藥用植物黃花蒿內(nèi)生菌的研究進(jìn)展

宋春竹陳昕雯陳東紅

（1. 湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)生物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，長(zhǎng)沙 410128；2. 湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)國(guó)際學(xué)院，長(zhǎng)沙 410128）

藥用植物黃花蒿內(nèi)生菌的研究進(jìn)展

宋春竹1陳昕雯2陳東紅1

（1. 湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)生物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，長(zhǎng)沙 410128；2. 湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)國(guó)際學(xué)院，長(zhǎng)沙 410128）

黃花蒿作為治療瘧疾最有效的中草藥植物，同時(shí)還具有其他多種藥用和農(nóng)業(yè)生產(chǎn)價(jià)值。與其密切相關(guān)的內(nèi)生菌資源已是目前研究的一大熱點(diǎn)?？偨Y(jié)整理了黃花蒿內(nèi)生菌的研究現(xiàn)狀，其應(yīng)用主要集中在抗腫瘤抗氧化活性、抑菌活性、促進(jìn)青蒿素的合成等方面。

黃花蒿；植物內(nèi)生菌；代謝產(chǎn)物；抗腫瘤；抗氧化；抑菌

黃花蒿（Artemisia annua L.）是菊科蒿屬的一年生草本植物，又名香蒿、草青蒿、臭青蒿，其分布廣泛、適應(yīng)性強(qiáng)，具有解暑、退熱、治感冒等功效，是我國(guó)傳統(tǒng)的中草藥［1］。20世紀(jì)70年代，我國(guó)著名科學(xué)家屠呦呦及其工作團(tuán)隊(duì)首次從黃花蒿莖葉中分離到一種具有高效抗瘧活性的倍半萜內(nèi)脂類化合物——青蒿素（Artemisinin）［2］，已被世界衛(wèi)生組織推薦為防治瘧疾的首選藥物。青蒿提取物經(jīng)研究還具有抗炎癥、抗氧化、抗菌及抗腫瘤等多種藥用價(jià)值［3］。另外，青蒿還可以作為長(zhǎng)效無公害的天然綠色農(nóng)藥資源和綠化荒地的優(yōu)良先鋒植物資源［4］。鑒于黃花蒿在醫(yī)藥開發(fā)、農(nóng)業(yè)生產(chǎn)、環(huán)境保護(hù)方面的重要及潛在價(jià)值，目前對(duì)黃花蒿及其內(nèi)生菌資源的應(yīng)用研究備受關(guān)注。

植物內(nèi)生菌（Endophyte）泛指那些在其生活史中至少一定階段生活在健康植物組織內(nèi)部，并不引起明顯病害癥狀的微生物。植物內(nèi)生菌在長(zhǎng)期和宿主共同進(jìn)化和相互合作過程中，它們的遺傳和代謝之間存在一定的相似性和互補(bǔ)性。目前，關(guān)于植物內(nèi)生菌的功能研究，主要集中于產(chǎn)生活性代謝物質(zhì)、固氮功能、促進(jìn)植物生長(zhǎng)、增強(qiáng)宿主植物抗性、他感作用、生物防治、環(huán)境修復(fù)及作為外源基因載體等方面［5，6］。

本文對(duì)近年來國(guó)內(nèi)外黃花蒿內(nèi)生菌的研究工作進(jìn)行了系統(tǒng)總結(jié)，希望為進(jìn)一步開發(fā)和利用黃花蒿內(nèi)生菌資源奠定良好的文獻(xiàn)基礎(chǔ)并起到初步的指導(dǎo)作用。

1 抗腫瘤與抗氧化活性

許多植物內(nèi)生真菌產(chǎn)生的次生代謝產(chǎn)物，如萜類、生物堿、黃酮、甾體及酯類等化合物，具有抗腫瘤活性。Gu等［7］從黃花蒿莖中分離到一株內(nèi)生截孔環(huán)炭團(tuán)菌Hypoxylon truncatum IFB-18，其發(fā)酵萃取液中的兩種新的苯并［J］熒蒽（benzo［j］fluoranthene-based）類化合物daldinone C 和D，可明顯地抑制結(jié)腸癌細(xì)胞株SW1116，且半抑制濃度IC50（Half maximal inhibitory）分別為49.5和41.0 μmol/L。Shen等［8］對(duì)內(nèi)生露濕漆斑菌Myrothecium roridum IFB-E012發(fā)酵液的乙醇提取物通過硅膠柱層析和葡聚糖凝膠過濾等方法進(jìn)一步純化并分離出5種化學(xué)成分：7，8-二甲基異咯嗪（7，8-dimethylalloxazine，lumichrome）、胡蘿卜苷（Daucosterol）、對(duì)羥基苯甲酸（p-hydroxybenzoic acid）、尿嘧啶（Uracil）和煙酸（Nicotinic acid）。其中7，8-二甲基咯嗪對(duì)人鼻咽癌KB細(xì)胞和黃嘌呤氧化酶表現(xiàn)出抑制活性，且IC50分別為14.46 和60.32 μmol/L［8］。Shen等［9］從原始定殖于黃花蒿根中的內(nèi)生露濕漆斑菌IFB-E091的固體培養(yǎng)物中鑒定出一個(gè)新的具有細(xì)胞毒性的roridin型化合物 trichothecene macrolide（即roritoxin E）和其他3種已知的化合物：7，8-二甲基異咯嗪、（22E，24S）-cerevisterol 和（22E，24R）-6β-methoxyergosta-7，22-diene-3β，5α-diol。其中roritoxin E被證明在體外可以抑制胃癌SGC-7901和肝癌SMMC-7721細(xì)胞系，且IC50分別為0.26 和10.54 μg/mL［9］。錢一鑫等［10］從黃花蒿的根、莖、葉和花中分離到68株內(nèi)生真菌，分別用MTT法和DPPH法對(duì)它們的乙酸乙酯粗提物進(jìn)行了抗腫瘤和抗氧化活性的測(cè)定，共篩選到12株活性內(nèi)生真菌，分別為子囊菌亞門（Ascomycotina）的鏈格孢屬（Alternaria）、刺盤孢屬（Colletotrichum）、擬盤多毛孢屬（Pestalotiopsis）和擬莖點(diǎn)霉屬（Phomopsis）。在抗腫瘤活性測(cè)試中，對(duì)至少一種指示瘤株（HL-60、MCF-7、COLO205）的抑制率達(dá)50%以上的內(nèi)生真菌有8株（PQH5、9、12、18、35、37、53和58）；在抗氧化活性測(cè)試中，有5株內(nèi)生真菌（PQH12、26、41、47和63）顯示良好的清除DPPH自由基的活性（IC50＜10 mg/mL），并且具劑量依賴性。其中，活性較高的PQH9和PQH12為擬莖點(diǎn)霉屬（Phomopsis）真菌，PQH9具有較高的體外細(xì)胞毒活性，PQH12同時(shí)具有體外細(xì)胞毒活性和抗氧化活性，且發(fā)酵產(chǎn)量較大。不同活性內(nèi)生真菌的分布具有相對(duì)組織特異性，其中具細(xì)胞毒活性的均來自葉片部位，具抗氧化活性的則來自根和莖部位［10］。Zhang等［11］首次從黃花蒿內(nèi)生真菌煙曲霉Aspergillus fumigatus SPS-02發(fā)酵液中分離到4種ardeemin 衍生物：5-N-acetylardeemin、5-N-acetyl-15bβ-hydroxyardeemin、5-N-acetyl-15bdidehydroardeemin 和5-N-acetyl-16α-hydroxyardeemin。它們對(duì)白血病耐藥細(xì)胞株 K562/DOX、人肺腺癌順鉑耐藥細(xì)胞株 A549/DDP和卵巢癌順鉑耐藥細(xì)胞株SK-OV-S/DDP的耐藥性有不同程度的逆轉(zhuǎn)作用。其中，化合物4在濃度為5 μmol/L時(shí)對(duì)K562/DOX和A549/DDP細(xì)胞株的耐藥性有最強(qiáng)的逆轉(zhuǎn)作用，分別達(dá)到5.2和8.2倍；然而化合物2對(duì)SKOV-S/DDP細(xì)胞株的耐藥性有最強(qiáng)的逆轉(zhuǎn)能力，達(dá)到10.8倍［11］。于哲等［12］通過硅膠、反相及凝膠等分離方法從黃花蒿內(nèi)生放線菌A5發(fā)酵液乙酸乙酯萃取相分離得到4種化合物：吡嗪酮類化合物6-benzyl-3-isopropylpyrazin-2（1H）-one、酪胺生物堿N-（4-hydroxyphenethyl）acetamide和波譜數(shù)據(jù)為首次報(bào)道的3-（4-hydroxyphenyl）-2-［（2-oxotetrahydro-2H-pyran-3-yl）oxy］propanoic acid 及尿嘧啶。對(duì)前3種化合物采用海蝦幼蟲致死性測(cè)定發(fā)現(xiàn)，在樣品濃度為0.1 mg/mL 時(shí)，海蝦矯正死亡率依次是43.2%、38.3%和43.2%，表明它們均具有一定的細(xì)胞毒活性［12］。由于海蝦幼蟲致死率與對(duì)癌細(xì)胞的抑制率之間存在一定的相關(guān)性，因此此法可應(yīng)用于大規(guī)模抗癌藥物的初步篩選。

2 抑菌活性

植物內(nèi)生菌可以通過刺激宿主或自身分泌一些特殊的次生代謝產(chǎn)物來提高宿主的抗病能力。Lu等［13］從黃花蒿莖中分離出一株內(nèi)生炭疽菌（Colletorichum sp.），可產(chǎn)生8種已知的代謝產(chǎn)物：麥角固醇（ergosterol）（I）、3β，5α，6β-trihydroxyergosta-7，22-diene（II）、3β-hydroxyergosta-5-ene（III）、3-oxo-ergosta-4，6，8（14），22-tetraene（IV）、3β-hydroxy-5α，8α-epidioxyergosta-6，22-diene（V）、3β-hydroxy-5α，8α-epidioxyergosta-6，9（11），22-triene（VI）、3-oxo-ergosta-4-ene（VII）和生長(zhǎng)素吲哚乙酸（indole-3-acetic acid，IAA）以及3種新的抑菌代謝物：6-isoprenylindole-3-carboxylic acid、3β，5α-dihydroxy-6β-acetoxy-ergosta-7，22-diene和3β，5α-dihydroxy-6β-phenylacetyloxyergosta-7，22-diene。抑菌測(cè)試表明化合物1-3和III-V可抑制枯草桿菌（Bacillus subtilis）、金黃葡萄球菌（Strphylococcus aureus）、藤黃八疊球菌（Sarcina lutea）、假單胞菌（Pseudomonas sp.）等病原菌，且其抑制濃度范圍為25-75 mg/mL；化合物2、3與III和V在50-100 μg/mL時(shí)對(duì)白色念珠菌（Candida albicans）和黑曲霉（Aspergillus niger）有抑制作用，化合物1-3、III 和IV對(duì)小麥全蝕病菌（Gaeumannomyces graminis）、禾谷絲核菌（Rhizoctonia cerealis）、根腐病菌（Helminthosporium sativum）和南瓜疫病菌（Phytophthora capisici）等4種真菌有抑制作用［13］。Liu等［14］對(duì)39株內(nèi)生菌進(jìn)行小麥全蝕病菌（Gaeumannomyces graminis）、小麥紋枯病菌（Rhizoctonia cerealis）、小麥根腐病菌（Helminthosporium sativum）、小麥雪霉葉枯病菌（Gerlachia nivalis）、辣椒疫霉菌（Phytophthora capsici）和禾谷鐮刀菌（Fusarium graminearum）等植物病原真菌的拮抗篩選發(fā)現(xiàn)，21株可產(chǎn)生抑菌活性物質(zhì)，其中內(nèi)生菌IV403產(chǎn)生的活性最強(qiáng)，有效成分主要集中在乙酸乙酯萃取相［14］。魏寶陽等［15］以金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌及大腸桿菌為測(cè)試菌種，從黃花蒿莖葉主要分離出13株內(nèi)生真菌，分別屬于束梗孢目（Stilbellales）、絲孢目（Hyphomycetales）、側(cè)孢霉屬（Sporotrichum）、絲核菌屬（Rhizoctonia）、曲霉屬（Aspergillus）、擬青霉屬（Paecilemyces）、鏈格孢屬（Alternaria Nees）、青霉屬（Penicillium）、毛霉屬（Mucor）等。對(duì)它們的次生代謝產(chǎn)物進(jìn)行抗菌活性篩選發(fā)現(xiàn)，活性成分多集中于乙酸乙酯相；其中12 株的代謝產(chǎn)物至少對(duì)1種受測(cè)菌具有抑菌活性，而且有2 株對(duì)測(cè)試病原菌均有較強(qiáng)抑制作用［15］。田小曼等［16］以番茄灰霉病菌（Botrytis cirerea）、番茄早疫病菌（Alternaria solani）、蘋果炭疽病菌（Glomerella cingulata）、西瓜枯萎病菌（Fusarium ozysporum）、西瓜炭疽病菌（Colletetrichum orbiculare）、小麥赤霉病菌（Fusarium graminearum）、油菜菌核菌（Sclerotinia sclerotiorun）、玉米彎孢病菌（Curvularia lunata）等8種病原真菌作為靶標(biāo)菌，對(duì)從青蒿的根、莖、葉中分離到的67株內(nèi)生菌（細(xì)菌43株、真菌16株、放線菌8株）進(jìn)行抗菌活性檢測(cè)，篩選到1株抗菌活性較高的內(nèi)生真菌G2、9株內(nèi)生細(xì)菌和3株內(nèi)生放線菌。作為重點(diǎn)研究的G2為子囊菌門的炭疽菌屬（Colletetrichum）真菌，經(jīng)分析其發(fā)酵代謝產(chǎn)物中抑菌活性成分可能為生物堿、內(nèi)酯、香豆素和有機(jī)酸［16］。Zhang等［17］以大腸桿菌、金黃葡球菌、紅色毛癬菌（Trichophyton rubrum）、立枯絲核菌（Rhizoctonia cerealis），稻瘟病菌（Magnaporthe grisea）為供試病原菌，通過對(duì)分離得到的11株內(nèi)生真菌的提取物抑菌活性研究發(fā)現(xiàn)，曲霉菌屬Aspergillus sp. SPS-02、頭孢霉屬Cephalosporium sp. SPS-08、毛霉屬M(fèi)ucor sp. SPS-10和-11有較為廣泛的抑菌效果；Aspergillus spp. SPS-02，-04和-01提取物分別對(duì)大腸桿菌、金黃葡球菌、紅色毛癬菌有最強(qiáng)的抑制活性；SPS-11提取物對(duì)立枯絲核菌有最明顯效應(yīng)；SPS-02 和 -08提取物對(duì)稻瘟病菌有最強(qiáng)抑制活性［17］。李潔［18，19］相對(duì)系統(tǒng)地分析了黃花蒿內(nèi)生放線菌（228株）的抗菌活性。以大腸桿菌（Escherichia coli）、金黃色葡萄球菌、白色念珠菌（Candida albicans）以及玉蜀黍長(zhǎng)蠕孢菌（Helminthosporium maydis）、燕麥鐮孢菌（Fusarium avenaceum）、炭疽病菌（Colletotrichum sp.）、蘋果腐爛病菌（Cytospora mandshurica）4種植物病原菌為指示菌進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果顯示所有的供試菌株對(duì)大腸桿菌均無抑制活性，具有至少一種抗菌活性的菌株占51.3%；其中31個(gè)菌株（YIM 65679-65681、65683、65694、65703、65704、65706、65708-65711、65716、65724、65727、65729、65745、65758、65762-65772）具有較強(qiáng)的廣譜抗菌活性，它們的發(fā)酵產(chǎn)物對(duì)5種以上的指示菌均有較強(qiáng)抑制活性；菌株YIM 65784和65810的發(fā)酵產(chǎn)物分別對(duì)玉蜀黍長(zhǎng)孺孢菌和蘋果腐爛病菌表現(xiàn)出最強(qiáng)抑制活性，抑菌圈直徑分別達(dá)到2.4和3.6 cm［18，19］。

另外，內(nèi)生菌也可以通過交叉保護(hù)（Crossprotection）來提高宿主對(duì)強(qiáng)致病菌的抗性?；钚匝酰≧eactive oxygen species，ROS）的產(chǎn)生是植物體響應(yīng)外界脅迫的普遍特征，有助于植物建立系統(tǒng)獲得性抗性（Systemic acquired resistance，SAR），但超過閾值的ROS水平將會(huì)對(duì)植物體內(nèi)的生物大分子DNA、脂類和蛋白等造成氧化損傷，導(dǎo)致細(xì)胞程序性死亡。過氧化物酶在調(diào)控植物防御反應(yīng)早期的ROS的水平發(fā)揮重要作用，賦予植物廣譜的病原菌抗性［20］。SAR是水楊酸（Salicylic acid，SA）介導(dǎo)的植物對(duì)病原物的廣譜抗病反應(yīng)。Lin等［20］從黃花蒿地上部分篩選到兩株內(nèi)生鏈霉菌Streptomyces sp. IFB-A02和IFB-A03，且它們也可以定殖到擬南芥中，但接種IFB-A02的擬南芥幼苗長(zhǎng)勢(shì)弱于接種IFB-A03的植株，相應(yīng)地，接種IFB-A02的葉片有較高水平的過氧化物酶活性和ROS釋放。對(duì)IFB-A03菌株的進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，預(yù)接種IFB-A03可以誘導(dǎo)SAR標(biāo)記基因PR-1、PR-5的轉(zhuǎn)錄水平，活化水楊酸介導(dǎo)的應(yīng)對(duì)病原菌挑戰(zhàn)接種的植物SAR反應(yīng)，從而增強(qiáng)擬南芥對(duì)疥瘡鏈霉菌（Streptomyces scabies）的次級(jí)防御能力，同時(shí)接種IFB-A03能夠部分拯救擬南芥突變體eds5（enhanced disease susceptibility 5）防御缺陷的表型。因此，IFB-A03菌株未來有望作為一種潛在的生態(tài)友好型生物防治制劑加以應(yīng)用［20］。

3 促進(jìn)青蒿素的合成

植物內(nèi)生菌可以通過直接產(chǎn)生目標(biāo)代謝產(chǎn)物，或刺激宿主的相關(guān)生物合成途徑或促進(jìn)宿主總生物量的增加來間接達(dá)到提高目標(biāo)代謝產(chǎn)物的產(chǎn)量。Wang等［21］發(fā)現(xiàn)內(nèi)生刺盤孢屬真菌Colletotrichum sp. B501細(xì)胞壁寡糖提取物對(duì)于生長(zhǎng)22 d的黃花蒿發(fā)根中青蒿素的合成具有促進(jìn)作用，且誘導(dǎo)處理4 d后，發(fā)根青蒿素含量最高達(dá)1.15 mg/g，比對(duì)照增加了64.29%。電子X射線顯微分析（Electron X-ray microanalysis）發(fā)現(xiàn)Ca2+在發(fā)根皮層細(xì)胞急劇積累。在誘導(dǎo)處理第1天，發(fā)根中的氧化物酶活性急劇提高；3 d后，部分細(xì)胞形態(tài)發(fā)生改變，包括皺縮、胞質(zhì)凝聚、細(xì)胞核崩解及核DNA呈梯度降解等，這顯示了內(nèi)生菌細(xì)胞壁寡糖提取物誘發(fā)細(xì)胞編程性死亡，可能為青蒿素生物合成提供物質(zhì)或化學(xué)信號(hào)［21］。王劍文等［22］發(fā)現(xiàn)黃花蒿內(nèi)生膠孢炭疽菌（Colletotrichum gloeosporioides）菌絲體寡糖提取物也可顯著促進(jìn)發(fā)根青蒿素的合成，培養(yǎng)23 d的發(fā)根處理4 d后，青蒿素含量可達(dá)13.5 mg/L，比對(duì)照的產(chǎn)量提高51.63%［22］。因此，寡糖化合物可能是植物內(nèi)生菌與宿主互作的一類重要信號(hào)分子，可以作為在植物細(xì)胞培養(yǎng)中次生代謝物合成的誘導(dǎo)劑。袁亞菲等［23］將黃花蒿內(nèi)生青霉菌Penicillium sp. Y2懸浮培養(yǎng)5 d，分別將離心后所得培養(yǎng)液與菌絲勻漿后經(jīng)高壓滅菌處理、培養(yǎng)液經(jīng)高壓滅菌或過濾除菌處理獲得3種內(nèi)生菌誘導(dǎo)子（A、B和C）。經(jīng)測(cè)試發(fā)現(xiàn)這3種誘導(dǎo)子對(duì)經(jīng)誘導(dǎo)處理3周的黃花蒿組培苗的生物量、抗氧化酶活性和青蒿素含量均有促進(jìn)作用，其中誘導(dǎo)子C的刺激作用最顯著，促進(jìn)組培苗的干重增長(zhǎng)44.44%，誘導(dǎo)超氧化物歧化酶SOD、過氧化氫酶CAT和過氧化物酶POD活性，青蒿素含量提高了58.86%，達(dá)到4.701 mg/g（干重）［23］。陳思安［24］從黃花蒿叢枝菌根中分離到3種內(nèi)生真菌：茄病鐮刀菌（Fusarium solani）、尖抱鐮刀菌（Fusarium oxysporum）和嗜松青霉菌（Penicillium pinophilum）。通過單株或復(fù)合澆菌可以有效增加青蒿的葉綠素含量、總生物量及青蒿素含量。其中復(fù)合接菌的效果優(yōu)于單株接菌，最高可使青蒿素含量提高123.5%［24］。李潔等［25］將內(nèi)生放線菌Pseudonocardia sp. YIM 63111回接黃花蒿幼苗，并使用綠色熒光蛋白eGFP標(biāo)記YIM 63111在黃花蒿體內(nèi)的分布情況，發(fā)現(xiàn)其主要定殖于根部，而且接種的濃度與根的生長(zhǎng)情況呈負(fù)相關(guān)。定量PCR檢測(cè)表明回接YIM 63111可以顯著刺激青蒿素合成關(guān)鍵基因細(xì)胞色素P450單加氧酶 CYP7AV1和氧化還原酶ASQS的表達(dá)，從而促進(jìn)植物體內(nèi)青蒿素的生物合成并增加其含量［25］。

4 其他潛在價(jià)值

其實(shí)，黃花蒿內(nèi)生菌資源具有廣泛的潛在應(yīng)用價(jià)值。李潔［18］對(duì)供試的199株黃花蒿內(nèi)生放線菌進(jìn)行了多種酶活測(cè)定發(fā)現(xiàn)，有44株具淀粉酶活性（占22.1%），90株具蛋白酶活性（占45.2%），53株具纖維素酶活性（占26.6%），76株具脂肪酶活性（占38.2%）。其中7株（YIM 65627、65633、65649、65590、65648、65634和65604）具有較強(qiáng)淀粉酶活性（透明圈寬度＞0.5 cm）；10株（YIM65633、65621、65612、65594、65637、65614、65672、63585、65748和65619）具有較強(qiáng)蛋白酶活性（透明圈寬度＞0.5 cm）；7株（YIM 65708、63596、65627、63587、65693、65598和65751）具有較強(qiáng)纖維素酶活性（透明圈寬度≥1.0 cm）；1株（YIM 65757）具有較強(qiáng)脂肪酶活性（透明圈寬度＞0.5 cm）。另外，在117株內(nèi)生放線菌中檢測(cè)到19株能完全抑制稗草（Echinochloa crusgalli）萌發(fā)，包括11株鏈霉菌（YIM 65703、65714-65717、65736、65746、65768、65769、65771及63600）和8株其他類型的菌（YIM 63587、63553、65681、65684、63590、65744、65685及65742），這為開發(fā)和利用新型無公害的微生物源除草劑提供了廣泛的菌種資源［18，19］。

5 未知功能的內(nèi)生菌資源

植物內(nèi)生菌由于其生活微環(huán)境的特殊性，造就了其獨(dú)特的有別于外界微生物的遺傳和代謝背景。它們因此構(gòu)成了一個(gè)巨大的微生物遺傳信息庫，也潛在隱藏了大量的未經(jīng)鑒定的新物種，為微生物的開發(fā)應(yīng)用提供了新的物種資源。近年來，一些科研工作者已對(duì)黃花蒿內(nèi)生菌的資源進(jìn)行了初步的鑒定和屬的劃分。劉金花等［26］從黃花蒿的根、莖和葉中共分離內(nèi)生菌80株，其中內(nèi)生真菌37株分屬5個(gè)屬，包括囊孢菌（Capsule）、頭孢霉（Cephalosporium）、彎孢霉（Curvularia）、曲霉（Aspergillus）和毛霉（Mucor），內(nèi)生細(xì)菌40株分屬7個(gè)屬，包括泛菌（Pantoea）、土壤桿菌（Agrobacterium）、假單胞菌（Pesudomonas）、芽孢桿菌（Bacillus）、巴斯德氏菌（Pasteurella）、葡萄球菌（Staphylococcus）、黃桿菌（Flavobacterium），內(nèi)生放線菌3株有2個(gè)屬，包括諾卡氏菌（Nocardia）和鏈霉菌（Streptomyces）。黃花蒿內(nèi)生菌的數(shù)量和種類在不同組織器官的分布存在較大差異［26］。李潔［18，19］從黃花蒿全株樣品中共分離出內(nèi)生放線菌228株，分別屬于鏈霉菌屬（Streptomyces，占分離總數(shù)的53.9%）、原小單孢菌屬（Promicromonospora，11.4%）、假諾卡氏菌屬（Pseudonocardia，6.6%）、諾卡氏菌屬（Nocardia，4.8%）、野野村氏菌屬（Nonomuraea，4.4%）、紅球菌屬（Rhodococcus，3.5%）、韓國(guó)生工菌屬（Kribbella，3.1%）、小單孢菌屬（Micromonospora，3.1%）、馬杜拉放線菌屬（Actinomadura，2.6%）、鏈孢囊菌屬（Streptosporangium，1.3%）、擬無枝菌酸菌屬（Amycolatopsis，1.3%）、指孢囊菌屬（Dactylosporangium，0.9%）、芽生球菌屬（Blastococcus，0.4%）、糖霉菌屬（Glycomyces，0.4%）、考克氏菌屬（Kocuria，0.4%）、微球菌屬（Micrococcus，0.4%）、戈登氏菌屬（Gordonia，0.4%）、小雙孢菌屬（Microbispora，0.4%）共18個(gè)已知屬和1個(gè)潛在新屬Phytomonospora（0.4%）。鏈霉菌的分離頻率最高，原小單孢菌次之。而且，部分新的黃花蒿內(nèi)生菌物種已得到詳細(xì)鑒定但功能仍待調(diào)查，如假諾卡氏菌屬YIM 63101T（Pseudonocardia bannaensis sp. nov.）［27］、YIM 63158T（P. kunmingensis sp. nov.）［28］、YIM 63233T（P. serianimatus sp. nov）［29］、YIM 63587T（P. artemisiae sp. nov.）［30］、YIM 63235T（P. antimicrobica sp. nov.）［31］、YIM 63638T（P. xishanensis sp. nov.）［32］，鏈霉菌屬YIM 63135T（Streptomyces artemisiae sp. nov.）［33］、YIM 65594T（S. endophyticus sp. nov.）［34］、YIM 65638T（S. endophyticus sp. nov.）［34］、YIM 65642T（S. endophyticus sp. nov.）［34］，諾卡氏菌屬YIM 65623T（Nocardia artemisiae sp. nov.）［35］，野野村氏菌屬YIM65601T（Nonomuraea endophytica sp. nov.）［36］，紅球菌屬YIM65754T（Rhodococcus artemisiae sp. nov.）［37］和一個(gè)新屬新種YIM65646T（Phytomonospora endophytica gen. nov.，sp. nov.）［38］。這些新的內(nèi)生菌物種的發(fā)現(xiàn)不僅豐富了人類對(duì)微生物多樣性的理解，而且為潛在的工農(nóng)業(yè)應(yīng)用提供了更多的資源和選擇。

6 結(jié)語

迄今為止，黃花蒿內(nèi)生菌的鑒定和開發(fā)已經(jīng)取得了一定的成效，主要集中在抗癌、抗氧化、抗病原菌和促青蒿素產(chǎn)生等方面，在醫(yī)藥開發(fā)和生物防治領(lǐng)域具有重大應(yīng)用價(jià)值。但是，為了進(jìn)一步深入挖掘黃花蒿內(nèi)生菌資源，仍有許多問題亟待解決：（1）由于不同地域、不同季節(jié)、不同生長(zhǎng)階段、不同部位、不同品系的黃花蒿均有可能存在獨(dú)特的內(nèi)生菌群體，因此很難做到百無一漏獲取全部黃花蒿內(nèi)生菌資源。再加上內(nèi)生菌所定殖微環(huán)境的特殊性，所以培養(yǎng)條件的模擬程度將直接關(guān)系到菌株分離的多寡和成敗。（2）目前關(guān)于黃花蒿內(nèi)生菌的研究多停留在初級(jí)的粗體物活性分析層面，缺乏對(duì)具體有效成分的提純及作用機(jī)理和分子機(jī)制的深入探討。因此，對(duì)黃花蒿及其內(nèi)生菌全基因組測(cè)序的開展將有利于鑒定相關(guān)代謝通路的基因或關(guān)鍵酶，為進(jìn)一步開發(fā)和利用黃花蒿內(nèi)生菌資源提供充分理論支持和基因信息。（3）內(nèi)生菌和宿主之間的長(zhǎng)期共生可能導(dǎo)致兩者存在相似或互補(bǔ)的調(diào)控和代謝途徑，因此對(duì)黃花蒿內(nèi)生菌的研究可以嘗試在宿主的背景下進(jìn)行，探索兩者在分子層面互作的機(jī)制，為新的代謝途徑和關(guān)鍵酶的發(fā)掘提供契機(jī)。（4）黃花蒿中通常存在多種內(nèi)生菌，它們之間不同的組合是否有更強(qiáng)的應(yīng)用價(jià)值需要進(jìn)一步探索。（5）黃花蒿及其內(nèi)生菌可以作為一個(gè)很好的模式系統(tǒng)來研究?jī)?nèi)生菌與其宿主的共進(jìn)化，具有重要的理論意義。（6）鑒于黃花蒿還具有獨(dú)特的揮發(fā)性香味、抗逆性強(qiáng)、生物量大等特性，因此，很有必要對(duì)其內(nèi)生菌的非藥用價(jià)值進(jìn)行廣泛挖掘和綜合應(yīng)用。

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（責(zé)任編輯狄艷紅）

Research Progress on Endophytes in Medicinal Plant Artemisia annua

SONG Chun-zhu1CHEN Xin-wen2CHEN Dong-hong1
（1. College of Bioscience and Biotechnology，Hunan Agricultural University，Changsha 410128；2. International College，Hunan Agricultural University，Changsha 410128）

As the most effective anti-malaria Chinese medicinal herb， Artemisia annua has other broad-spectrum of application in medicine and agriculture fields. Furthermore， endophyte resources closely related to it have also become the hot spot for investigation at present. Here， we summarize and sort the research progress on endophytic microbes in sweet wormwood， which are mainly applied on anti-tumor， antioxidant， anti-microbe and the promotion of artemisinin biosynthesis.

Artemisia annua；endophyte；metabolite；anti-tumor；anti-microbe

10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2016.01.002

2015-05-05

湖南省教育廳青年項(xiàng)目（13B045），湖南省科技廳青年基金項(xiàng)目（2015JJ3075）

宋春竹，女，研究方向：植物內(nèi)生菌資源開發(fā)與應(yīng)用；E-mail：158433257@qq.com

陳東紅，男，博士，研究方向：植物內(nèi)生菌資源開發(fā)與應(yīng)用；E-mail：chendh212@163.com