miRNA在動物胚胎形成、發(fā)育中的研究進展

范文濤, 鐘楊生, 陳芳艷, 嚴會超, 林健榮

(華南農(nóng)業(yè)大學 動物科學學院， 廣州 510642)

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miRNA在動物胚胎形成、發(fā)育中的研究進展

范文濤, 鐘楊生, 陳芳艷, 嚴會超, 林健榮

(華南農(nóng)業(yè)大學 動物科學學院， 廣州 510642)

摘 要MicroRNA(miRNA)是一類內(nèi)源性的非編碼小分子RNA，在20到24個堿基之間，普遍存在于動、植物等多種生物中，通過與靶基因特異結(jié)合引起靶基因mRNA的降解或抑制蛋白質(zhì)的翻譯，有著廣泛的生物學功能。動物的生殖、胚胎發(fā)育在動物的繁衍、進化上有著重要地位，目前研究發(fā)現(xiàn)miRNA對其有著重要的調(diào)控作用。闡釋動物生殖、胚胎發(fā)育的 miRNA分子調(diào)控的機制有重要的作用，就近年來對miRNA 在動物胚胎形成和發(fā)育的研究進行綜述。

關鍵詞miRNA；胚胎；發(fā)育

Research progress of miRNA regulation in animal embryo formation and development

FAN Wen-tao， ZHONG Yang-sheng， CHEN Fang-yan, YAN Hui-chao， LIN Jian-rong

(College of Animal Science, South China Agricultural University, Guangzhou 510642, China)

AbstractMicroRNA(miRNA)is a class of endogenous non-coding small RNA molecules that are between 20 and 24 bases, it widely exists in animals，plants and other livings and binds to the gene-specific target gene mRNA to cause degradating or inhibiting protein translation, and has a wide range of biological functions. The formation and development of embryo takes an important position on animal reproduction and evolution. Recent studies showed that miRNA had effect on animal reproduction and embryonic development. To explain the molecular mechanism of its regulation, this paper reviewed the research of miRNA in animal embryo formation and development.

KeywordsmiRNA; embryo; development

在真核生物中，microRNA(miRNA)作為基因表達的重要調(diào)節(jié)因子，可以在轉(zhuǎn)錄或轉(zhuǎn)錄后水平上進行調(diào)控，能精細地調(diào)節(jié)某特定細胞和組織類型的靶基因表達，自在秀麗隱桿線蟲Caenorhabditiselegans和黑腹果蠅drosophilamelanogaster中發(fā)現(xiàn)lin-4 和let-7 調(diào)控幼蟲發(fā)育以來，掀起了研究 miRNA 的熱潮，研究發(fā)現(xiàn) miRNA 對細胞的增殖、分化、凋亡、胚胎發(fā)育等廣泛的生物過程起重要的調(diào)控作用[1， 2]。動物胚胎的形成與發(fā)育是個體形成、繁衍后代和種群進化中的重要一環(huán)，lin-4 是最早發(fā)現(xiàn)的miRNA，有調(diào)控線蟲胚胎后期發(fā)育的功能，通過突變或敲除 miRNA 形成的關鍵因子發(fā)現(xiàn)了 miRNA 在胚胎的形成和發(fā)育調(diào)控中有重要的作用。2001年Grishok等發(fā)現(xiàn)突變線蟲合成 miRNA 的關鍵基因dicer的同源基因dcr-1 后引起生殖發(fā)育系統(tǒng)異常，母系和子代的dicer同時受到抑制將導致胚胎死亡，敲除dcr-1 后的果蠅生殖干細胞分裂異常，敲除形成 miRNA 的重要分子Loqs，引起雌性果蠅不育，斑馬魚zebrafish突變dicer-1、小鼠Musmusculus敲除dicer后導致胚胎發(fā)育遲緩，最終胚胎死亡。基于 miRNA 對胚胎形成與發(fā)育有重要的調(diào)控作用，本文將從動物生殖系統(tǒng)，生殖細胞形成與發(fā)育，胚胎發(fā)育早、中、后期 miRNA 參與的調(diào)控進行綜述。

1miRNA 概述

MicroRNA (miRNA) 是一類含有 20 到 24 個堿基的小分子 RNA 片段，是內(nèi)源性產(chǎn)生的非編碼 RNA，最先在秀麗隱桿線蟲(C.elegans)和黑腹果蠅(D.elanogaster)中發(fā)現(xiàn)。miRNA 廣泛存在于動、植物、線蟲、病毒等多種有機體中并且調(diào)控著許多重要的生理功能。在動物系統(tǒng)中，miRNA 主要通過與靶基因 mRNA 的 3′UTR區(qū)特異結(jié)合引起 mRNA 的降解或抑制蛋白的翻譯，其中 miRNA 中心位點(3′端 2～8 位)處與靶基因的結(jié)合可以允許一定數(shù)量的堿基錯配。miRNA高度的保守性、時序性和組織特異性，使其精細地調(diào)節(jié)著某特定細胞和組織類型的靶基因表達[1， 2]。有特異生物功能的 miRNA 的篩選主要通過 miRNA 的芯片技術、Northern 雜交、原位雜交和實時定量 PCR 獲得。對 miRNA 靶基因的預測有生物信息學法和生物學實驗方法兩種。生物信息學方法主要是根據(jù) miRNA 與靶基因的相互作用等幾個原則設計而成的算法軟件，主要有 miRanda、TargetScan、Ranhybrid、DINA-microT、PicTar、RNA22、PITA等[3]，生物學實驗法主要從 mRNA 和蛋白質(zhì)水平上尋找靶基因，從 mRNA 水平上利用 AGO 蛋白家族能同時結(jié)合 miRNA 和靶 mRNA 的原理，通過免疫共沉淀將 miRNA-mRNA-蛋白質(zhì)復合物分離出來[4]；并根據(jù) miRNA 抑制 mRNA 翻譯的原理，輔以同位素氨基酸的細胞培養(yǎng)，對靶蛋白質(zhì)進行精確確定[5]。目前用實驗驗證 miRNA 靶基因的方法并不多，最為常用的是雙熒光素酶報告基因法[6]。miRNA 調(diào)控功能的研究主要通過兩種策略：過表達或抑制 miRNA表達。前者通過把 miRNA、化學合成 miRNA 的模擬物或 miRNA 的表達載體導入細胞中引起 miRNA 的過表達，觀察靶基因的 mRNA 及其編碼的蛋白質(zhì)的表達情況，以進行信號通路的研究；后者在細胞中轉(zhuǎn)入 miRNA 相應的 miRNA inhibitor 或抑制物的表達載體，抑制物導入細胞后特異地與靶 miRNA 結(jié)合，阻止了 miRNA 對 mRNA 的降解或?qū)Φ鞍踪|(zhì)翻譯抑制的作用，上調(diào) miRNA 靶基因的表達，從而觀察發(fā)生的生物學功能的變化。通過對 miRNA 功能的研究探討發(fā)現(xiàn)，miRNA對細胞的增殖、分化、凋亡、胚胎發(fā)育、器官形成、神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育、激素調(diào)節(jié)等廣泛的生物過程起重要的調(diào)控作用。

2 miRNA 調(diào)控胚胎形成與發(fā)育

2.1動物胚胎形成與發(fā)育

動物胚胎形成、發(fā)育是新生命誕生的重要一環(huán)，其生理過程極為復雜：精、卵細胞的形成，經(jīng)歷受精，然后經(jīng)過有序的發(fā)育包括細胞增殖、遷移并發(fā)揮干細胞的潛能進行細胞分化獲得維持身體的基本骨架和執(zhí)行生理功能的組織器官。

2.2miRNA 對動物生殖系統(tǒng)的調(diào)控

動物胚胎的形成需要完整的雌雄生殖系統(tǒng)，miRNA 對生殖系統(tǒng)的發(fā)育有重要的意義。piRNA 對生殖系統(tǒng)有著重要的調(diào)控作用，2007 年 Seto 等在果蠅中發(fā)現(xiàn)piwi引起生殖干細胞因不對稱分裂功能的缺失而不能自我更新導致成年果蠅喪失繁育能力，aub突變則引發(fā)雄蠅不育及卵子形態(tài)異常。在小鼠中同樣發(fā)現(xiàn)piwi亞家族的3個基因Miwi、Miwi2、Mili的敲除都導致雄性不育[7-9]。Legeai 等[10]發(fā)現(xiàn) miR-34，miR-X47，miR-X103，miR-307*和 miR-X52*在豌豆蚜Acyrthosiphonpisum孤雌生殖與有性生殖階段中差異表達，暗示著昆蟲的生殖方式受到它們的關鍵調(diào)控。Cristion 等[11]研究發(fā)現(xiàn)德國小鐮Blattelagermanica中特有的 170 個 miRNA 大部分能在卵巢小 RNA 數(shù)據(jù)庫中匹配， 提示它們對卵巢發(fā)育不可或缺。

2.3miRNA 對生殖細胞的調(diào)控

miRNA 調(diào)控與生殖細胞正常的發(fā)生、增殖與分化密切相關。 miR-4、miR-7、miR-11、miR-79 作用Bob影響生殖細胞發(fā)生[12-14]，繼而 Kugler 等[15]發(fā)現(xiàn)胚胎期控制核分裂的 miR-969 和 miR-9c，異常表達后使果蠅原始生殖細胞( Primordial germ cell，PGC) 數(shù)目減少，miR-430 能抑制類 Clq 因子使 PGC 明顯地減少[16]。2009 年，Yang 等發(fā)現(xiàn)果蠅中的bantam和 dFmrl 蛋白質(zhì)互作以維持雌性生殖干細胞的發(fā)育，同年 Yu 等發(fā)現(xiàn) miR-7、miR-278 和 miR-309 通過調(diào)控細胞周期影響生殖干細胞的發(fā)育。另外有研究發(fā)現(xiàn)，在生殖干細胞分化、調(diào)節(jié)卵子發(fā)生和早期胚胎的發(fā)育中 miR-184 有重要的調(diào)控作用[17]。

2.4miRNA 調(diào)控動物早期胚胎的發(fā)育

動物胚胎干細胞早期發(fā)育主要是自我更新和增殖。Kugle 等[20]研究發(fā)現(xiàn)胚胎干細胞的增殖需要大量 miRNA 的參與，在果蠅卵巢中 miR-989 大量富集，主要掌控卵室細胞的遷移，卵室形成及成熟的延遲甚至畸形是其異常表達的結(jié)果。Mikhaleva 等[18]發(fā)現(xiàn)piwi在早期胚胎的形成過程中使生殖細胞從其它胚胎細胞中分離出來形成胚牙，并控制著早期胚胎的有絲分裂，當piwi缺失時導致早期胚胎不能向原腸胚形成發(fā)育而引發(fā)胚胎發(fā)育停止, 在早期胚盤細胞膜形成之前, 處在細胞核中的piwi和纖維蛋白的共區(qū)域化與細胞核的分裂同時發(fā)生, 因此piwi和纖維蛋白共同作為早期胎細胞核的分子標志[19]。miRNA 通過控制細胞凋亡機制的開關維持胚胎干細胞的活性和分化塑形。果蠅中的 miR-2、miR-6、miR-11和miR-13 作用于grim、rpr、skl使胚胎發(fā)生過程中細胞凋亡，在小鼠中發(fā)現(xiàn)let-7 抑制自我更新程序，相應的果蠅中的bantam，下調(diào)hid的表達抑制細胞凋亡而維持胚胎的發(fā)育。另外在哺乳動物中，miRNA 還調(diào)控著胚胎的著床，miR-429 通過負調(diào)控Pcdh8 的表達而抑制著床期的胚胎細胞的上皮細胞向間葉細胞轉(zhuǎn)化的過程[21]，miR-181 下調(diào) LIF 導致胚胎著床失敗[22]。

2.5miRNA 調(diào)控動物中、后期胚胎的發(fā)育

胚層發(fā)育、組織器官的形成也受到 miRNA 的嚴格調(diào)控。 miR-184 作用K10、tramtrack使卵殼背腹性形成，前后胚囊層形成，miR-4、miR-79 作用bap影響中胚層發(fā)育。2007 年 Silver 等發(fā)現(xiàn) miR-315 調(diào)控果蠅胚軸的發(fā)育，次年Ivey 等在小鼠中 miR-1 能促進中胚層形成和向心臟分化的過程。在果蠅中 miR-310 s 家族以及受 miR-12、miR-283、miR-304 協(xié)同控制的 Hedgehog 信號途徑協(xié)同調(diào)控下保證胚胎體軸正常的形成[23]。miR-430 可能促進由母體卵子遺傳信息控制向胚胎控制的過渡，影響后期胚胎的生長和發(fā)育，能在一定程度上恢復由缺乏 Dicer 引起的胚胎發(fā)育異常。果蠅組織的正常生長需要bantam表達的 Hippo 信號途徑作用的 Yorkie 轉(zhuǎn)錄活化因子能活化細胞周期 E(Cyclin E)與細胞凋亡因子 DIAP1 協(xié)同bantam控制[24]。

2.6miRNA 調(diào)控信號通路中的關鍵因子影響胚胎發(fā)育

miRNA 通過作用于胚胎發(fā)育中重要的信號通路如 NOTCH、TGF-β、EGF和 SHH 中的關鍵因子調(diào)控胚胎的發(fā)育。研究發(fā)現(xiàn) miR-20a 通過作用小鼠胚胎成纖維細胞的 p16、LRF-p19ARF信號通路影響細胞的衰老[12, 25]。miRNA 還能夠通過控制開關信號途徑參與生殖干細胞的自我維持和更新，如 Notch 信號途徑和骨形態(tài)發(fā)生蛋白(bone morphogenetic proteins，BMP)信號途徑維持果蠅生殖干細胞(Germline stem cells，GSCs)的未分化狀態(tài)。

2.7miRNA 在胚胎發(fā)育中的其它可能調(diào)控

miRNA在動物胚胎發(fā)育中還有很多未知的方式參與調(diào)控。如缺乏 miRNA 型的小鼠胚胎能夠存活但繼續(xù)分裂失敗。Jayachandran 等[26]發(fā)現(xiàn)在成蟲期飼喂 har-miR-2002b 的類似物使棉鈴蟲Helicoverpaarmigera的繁殖力下降 70%，推測其中存在某種未知的調(diào)控方式調(diào)控棉鈴蟲的胚胎發(fā)育。果蠅胚胎早期發(fā)育可能涉及Mirtron的調(diào)節(jié)[27, 28]。小鼠中 miR-21 的表達只在胚胎形成階段可以探測到。Zhang 等[29]發(fā)現(xiàn)家蠶Bombyxmori中 248 個 miRNAs 只在卵或蛹中特異表達，其中 miR-1、bantam、miR-29、miR92 與胚胎的生成有關。Lagos-Quintana 等發(fā)現(xiàn) miR-3、miR-7 只在果蠅胚胎早期出現(xiàn)推測其可能與胚胎的早期發(fā)育有關。 Jagadeeswaran 等[30]挖掘的 14 個新的 miRNAs 具有階段性表達的特性，其中 bmo-mir-2763 可能作用于決定胚胎的滯育與否的滯育激素受體-4，bmo-mir-2733e 可能作用 NADPH 細胞色素P450 還原酶，影響 20-羥基蛻皮激素的形成進而影響昆蟲的胚胎發(fā)育。

3展望

目前 miRNA 的研究還存在一定的不足，很多未知的 miRNA 有待挖掘，再者對 miRNA 功能的鑒定工作遠遠落后于新 miRNA 更新的速度，還無法實現(xiàn)高通量化及系統(tǒng)化。加速新 miRNA 挖掘工作和 miRNA 未知功能的鑒定有助于動物胚胎的研究工作。動物胚胎生成與發(fā)育中 miRNA 調(diào)控的研究涉及到生殖系統(tǒng)的發(fā)育、生殖細胞的形成發(fā)育、胚胎細胞的增殖與分化等多方面，隨著 miRNA 對動物胚胎的形成和發(fā)育機制闡釋的深入，且 miRNA 有很好的跨物種保守性，有助于對各物種間胚胎的理解，有望應用在病蟲害的防治、優(yōu)勢品種的培育、珍稀動物的繁育及滯育胚胎的研究等。

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中圖分類號Q522；Q954.4

文獻標識碼A

文章編號2095-1736(2016)02-0091-04

作者簡介：范文濤，在讀碩士，研究方向為家蠶遺傳與分子生物學，E-mail:VentaVan@163.com；通信作者：鐘楊生，講師，博士，研究方向為家蠶遺傳與分子生物學，E-mail:zhongyangsh@scau.edu.cn。

基金項目：國家自然科學基金(31272368)；國家現(xiàn)代農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)技術體系建設專項(CARS-22)；廣東省自然科學基金(S2011010001893)

收稿日期：2015-05-25；修回日期：2015-06-03

doi∶10.3969/j.issn.2095-1736.2016.02.091