(shù)性狀的相關(guān)性，不同基因?qū)?yīng)的產(chǎn)活仔數(shù)用平均值±標準差表示。

2結(jié)果與分析

2.1PCR-SSCP檢測結(jié)果

對豬耳組織DNA用[WTBX][STBX]TGFβ1[WTBZ][STBZ]基因第6內(nèi)含子和TGFβR[QX（Y15]Ⅰ[QX）]基因第7內(nèi)含子特異性引物擴增，對擴增產(chǎn)物分別進行10%和12%非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測。在2個豬種[WTBX][STBX]TGFβ1[WTBZ][STBZ]基因引物擴增片段均上發(fā)現(xiàn)1個突變位點，檢測到2種基因型，分別命名為CC型和TT型，結(jié)果見圖1；在2個豬種TGFβR[QX（Y15]Ⅰ[QX）]基因引物擴增片段上均發(fā)現(xiàn)1個突變位點，大白豬中檢測到3種基因型，長白豬中檢測到2種基因型，分別命名為AA型、AG型及GG型，結(jié)果見圖2。

2.2測序結(jié)果及分析

經(jīng)SSCP分型后，將不同基因型個體的PCR產(chǎn)物用普通瓊脂糖膠回收試劑盒純化回收后連接pGEM-T載體，轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α送樣測序。測序結(jié)果經(jīng)DNAMAN和Chrimas軟件分析后，發(fā)現(xiàn)在[WTBX][STBX]TGFβ1[WTBZ][STBZ]引物擴增片段的第156堿基處發(fā)生了C→T突變，此突變位點位于[WTBX][STBX]TGFβ1[WTBZ][STBZ]基因第7外顯子上游的第9位堿基（序列：AJ621785中的第1 043位點）。TGFβR[QX（Y15]Ⅰ[QX）]引物擴增片段的第112堿基處發(fā)生了A→G突變，此突變位點位于TGFβR[QX（Y15]Ⅰ[QX）]基因第7內(nèi)含子第808位堿基（序列：DQ519377中的第65 753位點）。[WTBX][STBX]TGFβ1[WTBZ][STBZ] 和TGFβR[QX（Y15]Ⅰ[QX）]基因不同基因型個體測序結(jié)果分別見圖3、圖4。

2.3不同豬種[WTBX][STBX]TGFβ1[WTBZ][STBZ]和TGFβR[QX（Y15]Ⅰ[QX）]基因的等位基因和基因型頻率分析

對[WTBX][STBX]TGFβ1[WTBZ][STBZ]和TGFβR[QX（Y15]Ⅰ[QX）]基因在大白豬和長白豬中的基因頻率和基因型頻率進行統(tǒng)計（表2、表3），[WTBX][STBX]TGFβ1[WTBZ][STBZ]基因在大白豬和長白豬中均檢測到CC、TT 2種基因型，未檢測到CT基因型，等位基因C占優(yōu)勢。TGFβR[QX（Y15]Ⅰ[QX）]基因在大白豬中檢測到AA、AG、GG 3種基因型，等位基因A占優(yōu)勢；在長白豬中檢測到AA、AG 2種基因型，未檢測到GG基因型，等位基因A占優(yōu)勢。

2.4[WTBX][STBX]TGFβ1[WTBZ][STBZ]和TGFβR[QX（Y15]Ⅰ[QX）]不同基因型對豬產(chǎn)活仔數(shù)的影響

利用SPSS 17.0軟件對統(tǒng)計結(jié)果進行One-way ANOVA分析，LSD法進行組間差異顯著性檢驗，分析[WTBX][STBX]TGFβ1[WTBZ][STBZ]和TGFβR[QX（Y15]Ⅰ[QX）]各突變位點不同基因型與母豬產(chǎn)活仔數(shù)性狀的相關(guān)性，不同基因?qū)?yīng)的產(chǎn)活仔數(shù)用平均值±標準差表示。結(jié)果（表4）顯示[WTBX][STBX]TGFβ1[WTBZ][STBZ]基因在大白豬和長白豬中，CC型和TT型產(chǎn)活仔數(shù)之間均沒有顯著差異（P>0.05），產(chǎn)活仔數(shù)趨勢均為TT>CC。TGFβR[QX（Y15]Ⅰ[QX）]基因大白豬中，GG型和AG型產(chǎn)活仔數(shù)極顯著高于AA型（P<0.01），GG型產(chǎn)活仔數(shù)顯著高于AG型（P<0.05），產(chǎn)活仔數(shù)趨勢為GG>AG>AA；長白豬中，AA型和AG型產(chǎn)活仔數(shù)之間差異不顯著，產(chǎn)活仔數(shù)趨勢為AG>AA。

2.5[WTBX][STBX]TGFβ1[WTBZ][STBZ]和TGFβR[QX（Y15]Ⅰ[QX）]合并基因型對豬產(chǎn)活仔數(shù)的影響

將檢測出的[WTBX][STBX]TGFβ1[WTBZ][STBZ]基因 C→T突變位點與TGFβR[QX（Y15]Ⅰ[QX）]基因A→G突變位點合并基因型，在檢測豬群中則存在CCAA、CCAG、CCGG、TTAA、TTAG和TTGG 6種合并基因型。以[WTBX][STBX]TGFβ1[WTBZ][STBZ]基因和TGFβR[QX（Y15]Ⅰ[QX）]基因的合并基因型為參數(shù)對不同豬種產(chǎn)活仔數(shù)進行分析，大白豬群中TTGG合并基因型的產(chǎn)活仔數(shù)最高，為11.54頭/胎，平均比最低的CCAA合并基因型的產(chǎn)活仔數(shù)多1.81頭/胎。長白豬中4種合并基因型產(chǎn)活仔數(shù)的平均值之間相差較?。ū?）。

3討論與結(jié)論

繁殖性狀是豬的重要經(jīng)濟性狀之一，它的優(yōu)劣不僅直接影響母豬的繁殖生產(chǎn)力，而且直接影響?zhàn)B豬生產(chǎn)的經(jīng)濟效益[9-10]。近年來，轉(zhuǎn)化生長因子β超家族成員在動物繁殖中的作用被廣泛研究，TGFβ1和TGFβRⅠ作為轉(zhuǎn)化生長因子β超家族重要成員，它們在動物繁殖中的作用也受到越來越多的關(guān)注。

TGFβ1是一種具有多種生物學功能的細胞因子，在正常的組織、細胞和轉(zhuǎn)化細胞中均存在。TGFβ1可以通過調(diào)節(jié)基因表達來發(fā)揮維持機體正常生理過程和生命活動的重要作用?，F(xiàn)已有研究表明TGFβ1在卵巢組織中高表達，與卵泡發(fā)育、顆粒細胞的增殖、分化和排卵有關(guān)[11]。TGFβ1參與顆粒細胞與膜細胞以及顆粒細胞與卵母細胞之間的雙向通話[12]。因而我們將[WTBX][STBX]TGFβ1[WTBZ][STBZ]基因作為繁殖性狀的候選基因，參考武艷萍等、王嘉博發(fā)現(xiàn)的研究結(jié)果設(shè)計引物，[HJ1.4mm]利用單鏈構(gòu)象多態(tài)性聚合酶鏈技術(shù)對該基因第6內(nèi)含子多態(tài)性進行檢測，在第7外顯子上游的第9位堿基檢測出C→T突變，這與武艷萍等人的研究結(jié)果一致。對C→T突變進行分析發(fā)現(xiàn)，在大白豬和長白豬中導致出現(xiàn)TT、CC 2種基因型，且2個群體中均為C等位基因占優(yōu)勢，T和C等位基因頻率相差較大，說明[WTBX][STBX]TGFβ1[WTBZ][STBZ]基因C→T突變的等位基因頻率和群體遺傳特征在不同品種中較為一致。并對所檢測出的SNP位點的不同基因型與豬產(chǎn)活仔數(shù)進行了關(guān)聯(lián)性分析，大白和長白經(jīng)產(chǎn)母豬的產(chǎn)活仔數(shù)均表現(xiàn)為TT>CC，在大白豬種中該位點TT型母豬的產(chǎn)活仔數(shù)比CC型多0.43頭/胎（P>0.05），在長白豬種中該位點TT型母豬的產(chǎn)活仔數(shù)比CC型多0.20頭/胎（P>0.05）。在這2個品種中T等位基因有利于提高母豬的產(chǎn)活仔數(shù)，這反映出[WTBX][STBX]TGFβ1[WTBZ][STBZ]基因可能與豬產(chǎn)活仔數(shù)性能密切相關(guān)，表明該位點的T基因可以作為豬高產(chǎn)活仔數(shù)的一個[HJ]遺傳標記。

TGFβRI在卵巢不同發(fā)育階段中均有表達，通過自分泌/旁分泌機制參與卵巢顆粒細胞增殖、卵母細胞成熟和類固醇生成，調(diào)節(jié)數(shù)種關(guān)鍵的顆粒細胞酶，對保持卵巢內(nèi)的理想環(huán)境起著十分重要的作用[13]。目前國內(nèi)外對豬TGFβR[QX（Y15]Ⅰ[QX）]基因多態(tài)性的報道還很少，本研究借鑒李海晶等的研究結(jié)果，設(shè)計引物，利用PCR-SSCP方法對該基因第7內(nèi)含子進行多態(tài)性檢測，檢測1個SNP位點，即TGFβR[QX（Y15]Ⅰ[QX）]基因第7內(nèi)含子第808位堿基（序列：DQ519377中的第65753位點）存在A→G突變，這與李海晶等的研究結(jié)果存在一定的差異，前人在TGFβR[QX（Y15]Ⅰ[QX）]基因第7內(nèi)含子中檢測出2個SNP位點，并且就 A→G 突變，測序樣本中只出現(xiàn)了1種純合子和1種雜合子，本研究在大白豬群體中檢測出AA、AG、GG 3種基因型，而在長白豬群體中只檢測出AA、AG 2種基因型。這說明在群體中是存在GG基因型的，長白豬群體中未檢出可能是由于GG型出現(xiàn)的比率本身就較低，擴大樣本數(shù)量可能會檢測出。對A→G突變進行分析發(fā)現(xiàn)，在大白豬和長白豬2個群體中均為A等位基因占優(yōu)勢，A和G等位基因頻率相差較大。分析不同基因型與豬產(chǎn)活仔數(shù)之間的關(guān)聯(lián)性，發(fā)現(xiàn)大白經(jīng)產(chǎn)母豬產(chǎn)活仔數(shù)表現(xiàn)為GG>AG>AA，長白經(jīng)產(chǎn)母豬產(chǎn)活仔數(shù)表現(xiàn)為AG>AA，大白豬中GG型比AG型和AA型母豬產(chǎn)活仔數(shù)分別高出1.83頭/胎和3.18頭/胎，GG型與AG型母豬產(chǎn)活仔數(shù)之間差異顯著（P<0.05），與AA型之間差異極顯著（P<0.01）；而長白豬中AG型比AA型母豬產(chǎn)活仔數(shù)高出0.30頭/胎，差異不顯著（P>0.05）。在這2個品種中G等位基因有利于提高母豬的產(chǎn)活仔數(shù)，結(jié)合前人的研究結(jié)果可進一步證實TGFβR[QX（Y15]Ⅰ[QX）]基因多態(tài)性與豬產(chǎn)活仔數(shù)顯著相關(guān)，該基因可以用于豬分子遺傳育種的候選基因。

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