流體剪切力調(diào)節(jié)血管內(nèi)皮細(xì)胞自噬的研究進(jìn)展*

張瑩瑩，曾燁，劉靜霞，閆志平，劉肖珩

(四川大學(xué)華西基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)與法醫(yī)學(xué)院生物醫(yī)學(xué)工程研究室，成都 610041)

1 引 言

血管內(nèi)皮細(xì)胞是襯貼于血管內(nèi)腔面的單層鱗狀細(xì)胞,在整個(gè)血管系統(tǒng)中發(fā)揮著重要的生理功能，對(duì)維持整個(gè)血管系統(tǒng)的正常運(yùn)轉(zhuǎn)有重要作用。在血管內(nèi)皮細(xì)胞中，自噬作為一種防御和應(yīng)激調(diào)控機(jī)制，可以和溶酶體一起在細(xì)胞中作為“垃圾處理廠”發(fā)揮作用，降解體內(nèi)衰老和受損的細(xì)胞，并將胞質(zhì)內(nèi)的部分蛋白質(zhì)(包括受損和錯(cuò)誤折疊的蛋白質(zhì)、大分子、老化和機(jī)能障礙的細(xì)胞器以及蛋白質(zhì)聚集物)消化分解為氨基酸用于供能和生物合成，為細(xì)胞的修復(fù)和再生提供原材料。自噬參與調(diào)節(jié)細(xì)胞物質(zhì)的合成、降解和重新利用之間的代謝平衡，在機(jī)體的免疫、感染、炎癥、腫瘤、心血管病、神經(jīng)退行性疾病等生理病理過程中發(fā)揮著重要的作用。最近有研究表明,細(xì)胞自噬的抑制可能是導(dǎo)致內(nèi)皮細(xì)胞功能紊亂的重要機(jī)制[1]。流體剪切力也是影響血管內(nèi)皮細(xì)胞形態(tài)和功能的重要因素之一，其對(duì)血管內(nèi)皮細(xì)胞形態(tài)和功能的影響是許多疾病研究的重要切入點(diǎn)。血管內(nèi)皮細(xì)胞在體內(nèi)時(shí)時(shí)刻刻都受到血流剪切力的作用。

最新研究表明，自噬參與了剪切力介導(dǎo)的血管內(nèi)穩(wěn)態(tài)的維持，且流體剪切力能夠調(diào)節(jié)血管內(nèi)皮細(xì)胞自噬的發(fā)生，有關(guān)其作用及機(jī)理的研究正在成為生命科學(xué)領(lǐng)域新的研究熱點(diǎn)。

2 血管內(nèi)皮細(xì)胞生理功能

血管內(nèi)皮細(xì)胞是血管腔面的一薄層扁平細(xì)胞，直接接觸血液，其主要的生理功能有：(1)屏障功能。血管內(nèi)皮細(xì)胞是和血液直接接觸的一道天然屏障，由于內(nèi)皮細(xì)胞具有獨(dú)特的結(jié)構(gòu)和代謝特性，能選擇性的調(diào)節(jié)小分子至超大分子物質(zhì)通過血管壁，減少血管通透性，調(diào)節(jié)組織與血液的物質(zhì)交換，防止血漿成分和血液細(xì)胞無序地侵入[2]。(2)分泌功能。血管內(nèi)皮細(xì)胞可以通過膜受體感知血流動(dòng)力學(xué)和血源性信號(hào)的變化,合成并分泌多種生物活性物質(zhì)來調(diào)節(jié)血管張力、維持血管壁的完整性并維持血液的正常流動(dòng)狀態(tài)。其中有血管舒張因子，如一氧化氮、前列環(huán)素等；血管收縮因子，如內(nèi)皮素-1等；促凝因子，如組織因子等；抗凝因子，如一氧化氮、肝素等；以及其他血管活性因子，如白細(xì)胞介素、硫酸乙酰肝素等。正常生理狀態(tài)下，舒張血管與收縮血管作用、促凝與抗凝作用保持動(dòng)態(tài)平衡，使血液不致發(fā)生凝固而形成血栓。當(dāng)機(jī)體血管內(nèi)有血栓(包括微血栓)形成時(shí)，其溶解纖維蛋白系統(tǒng)則被激活，溶解和去除血栓中的纖維蛋白。(3)參與血管生成。在血管形成因素的刺激下，內(nèi)皮細(xì)胞能分泌內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)因子(VEGF)、胰島素生長(zhǎng)因子-1(IGF-1)、血小板衍生生長(zhǎng)因子(PDGF)等形成完整血管所必需的生長(zhǎng)因子。這種參與血管生成的功能，在一些生理狀態(tài)如子宮內(nèi)膜增厚和病理狀態(tài)如腫瘤等都有體現(xiàn)。

3 自噬對(duì)血管內(nèi)皮細(xì)胞功能的影響

自噬是一種應(yīng)激狀態(tài)下大分子物質(zhì)和細(xì)胞器的降解及再循環(huán)的過程[3-4]，可以在多種應(yīng)激狀態(tài)下被激活，比如饑餓、氧化、線粒體DNA損傷以及炎癥[5-6]。雖然過度的自噬會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞死亡，但在正常情況下，細(xì)胞自噬被認(rèn)為是一種細(xì)胞自我保護(hù)和適應(yīng)性的機(jī)制[7]。

目前研究表明，細(xì)胞自噬和血管生成之間存在著某種負(fù)反饋的關(guān)系，血管內(nèi)皮細(xì)胞自噬可能是其發(fā)揮抗血管生成作用的一種機(jī)制。血管生成是指從已存在的血管床中產(chǎn)生出新生血管系統(tǒng), 是一個(gè)包括血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖、遷移及胞外基質(zhì)降解的多步驟復(fù)雜過程[8]。腫瘤血管生成是所有實(shí)體腫瘤的共同特征，是實(shí)體腫瘤生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移必須依賴的病理學(xué)基礎(chǔ)，與腫瘤的生長(zhǎng)、侵襲轉(zhuǎn)移關(guān)系極為密切。抗血管生成作用在惡性腫瘤的預(yù)防和治療方面具有重要的意義。人類纖溶酶原(Kringle 5,K5)和內(nèi)皮抑素(endostatin，ES)是有效的血管生成抑制劑，這些抑制劑通過各種細(xì)胞內(nèi)信號(hào)通路誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡和抑制細(xì)胞增殖[9-10]。有研究表明[11]，K5和ES除了能誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡外，還可以促進(jìn)血管內(nèi)皮細(xì)胞的自噬。Nguyen[12]等的研究也顯示，K5可以誘導(dǎo)血管內(nèi)皮細(xì)胞發(fā)生特異性自噬，并且這種自噬在沒有營養(yǎng)應(yīng)激的情況下也可以被引發(fā)。他們認(rèn)為，K5與內(nèi)皮細(xì)胞表面的葡萄糖調(diào)節(jié)蛋白78(glucose-regulatedprotein-78, GRP-78)結(jié)合，而GRP-78與缺氧及內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激反應(yīng)有著密切的關(guān)系，進(jìn)而影響B(tài)eclin 1表達(dá)，K5就是通過使Beclin 1表達(dá)增加來調(diào)節(jié)內(nèi)皮細(xì)胞自噬，如果延長(zhǎng)K5的處理時(shí)間，最終會(huì)通過血管內(nèi)皮細(xì)胞線粒體膜去極化和胱天蛋白酶的活化而導(dǎo)致細(xì)胞凋亡，因此，發(fā)揮抗血管生成作用。這些結(jié)果提示，K5可以引起內(nèi)皮細(xì)胞發(fā)生自噬并產(chǎn)生抗血管生成作用，抗血管生成作用的產(chǎn)生可能與細(xì)胞自噬有關(guān)。Nguyen[13]等也曾在研究中用ES成功誘導(dǎo)自噬。Maes等[14]在研究中表明自噬基因缺失的小鼠在做了腫瘤感染的處理后，由于血管生成,自噬基因缺失的小鼠比未做基因缺失的小鼠更能誘導(dǎo)一些腫瘤的發(fā)生。AKT3信號(hào)通路是血管生成過程的關(guān)鍵信號(hào)通路[15]，Corum等[16]在研究中發(fā)現(xiàn)小鼠AKT3基因敲除可以誘導(dǎo)發(fā)生細(xì)胞自噬。這些結(jié)果都提示，內(nèi)皮細(xì)胞自噬可能參與了抗血管生成作用。

自噬與NO的調(diào)節(jié)也有很大關(guān)系。NOS/NO系統(tǒng)在多種心血管疾病的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮著重要的作用，血管內(nèi)皮細(xì)胞釋放的NO能抑制血小板聚集及白細(xì)胞黏附在血管壁,抑制血管平滑肌增生,抑制單核巨噬細(xì)胞浸潤,從而抑制動(dòng)脈粥樣硬化的發(fā)生和發(fā)展[17]。Bharath等[18]的研究表明在剪切力的作用下，被敲除自噬基因的內(nèi)皮細(xì)胞內(nèi)皮型一氧化氮合酶(endothelial nitric oxide synthase，eNOS)的磷酸化增加，NO的產(chǎn)生明顯被抑制，同時(shí)自噬的抑制使內(nèi)皮細(xì)胞活性氧和一些細(xì)胞炎性因子的產(chǎn)生增加?？梢?，自噬參與了剪切力介導(dǎo)的血管內(nèi)穩(wěn)態(tài)的維持。細(xì)胞自噬的缺失很可能是導(dǎo)致內(nèi)皮細(xì)胞功能紊亂的重要機(jī)制，而且自噬的發(fā)生加強(qiáng)了內(nèi)皮細(xì)胞對(duì)其正常功能的維護(hù)[1]。此外，大多數(shù)動(dòng)脈粥樣硬化斑塊都呈現(xiàn)出自噬的標(biāo)志物，并且伴隨著動(dòng)脈粥樣硬化的發(fā)展，自噬功能逐漸紊亂[19]。

4 流體剪切力對(duì)血管內(nèi)皮細(xì)胞的影響

4.1 流體剪切力對(duì)血管內(nèi)皮細(xì)胞功能的影響

在正常的血液系統(tǒng)中，血管內(nèi)皮細(xì)胞無時(shí)無刻不受血流作用力的影響。血流作用力主要有三種，分別是靜水壓力、周向拉伸應(yīng)力和流體剪切力。其中流體剪切力在調(diào)節(jié)內(nèi)皮細(xì)胞功能有重要作用。有研究表明[20]，流體剪切力作用于內(nèi)皮細(xì)胞表面G蛋白可觸發(fā)內(nèi)皮細(xì)胞內(nèi)的一些磷酸化過程，導(dǎo)致血管內(nèi)皮細(xì)胞沿血流方向發(fā)生重排，同時(shí)調(diào)控核因子kB介導(dǎo)的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，進(jìn)而調(diào)節(jié)內(nèi)皮細(xì)胞多種基因如編碼生長(zhǎng)因子、粘附因子、血管活性物質(zhì)、凝血因子和趨化因子等的基因表達(dá)。血液是一種粘性流體,由于粘性的存在,在管道中流動(dòng)的流體出現(xiàn)了分層流動(dòng)，各層流體只做相對(duì)滑動(dòng)而彼此不相混合，這種現(xiàn)象稱為層流。層流能夠促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞的存活，使內(nèi)皮細(xì)胞按照血流方向排列，并促進(jìn)血管舒張物質(zhì)和抗凝物質(zhì)的分泌[21],同時(shí)層流能夠使內(nèi)皮細(xì)胞自噬的表達(dá)上調(diào)[1]。

流體剪切力也能夠影響血管內(nèi)皮細(xì)胞遷移并刺激血管生成，在血管生成過程中發(fā)揮重要作用[22]。流體剪切力作用下，血管內(nèi)皮細(xì)胞的微脈管系統(tǒng)生長(zhǎng)加快[23]，這種結(jié)果可能和流體剪切力能使血管內(nèi)皮細(xì)胞釋放NO有關(guān)。NO是在血管內(nèi)皮細(xì)胞的血管生成過程中起關(guān)鍵作用的一種信號(hào)分子[24]，流體剪切力能夠激活一氧化氮合酶刺激血管內(nèi)皮細(xì)胞產(chǎn)生NO,而NO的產(chǎn)生促進(jìn)了內(nèi)皮小管的形成[25]。

4.2 流體剪切力對(duì)血管內(nèi)皮細(xì)胞自噬的調(diào)節(jié)

細(xì)胞自噬和流體剪切力都能夠影響血管內(nèi)皮細(xì)胞的功能，都是維持血管內(nèi)皮細(xì)胞正常生理功能的重要因素，都是研究相關(guān)疾病的重要切入點(diǎn)。近年來，一些研究者開始關(guān)注這兩種因素之間的相互作用。2011年King[26]等在自己的研究中提出機(jī)械應(yīng)力可以誘導(dǎo)人乳腺癌細(xì)胞MDA-MB-231發(fā)生自噬，之后Chen等[27]在2012年提出流體剪切力的加載可以抑制人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞上雷帕霉素靶蛋白(mammalian target of rapamycin，mTOR)的表達(dá)，而且microRNA-101(miR-101)在這個(gè)過程中發(fā)揮著重要的作用。mTOR是氨基酸、ATP和激素的感受器，它在調(diào)節(jié)細(xì)胞生長(zhǎng)和自噬的發(fā)生過程有重要作用。mTOR可以抑制自噬上游Atg1/Ulk復(fù)合物[28]，激活mTOR可以抑制細(xì)胞自噬的發(fā)生，抑制mTOR能誘導(dǎo)細(xì)胞自噬的發(fā)生[29]。人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞加載12 dyn/cm2的剪切力12 h后，miR-101的表達(dá)明顯上調(diào)；miR-101模擬物(mimics)使包含mTOR質(zhì)粒的熒光酶素降低，內(nèi)皮細(xì)胞的mTOR表達(dá)降低,使細(xì)胞周期停滯于G1期，從而抑制了內(nèi)皮細(xì)胞的增殖；miR-101抑制劑(inhibitor)則使流體剪切力對(duì)mTOR表達(dá)的抑制作用減弱。通過這項(xiàng)研究，研究者們認(rèn)為流體剪切力和細(xì)胞自噬之間也應(yīng)存在著某種關(guān)系。之后，JUAN等人[1]在研究中證實(shí)了流體剪切力與細(xì)胞自噬之間的關(guān)系。他們用體外灌流系統(tǒng)分別對(duì)經(jīng)過自噬激動(dòng)劑和抑制劑處理過的人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞及家兔動(dòng)脈進(jìn)行流體剪切力的加載，檢測(cè)內(nèi)皮細(xì)胞自噬的表達(dá)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)流體剪切力可以促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞發(fā)生自噬。剪切力和自噬激動(dòng)劑的同時(shí)作用，加強(qiáng)了內(nèi)皮細(xì)胞自噬。

最近，Ding等人[30]在研究中發(fā)現(xiàn)LOX-1在流體剪切力調(diào)節(jié)內(nèi)皮細(xì)胞自噬的過程中扮演者非常重要的角色，并且低剪切力相對(duì)于高剪切力來說對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞自噬的調(diào)節(jié)作用更加明顯。LOX-1是內(nèi)皮細(xì)胞對(duì)氧化性低密度脂蛋白的一個(gè)重要受體，LOX-1在細(xì)胞多種病理生理過程中多發(fā)揮著重要的作用，包括內(nèi)皮細(xì)胞增殖、凋亡、活性氧自由基的產(chǎn)生以及炎癥[31-35]。LOX-1的表達(dá)與內(nèi)皮細(xì)胞自噬有關(guān)[36]，流體剪應(yīng)力也在LOX-1的表達(dá)中發(fā)揮著重要的作用[33]。他們?cè)趯?shí)驗(yàn)中分別用3、15、30 dyn/cm2的流體剪切力通過體外灌流系統(tǒng)來誘導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞自噬，結(jié)果表明3 dyn/cm2大小的低剪切力可以明顯誘導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞自噬的發(fā)生，而隨著流體剪切力的變大，對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞自噬的誘導(dǎo)逐漸被抑制。他們還分別檢測(cè)了小鼠主動(dòng)脈分叉處、主動(dòng)脈弓處、胸動(dòng)脈和髂動(dòng)脈處的內(nèi)皮細(xì)胞自噬的發(fā)生及LOX-1的表達(dá)，結(jié)果表明主動(dòng)脈分叉處的內(nèi)皮細(xì)胞自噬和LOX-1的表達(dá)明顯高于主動(dòng)脈弓處、胸動(dòng)脈和髂動(dòng)脈處，造成這種變化的原因也是主動(dòng)脈分叉處血液的流體剪切力較低。他們還用炎性因子LPS刺激內(nèi)皮細(xì)胞后檢測(cè)自噬的表達(dá)，結(jié)果表明炎癥狀態(tài)下內(nèi)皮細(xì)胞自噬和LOX-1的表達(dá)明顯增強(qiáng)，其中LOX-1基因敲除的小鼠自噬表達(dá)降低，而LOX-1超表達(dá)的小鼠的內(nèi)皮細(xì)胞自噬的表達(dá)明顯升高。以上結(jié)果表明，低剪切力對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞自噬有非常重要的調(diào)節(jié)作用，而且與炎癥環(huán)境下的血管內(nèi)皮細(xì)胞功能變化密切相關(guān)。

目前，對(duì)于流體剪切力是否通過mTOR調(diào)節(jié)細(xì)胞自噬，有研究者提出了不同看法。Liu等[37]利用12或20 dyn/cm2的層流剪切力(Flexcell streamer平行平板流動(dòng)腔)作用人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞，并沒有發(fā)現(xiàn)mTOR的磷酸化水平有顯著性變化，但是他們發(fā)現(xiàn)組蛋白脫乙酰酶Sirt1(Sirtuin type 1)參與剪切力對(duì)細(xì)胞自噬的調(diào)控，Sirt1基因的抑制使剪切力介導(dǎo)的自噬發(fā)生減少，而超表達(dá)則促進(jìn)了這種自噬的發(fā)生。已有研究表明，Sirt1可直接通過調(diào)控自噬相關(guān)基因(autophagy-related gene，ATG)如ATG5、ATG7、ATG8的表達(dá)參與細(xì)胞自噬的調(diào)節(jié)[38]?？梢?，流體剪切力對(duì)細(xì)胞自噬的調(diào)節(jié)機(jī)制較為復(fù)雜，目前并不完全清楚。

5 展望

綜上所述，流體剪切力可調(diào)節(jié)血管內(nèi)皮細(xì)胞的功能，如受體基因表達(dá)、細(xì)胞因子分泌、遷移等促進(jìn)血管生成。而內(nèi)皮細(xì)胞自噬則參與了抗血管生成的過程?？梢姡黧w剪切力和內(nèi)皮細(xì)胞自噬對(duì)血管生成的調(diào)節(jié)作用存在一個(gè)有效平衡。而研究又表明流體剪切力對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞自噬存在調(diào)節(jié)作用，那么，研究者推測(cè)流體剪切力是調(diào)控上述平衡的關(guān)鍵因素。對(duì)于流體剪切力的具體調(diào)節(jié)作用及相關(guān)分子機(jī)制的研究仍處于起步階段，深入地進(jìn)行這些研究可以為我們研究血管生成機(jī)制提供新的切入點(diǎn)，而相關(guān)成果也將有助于我們好的預(yù)防和治療相關(guān)癌癥以及心血管疾病。