丁酸梭菌創(chuàng)制技術(shù)及在動物養(yǎng)殖中的應(yīng)用

吳麗媛，張守明

（安陽市畜產(chǎn)品質(zhì)量安全監(jiān)測檢驗中心，河南 安陽 455000）

丁酸梭菌是一種革蘭氏陽性厭氧梭狀內(nèi)生芽孢桿菌，一般存在于土壤、健康動物糞便中，因能夠產(chǎn)生以丁酸為主要成分的有機酸而命名為丁酸梭菌。最早在1880年由Prazmowski 從豬的腸道中分離出來，1996年，我國篩選出第一株用于治療大腸桿菌、沙門氏菌等引起的腸炎、腹瀉的CGMCC313-1 菌株。丁酸梭菌制劑隨后在動物養(yǎng)殖生產(chǎn)中開始迅速開發(fā)研究、推廣應(yīng)用。

1 丁酸梭菌的創(chuàng)制技術(shù)工藝

丁酸梭菌制劑的制備方法較多，有不少優(yōu)化生產(chǎn)工藝，比如在菌種制備、接種量、發(fā)酵培養(yǎng)基和添加物等環(huán)節(jié)以及創(chuàng)制環(huán)境溫度、發(fā)酵罐轉(zhuǎn)速和壓力等要求上有所差別，但是，丁酸梭菌及其菌制劑的生產(chǎn)工藝大體包括菌種的活化及種子液的制備、液體發(fā)酵、發(fā)酵液干燥。

1.1 菌種的活化

首先制作活化液。取GAM 培養(yǎng)基50.0g，加熱溶解1000mL 蒸餾水中，120℃高壓滅菌10min，冷卻至室溫，再加入脫纖維兔血60mL，氯化血紅素1.5g，卡那霉素80mg，萬古霉素1mg，新霉素80mg，混勻，得到活化液。其次，在厭氧條件下，培養(yǎng)菌種。從保存有丁酸梭菌菌種的保存培養(yǎng)皿上挑取丁酸梭菌菌株至活化液中，37℃下培養(yǎng)24～36h。

1.2 一級種子培養(yǎng)液

將純種活化制備好的丁酸梭菌活化液厭氧環(huán)境下接種到發(fā)酵罐內(nèi)的發(fā)酵培養(yǎng)基中，一般接種量為2%～7%，在發(fā)酵溫度37℃和罐壓為0.1～0.5Mpa 下進(jìn)行一級種子液的培養(yǎng)。這期間發(fā)酵罐平均轉(zhuǎn)速為500r/min，速度過高，不利于種子液的生成培養(yǎng)。值得注意的是培養(yǎng)全程要通入氮氣，對環(huán)境酸度也有嚴(yán)格要求，一般控制培養(yǎng)環(huán)境pH 值為4.0～5.0，發(fā)酵培養(yǎng)時間不超過10h，作為一級種子培養(yǎng)液。上述發(fā)酵培養(yǎng)基組成：牛肉粉膏0.3%、胰蛋白胨1%、酵母粉0.5%、氯化鈉0.2%、葡萄糖2%、乙酸鈉0.2%、硫酸鎂0.02%、L- 半胱氨酸鹽酸鹽0.02%、硫酸錳0.01%、磷酸氫二鉀0.2%、碳酸鈣0.5%、水余量。

1.3 二級種子培養(yǎng)

整個過程與一級培養(yǎng)液的要求和生產(chǎn)工藝相似。將制備好的二級培養(yǎng)種子液接種到發(fā)酵罐的發(fā)酵培養(yǎng)基中，接種量為1%～5%，在溫度為30～37℃、罐壓為0.05～0.10Mpa 下進(jìn)行二級種子液培養(yǎng)，發(fā)酵罐轉(zhuǎn)速為100～200r/min，培養(yǎng)全程通入氮氣，并控制培養(yǎng)環(huán)境pH 值為5.0～6.0，發(fā)酵培養(yǎng)8～10h，發(fā)酵結(jié)束后，收集二級發(fā)酵種子液。

1.4 發(fā)酵培養(yǎng)

將收集到的二級發(fā)酵種子液立即接種至發(fā)酵罐中，使得丁酸梭菌快速適應(yīng)，進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng)，發(fā)酵溫度30～37℃，接種量為3%～5%，罐壓為0.05～0.10Mpa，培養(yǎng)全程通入氮氣，發(fā)酵罐轉(zhuǎn)速為100～200r/min，并控制培養(yǎng)環(huán)境pH 值為5.0～6.0，發(fā)酵培養(yǎng)24～36h，發(fā)酵結(jié)束后，收集罐內(nèi)發(fā)酵液。

1.5 發(fā)酵干燥

在干燥制粉環(huán)節(jié)向發(fā)酵液中添加玉米淀粉流化劑（添加量為35g/L）并充分?jǐn)嚢杈鶆?，?jīng)噴霧干燥后制成丁酸梭菌活菌制劑成品。

2 丁酸梭菌在動物養(yǎng)殖中的應(yīng)用

2.1 促進(jìn)動物生長，調(diào)節(jié)腸道菌群微生態(tài)平衡

動物腸道屏障的主要功能是維持上皮細(xì)胞的完整性和防止微生物入侵。丁酸梭菌在腸道內(nèi)產(chǎn)生乙酸、丁酸等有機酸，分泌抗菌肽丁酸菌素、淀粉酶、蛋白酶和纖維素酶等多種生物酶，這些都是益生物，維持腸道健康，調(diào)節(jié)菌群微生態(tài)平衡，有利于抑制有害菌群的增殖，促進(jìn)有益菌的繁殖，其中有機酸構(gòu)成腸壁上皮細(xì)胞的能量物質(zhì)，丁酸對于腸道黏膜損傷的修復(fù)再生有很大促進(jìn)作用，分泌的酶水解纖維素、淀粉等碳灰化合物產(chǎn)生葡萄糖等低聚糖，降解抗?fàn)I養(yǎng)因子，益于腸道吸收和生產(chǎn)發(fā)育，提高動物生長性能。YangCM 等對日糧添加丁酸梭菌飼喂肉雞試驗表明，可以顯著提高肉仔雞整個生長期的平均日增重和終末體重。孫華等研究了日糧添加丁酸梭菌對25kg左右的大約克育肥豬前期生長性能的影響，結(jié)果表明，添加2.0×108CFU/kg 丁酸梭菌對其生長性能具有改善作用，可使生長豬平均日增重（ADG）提高7.5%、料肉比（FCR）降低2.2%。

2.2 調(diào)節(jié)機體免疫反應(yīng)，增強機體免疫力

動物機體健康狀況與細(xì)胞因子、各類免疫球蛋白密切相關(guān)。丁酸梭菌能夠提高血清免疫球蛋白和細(xì)胞因子含量，促進(jìn)免疫器官發(fā)育，激活補體系統(tǒng)，增強機體免疫能力，發(fā)揮抗菌和抗病毒的功能。此外，其抗炎作用表現(xiàn)為激活腸道上皮細(xì)胞的Toll 樣受體2（TLR-2），調(diào)節(jié)NF-kB 信號途徑分泌IL-6、TNF-α 等細(xì)胞因子，從而抑制炎癥反應(yīng)。劉亭婷等在仔雞日糧中添加丁酸梭菌，發(fā)現(xiàn)丁酸梭菌組雞的脾臟指數(shù)、血清中IgG 和C3 的含量均高于對照組，胸腺和法氏囊指數(shù)有上升趨勢。王騰浩的研究也表明，飼糧中添加丁酸梭菌具有提高斷奶仔豬血清IgG、IgM 和C4 含量的趨勢，可顯著提高血清IgA 和C3 含量。