綠色熒光蛋白標記殺鮭氣單胞菌的構建及其初步應用

杜以帥, 張麗娜, 馬曉娜, 肖 鵬, 孫 斌, 蔡碧瑩, 王順奎,于凱松, 劉 鷹

(1. 中國科學院 海洋研究所, 山東 青島 266071; 2. 山東東方海洋科技股份有限公司, 山東 煙臺 264003; 3. 青島科技大學, 山東 青島 266042; 4. 天津師范大學, 天津 300387)

綠色熒光蛋白標記殺鮭氣單胞菌的構建及其初步應用

杜以帥1, 張麗娜1, 馬曉娜1, 肖 鵬1, 孫 斌4, 蔡碧瑩3, 王順奎2,于凱松2, 劉 鷹1

(1. 中國科學院 海洋研究所, 山東 青島 266071; 2. 山東東方海洋科技股份有限公司, 山東 煙臺 264003; 3. 青島科技大學, 山東 青島 266042; 4. 天津師范大學, 天津 300387)

殺鮭氣單胞菌(Aeromonas salmonicida)是引起癤瘡病的典型致病細菌, 幾乎可以侵染所有的鮭科(Aeromonas)魚類, 為水產養(yǎng)殖業(yè)帶來巨大的經濟損失。本研究通過電擊轉化法將原核表達載體pGFPuv成功導入殺鮭氣單胞菌C4菌株(AS-C4)中, 獲得了綠色熒光蛋白標記的殺鮭氣單胞菌菌株AS-C4GFP。AS-C4GFP菌株在氨芐青霉素抗性平板上生長良好, 并在紫外光下激發(fā)出較強的綠色熒光。通過熒光顯微鏡觀察菌體和PCR檢測gfp和殺鮭氣單胞菌vapA基因, 表明gfp基因已經成功導入AS-C4中。用AS-C4GFP人工感染大西洋鮭(Salmo salar), 從死亡魚的脾臟、肝臟、腎臟中均能分離出AS-C4GFP, AS-C4GFP在脾臟中最多。AS-C4GFP具有特異性和可視性, 為研究殺鮭氣單胞菌對大西洋鮭的侵染途徑提供了一種良好的生物材料。

殺鮭氣單胞菌(Aeromonas salmonicida); 綠色熒光蛋白; 電轉化; 大西洋鮭(Salmo salar)

殺鮭氣單胞菌(Aeromonas salmonicida)屬于氣單胞菌屬(Aeromonas), 可以侵染多種淡水和海水魚類, 是造成水產養(yǎng)殖動物疾病爆發(fā)的一種典型細菌性病原[1]。殺鮭氣單胞菌是引起鮭科魚類發(fā)生癤瘡病的一種致病細菌, 幾乎所有的鮭科魚類, 都可被殺鮭氣單胞菌感染, 因此殺鮭氣單胞菌對經濟價值較高的鮭科魚類產生嚴重危害, 也為養(yǎng)殖業(yè)帶來巨大的經濟損失[2-3]。

綠色熒光蛋白(green fluorescent protein, GFP)來源于水母, 具有在紫外光照射下即可激發(fā)出綠色熒光的特性[4]。GFP熒光具有檢測靈敏性高、穩(wěn)定性和特異性強、細胞毒性小等優(yōu)點[5]。近年來將GFP標記細菌進行侵染動力學等方面的研究越發(fā)突顯其優(yōu)越性[6]。在水產養(yǎng)殖領域, 已經有將gfp基因轉化遲緩愛德華氏菌(Edwardsiella tarda)、鰻弧菌(Vibrio anguillarum)和嗜水氣單胞菌(Aeromonas hydrophila)等致病菌并研究其對宿主的侵染途徑等相關致病機理的研究[6-9], 但是目前國內外仍未見將gfp基因轉化殺鮭氣單胞菌并將其應用于鮭科魚類致病機理研究相關的報道。

本課題組從煙臺東方海洋養(yǎng)殖車間具有典型癤瘡病癥狀的發(fā)病大西洋鮭(Salmo salar)脾臟中分離出一株殺鮭氣單胞菌, 通過電擊轉化法成功將帶有gfp基因的pGFPuv載體轉入殺鮭氣單胞菌中, 并對菌體進行了熒光觀察和gfp基因檢測。進一步將gfp基因標記的殺鮭氣單胞菌通過人工浸染的方式感染大西洋鮭, 在紫外燈下檢測死亡大西洋鮭脾臟、肝臟和腎臟的平板劃線結果, 并對不同組織中的細菌數(shù)目進行計數(shù)。本研究為GFP標簽進行生物標記使菌落觀察更具可視性和特異性提供數(shù)據(jù)支持, 也為進一步研究殺鮭氣單胞菌對大西洋鮭的侵染途徑這一重要領域提供更加便捷、可行的方法。

1 材料與方法

1.1 材料

殺鮭氣單胞菌從山東東方海洋科技股份有限公司養(yǎng)殖的大西洋鮭患病個體脾臟中分離得到, 經過生理生化鑒定和16S rDNA測序分析, 命名為殺鮭氣單胞菌C4菌株(AS-C4), 在中國普通微生物菌種保藏管理中心保藏編號為CGMCC No.7335。原核表達載體pGFPuv為商業(yè)化質粒, 具有氨芐青霉素抗性[10]。實驗用大西洋鮭120尾為山東東方海洋科技股份有限公司煙臺分公司提供, 平均體質量為113 g±20 g, 實驗前在中國科學院海洋研究所養(yǎng)殖系統(tǒng)內暫養(yǎng)。養(yǎng)殖海水溫度12℃, 每天換水1次, 早上投喂1次配合飼料, 大西洋鮭暫養(yǎng)3周后用于試驗。

1.2 方法

1.2.1 用于電轉化的AS-C4感受態(tài)的制備

挑取AS-C4菌株接種于LB液體培養(yǎng)基震蕩至OD600值達到0.5~0.8時, 將菌液在冰上預冷30 min,隨后于4℃, 2 500 r/min離心10 min, 用滅菌ddH2O洗滌兩次(離心同上), 再使用10%甘油(滅菌, 預冷)重懸菌體兩次(離心同上), 將10%甘油重懸的菌液以100 μL/管分裝于1.5 mL的離心管中, –80℃冰箱中保存。

1.2.2 pGFPuv電轉化AS-C4菌株

電轉化的方法參照文獻[11]。電擊后取100 μL轉化產物涂布含有氨芐青霉素(200 μg/mL)的LB平板, 28℃過夜培養(yǎng), 次日查看轉化結果。在紫外光下激發(fā)出綠色熒光的AS-C4菌株即GFP標記的殺鮭氣單胞菌菌株, 命名為AS-C4GFP。

1.2.3 GFP標記的殺鮭氣單胞菌菌株(AS-C4GFP)的檢測

1.2.3.1 熒光檢測

用接種環(huán)挑取少許單菌落菌體, 在熒光顯微鏡紫外通道下觀察未轉化gfp基因的殺鮭氣單胞菌(AS-C4)和GFP標記的殺鮭氣單胞菌AS-C4GFP, 并拍攝圖片。

1.2.3.2 PCR檢測

根據(jù)pGFPuv序列(NCBI accession no.U62636),利用Primer5.0軟件設計用于檢測gfp基因的引物pGFPuvF364和pGFPuvR971, 使用引物SV1與SV2[12]檢測殺鮭氣單胞菌的毒力基因vapA(EMBL accession no. M64655), 引物序列請見表1。挑取AS-C4GFP單菌落于10 μL滅菌水, 取1 μL為模板進行菌落PCR。PCR程序為: 94℃預變性10 min, 然后進行30個循環(huán): 94℃變性30 s; 53℃退火30 s; 72℃延伸30 s, 最后72℃延伸5 min。PCR產物于1%瓊脂糖凝膠電泳通過凝膠成像儀查看條帶。

表1 引物序列Tab. 1 Primer sequences

1.2.3.3 質粒穩(wěn)定性的檢測

將AS-C4GFP無菌操作接種于LB液體培養(yǎng)基(氨芐青霉素200 μg/mL)培養(yǎng)過夜(28℃), 再將菌液接種于不含氨芐青霉素的LB液體培養(yǎng)基中培養(yǎng), 每次接種量為1/1 000(v/v), 每24 h轉接1次, 轉接同時稀釋菌液涂平板, 放置于28℃生化培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h,在紫外燈下計數(shù)發(fā)綠色熒光的單菌落。質粒穩(wěn)定率= (發(fā)綠色熒光菌落數(shù)/總菌落數(shù))×100%。

1.2.4 AS-C4GFP在人工感染大西洋鮭實驗中的初步應用

1.2.4.1 人工感染與組織取樣

將120尾暫養(yǎng)后的大西洋鮭分為試驗組和對照組, 每組各60尾。將AS-C4GFP于28℃含有氨芐青霉素的LB液體培養(yǎng)基中振蕩培養(yǎng)18~24 h, 離心后將菌體用滅菌的海水稀釋菌濃度為2.65×107cfu/mL海水。試驗組大西洋鮭于100 L 2.65×107cfu/mL海水中浸泡1h后于正常海水養(yǎng)殖; 對照組于100 L天然海水中浸泡1 h后于正常海水養(yǎng)殖。實驗開始后每隔4 h觀察一次并撈出死亡大西洋鮭(以觸碰其尾部身體5 s完全不動為死亡標準), 并記錄死亡出現(xiàn)時間和觀察疾病癥狀。對死亡的大西洋鮭取樣, 無菌操作采集大西洋鮭的鰓、脾臟、肝臟、腎臟、腸道、皮膚和肌肉組織樣品。

1.2.4.2 AS-C4GFP在死亡大西洋鮭脾臟、肝臟和腎臟中平板劃線檢測

無菌操作下, 用接種環(huán)對每條死亡的大西洋鮭脾臟、肝臟和腎臟進行平板劃線, 分區(qū)劃線于含有氨芐青霉素的LB營養(yǎng)瓊脂平板(氨芐青霉素200 μg/mL),置于28℃生化培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h。在紫外燈下觀察發(fā)綠色熒光的菌落。

1.2.4.3 AS-C4GFP在死亡大西洋鮭各組織中的數(shù)目

將采集的死亡大西洋鮭(N=4)的鰓、脾臟、肝臟、腎臟、腸道、魚皮和肌肉組織樣品稱質量后用滅菌的生理鹽水洗滌, 并按照1︰10(m/v)比例加入滅菌生理鹽水進行勻漿。將勻漿液用滅菌生理鹽水分別稀釋10倍、100倍, 取2個梯度的稀釋液各100 μL均勻涂布于含有氨芐青霉素的LB營養(yǎng)瓊脂平板(含有氨芐青霉素200 μg/mL), 置于28℃生化培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h。在紫外燈下觀察發(fā)綠色熒光菌落的數(shù)目, 并計數(shù)。

2 結果

2.1 電轉化后AS-C4GFP的篩選和純化

通過電擊轉化的方式將pGFPuv轉化進入殺鮭氣單胞菌, 成功轉化的殺鮭氣單胞菌菌株即(ASC4GFP)會在紫外光下激發(fā)出綠色熒光。挑取發(fā)綠色熒光的AS-C4GFP單菌落繼續(xù)在含有氨芐青霉素的LB營養(yǎng)瓊脂平板上分離純化, 最終純化后的AS-C4GFP單菌落在紫外激發(fā)下均發(fā)出綠色熒光(圖1)。

2.2 AS-C4GFP的熒光檢測

用接種環(huán)挑取少許AS-C4GFP單菌落菌體, 在熒光顯微鏡紫外通道下觀察, 所有的菌體在紫外激發(fā)下均發(fā)出綠色熒光(圖2A), 說明gfp基因已經成功轉入殺鮭氣單胞菌; 而未轉化gfp基因的在殺鮭氣單胞菌(AS-C4)在紫外激發(fā)下無綠色熒光(圖2B)。

圖1 電轉化后AS-C4GFP菌株的純化Fig. 1 Purification (B) of AS-C4GFPafter electroporation

圖2 GFP標記的AS-C4GFP發(fā)光菌體Fig. 2 Cells of GFP-tagged A. salmonicida strain AS-C4GFPA. AS-C4GFP; B. AS-C4

2.3 AS-C4GFP的PCR檢測

PCR檢測結果(圖3): 從AS-C4GFP既可以擴增出殺鮭氣單胞菌的毒力基因vapA的片段(542 bp), 也可以擴增出gfp基因的片段(430 bp), 并且與預期的片段大小一致, 說明gfp基因已經成功轉入殺鮭氣單胞菌。

圖3 PCR檢測GFP標記的AS-C4GFPFig. 3 PCR amplification of vapA and gfp gene fragmentsfrom GFP-tagged AS-C4GFP

2.4 質粒穩(wěn)定性檢測

AS-C4GFP在LB液體培養(yǎng)基中連續(xù)傳代6次, 質粒的表達仍為100%, 第7代略有下降, 但是質粒的表達率仍為95%, 說明AS-C4GFP質粒的穩(wěn)定性較好。

2.5 AS-C4GFP人工感染大西洋鮭實驗結果

2.5.1 死亡大西洋鮭脾臟、肝臟和腎臟中平板劃線檢測AS-C4GFP

整個人工感染實驗期間對照組均沒有出現(xiàn)死亡現(xiàn)象, 試驗組大西洋鮭在攻毒后第7天開始出現(xiàn)死亡現(xiàn)象, 并持續(xù)到12 d。死亡大西洋鮭均表現(xiàn)出典型的癤瘡病癥狀, , 對死亡的大西洋鮭在脾臟、肝臟和腎臟組織平板劃線均檢測出AS-C4GFP菌落, 在紫外燈下均發(fā)出較強的綠色熒光(圖4)。

表2 AS-C4GFP穩(wěn)定性檢測結果Tab. 2 Results of AS-C4GFPstability experiment

圖4 死亡大西洋鮭脾臟、肝臟和腎臟中AS-C4GFP的檢測結果Fig. 4 Detection of AS-C4GFPin the spleen, liver, and kidney of dead Atlantic salmon

2.5.2 AS-C4GFP在死亡大西洋鮭不同組織中的數(shù)目

死亡大西洋鮭(N=4)各個組織中均檢測到ASC4GFP, 其中脾臟中數(shù)目最多, 達到2.6×107CFU/g組織,其次是腎臟、肝臟、鰓、皮膚、腸道和肌肉(圖5)。

圖5 AS-C4GFP在死亡大西洋鮭不同組織中的數(shù)目Fig. 5 Numbers of AS-C4GFPin different tissue samples of dead Atlantic salmon

3 討論

原核表達載體pGFPuv可以使被轉化的細菌具有氨芐青霉素抗性, 并且能夠表達GFP蛋白, 這兩種標記可以使轉化成功的細菌很容易在氨芐青霉素抗性平板中篩選出來。在進行電轉化實驗后, 作者成功篩選到轉化了gfp基因的殺鮭氣單胞菌(AS-C4GFP),純化后的AS-C4GFP菌落在紫外燈下發(fā)出較強的綠色熒光(圖1)。通過熒光顯微鏡觀察, AS-C4GFP菌體也能激發(fā)出較強的熒光(圖2)。利用PCR進行殺鮭氣單胞菌毒力基因vapA和gfp基因片段的檢測, 擴增片段均符合預期(圖3)。以上結果均表明pGFPuv已經成功轉化到殺鮭氣單胞菌中。李靜等[13]嘗試將質粒pFPV25.1(羧卞青霉素抗性)轉化嗜水氣單胞菌(A. hydrophila), 但是由于其研究的嗜水氣單胞菌菌株具有羧卞青霉素抗性, 導致篩選手段繁瑣最終沒有篩選到GFP標記的嗜水氣單胞菌; 利用改造后的質粒pWSK129(卡那霉素抗性)轉化嗜水氣單胞菌, 最終成功篩選到GFP標記的嗜水氣單胞菌。夏飛等[14]將質粒pEGFPuv進行抗性改造后, 轉化至嗜水氣單胞菌使其具有GFP標記。GFP對殺鮭氣單胞菌和嗜水氣單胞菌等水產養(yǎng)殖中常見病原菌的成功標記,使這些病原菌致病機理的相關研究變得更加便捷。

本研究采用的轉化方法為電擊轉化法, 電擊轉化方法的轉化率較高, 是常見的一種轉化方法。與經典的化學轉化方法和原生質體轉化方法相比, 電擊轉化法具有操作簡便快速、高效、可重復等優(yōu)點, 轉化后的細胞可以很好地存活生長, 因此該技術可用于動物、植物和微生物等各類細胞中[15]。近幾年已經有將外源熒光標簽通過電擊轉化法轉化水產養(yǎng)殖動物病原菌的報道。李靜等[13]將含有gfp基因的pWSK129質粒電轉化至嗜水氣單胞菌無毒株Ah4332和強毒株AhJ-1, 無毒株Ah4332傳至70代, 質粒穩(wěn)定率仍可達100%; 而強毒株AhJ-1在同樣條件下培養(yǎng)10代后, 質粒穩(wěn)定率急劇下降。Wang等[9]將質粒pFPV25.1通過電轉化的方式轉化遲鈍愛德華菌(E. tarda), 轉化后的菌株和原來的菌株保持相似的毒性,并且連續(xù)傳代7d后質粒穩(wěn)定率仍可達100%。本研究通過電擊轉化法將pGFPuv成功轉化AS-C4GFP, 轉化后的質粒在第7d時仍然保持非常高的遺傳穩(wěn)定性。雖然細菌長期傳代后質粒的穩(wěn)定性有所降低, 但是細菌侵染路徑研究的周期一般都在一周以內, 因此質粒穩(wěn)定性的降低對細菌侵染路徑研究影響較小。

傳統(tǒng)的研究病原菌的侵染動力學方法, 主要是通過平板培養(yǎng)測定不同侵染器官中含有的病原菌數(shù)目, 這是一種間接的方法并且可能使計算出的細菌數(shù)目存在偏差; 放射性標記的細菌可以被定量, 但是這種方法不能區(qū)分活的和死亡的細菌[8]。本研究中通過電擊轉化法使殺鮭氣單胞菌具有GFP標記和氨芐青霉素抗性兩種標簽, 使殺鮭氣單胞菌很容易和其他細菌區(qū)分, 使結果更準確和更具有特異性。在死亡的大西洋鮭脾臟、肝臟和腎臟平板劃線檢測結果中, 平板上都可以分離出病原菌, 并且分離的病原菌在紫外燈下均發(fā)出較強的綠色熒光, 可視性極強。在本研究中, 侵染了殺鮭氣單胞菌的大西洋鮭不同組織中, 均檢測到AS-C4GFP, 并且死亡大西洋鮭表面具有癤瘡, 這與殺鮭氣單胞菌侵染鮭科魚類引起全身性感染并引發(fā)癤瘡病[16]的結論一致; 脾臟中AS-C4GFP數(shù)目最多, 這與脾臟是殺鮭氣單胞菌最主要的影響器官的結論也相符[17]。Ling等[6]將轉化了gfp基因的遲緩愛德華氏菌浸泡攻毒藍曼龍(T. trichopterus), 通過組織學和侵染動力學研究表明胃腸道、鰓和魚體表是毒性遲緩愛德華氏菌的侵染入口。Toole等[7]將gfp基因標記的鰻弧菌(V. anguillarum)浸泡感染斑馬魚(Danio rerio), 在共聚焦熒光顯微鏡下觀察發(fā)現(xiàn), 斑馬魚胃腸道和皮膚中均感染了發(fā)綠色熒光的鰻弧菌。Wang等[9]用GFP標記的遲緩愛德華菌感染斑馬魚, 發(fā)現(xiàn)斑馬魚感染遲緩愛德華菌后,該菌先后在腸道、鰓和皮膚中定植。因此GFP作為一種外源的熒光標簽, 提供了一種使細菌可視化并且可以追蹤他們在宿主細胞內活性的途徑[18]。對于水產養(yǎng)殖業(yè)的一些病原菌, 有研究將浸泡攻毒和GFP標記方法相組合, 認為這是一種比較好的研究病原與宿主相互作用的工具[6]。這種組合可以識別病原菌的侵染路徑, 識別參與侵染過程的基因, 是一種評價疫苗和明確侵染部位、靶向器官和存留器官的良好實驗設計。雖然使用GFP標記病原菌已經成功應用于病原菌對斑馬魚、藍曼龍、黑鯛(Sparus macrocephalus)和歐鱸(Dicentrarchus labrax)等魚類侵染路徑的研究中, 但是也存在GFP熒光與動物組織自發(fā)熒光難以區(qū)分的情況。Rekecki等[19]用GFP標記鰻弧菌研究其在歐鱸幼苗腸道中的定位, 雖然歐鱸幼苗組織自發(fā)熒光與GFP熒光相似, 但是通過調節(jié)熒光顯微鏡和共聚焦熒光顯微鏡的參數(shù)還是成功將GFP熒光和組織自發(fā)熒光相區(qū)分。隨著科技的進步和熒光顯微鏡的改進, GFP熒光與動物組織自發(fā)熒光的區(qū)分將變得越來越容易。

4 結論

本研究利用電擊轉化法成功將pGFPuv導入殺鮭氣單胞菌C4菌株中, 轉化后的AS-C4GFP菌株在抗性平板上生長良好, 并在紫外燈下激發(fā)出較強的綠色熒光。利用熒光顯微鏡觀察菌體和PCR驗證, 均表明gfp基因已經成功標記殺鮭氣單胞菌。在AS-C4GFP人工感染大西洋鮭的實驗中, 死亡大西洋鮭脾臟、肝臟、腎臟中均能劃線培養(yǎng)出AS-C4GFP, 并且利用平板計數(shù)方法可以更方便快捷的檢測出AS-C4GFP在大西洋鮭不同組織中的分布, 結果也更具有特異性。以上結果證明AS-C4GFP具有特異性和可視性, 為研究殺鮭氣單胞菌對大西洋鮭的侵染途徑提供了一種良好的生物材料。

[1] Wiklund T, Dalsgaard I. Occurrence and significance of atypical Aeromonas salmonicida in non-salmonid and salmonid fish species: a review[J]. Diseases of Aquatic Organisms, 1998, 32(1): 49-69.

[2] Blazer V. Bacterial fish pathogens[J]. Environmental Biology of Fishes, 1988, 21(1): 77-79.

[3] M?yner K, R?ed K H, Sevatdal S, et al. Changes in non-specific immune parameters in Atlantic salmon, Salmo salar L., induced by Aeromonas salmonicida infection[J]. Fish & Shellfish Immunology, 1993, 3(4): 253-265.

[4] Chalfie M, Tu Y, Euskirchen G, et al. Green fluorescent protein as a marker for gene expression[J]. Science, 1994, 263(5148): 802-805.

[5] 吳沛橋, 巴曉革, 胡海, 等. 綠色熒光蛋白GFP的研究進展及應用[J]. 生物醫(yī)學工程研究, 2009, 28(1): 83-86. Wu Peiqiao, Ba Xiaoge, Huhai, et al. Research progress and application of green fluorescent protein[J]. Journal of Biomedical Engineering Research, 2009, 28(1): 83-86.

[6] Ling S H M, Wang X H, Lim T M, et al. Green fluorescent protein-tagged Edwardsiella tarda reveals portal of entry in fish[J]. FEMS Microbiology Letters, 2001, 194(2): 239-243.

[7] O'Toole R, von Hofsten J, Rosqvist R, et al. Visualisation of zebrafish infection by GFP-labelled Vibrio anguillarum[J]. Microbial Pathogenesis, 2004, 37(1): 41-46.

[8] Chu W H, Lu C P. In vivo fish models for visualizing Aeromonas hydrophila invasion pathway using GFP asa biomarker[J]. Aquaculture, 2008, 277(3-4): 152-155. [9] Wang X P, Yan M C, Hu W L, et al. Visualization of Sparus macrocephalus infection by GFP-labeled Edwardsiella tardal[J]. Israeli Journal of Aquaculture-Bamidgeh, 2012, 64 7.

[10] Crameri A. Improved green fluorescent protein by molecular evolution using DNA shuffling[J]. Nature Biotechnology, 1996, 14(3): 315-319.

[11] Tombolini R, Unge A, Davey M E, et al. Flow cytometric and microscopic analysis of GFP-tagged Pseudomonas fluorescens bacteria[J]. Fems Microbiology Ecology, 1997, 22(1): 17-28.

[12] Rattanachaikunsopon P, Phumkhachorn P. Detection of Aeromonas salmonicida by reverse transcription-multiplex polymerase chain reaction[J]. Bioscience Biotechnology and Biochemistry, 2012, 76(4): 665-670.

[13] 李靜, 張曉露, 劉永杰, 等. 綠色熒光蛋白基因標記嗜水氣單胞菌的研究[J]. 畜牧與獸醫(yī), 2009, 41(3): 1-4. Li Jing, Zhang Xiaolu, Liu Yongjie, et al. Genetically marking of Aeromonas hydrophila strains with green fluorescent protein gene[J]. Animal Husbandry and Veterinary Medicine, 2009, 41(3): 1-4.

[14] 夏飛. 團頭魴源嗜水氣單胞菌分離鑒定、檢測及綠色熒光蛋白標記菌株的構建[D]. 南京: 南京農業(yè)大學, 2012: 1-78. Xia Fei. Identification, detection and construction of green fluorescent protein marker strains of pathogenic Aeromonas hydrophila isolated from Megalobrama amblycephala[D]. Nanjing: Nanjing Agricultural University, 2012: 1-78.

[15] 唐巖, 唐軍民, 戰(zhàn)軍, 等. 樹突狀細胞電轉染的優(yōu)化條件及影響因素[J]. 解剖學報, 2007, 38(2): 209-212. Tang Yan, Tang Junmin, Zhan Jun, et al. The influential factors and optimum conditions of electric transfection on dendritic cells[J]. Acta Anatomica Sinica, 2007, 38(2): 209-212.

[16] Mulder I E, Wadsworth S, Secombes C J. Cytokine expression in the intestine of rainbow trout (Oncorhynchus mykiss) during infection with Aeromonas salmonicida[J]. Fish & Shellfish Immunology, 2007, 23(4): 747-759.

[17] Ferguson H W, McCarthy D H. Histo-pathology of furunculosis in Brown trout Salmo trutta L. [J]. Journal of Fish Diseases, 1978, 1(2): 165-174.

[18] Monack D, Ramakrishnan L, Falkow S, et al. Applications for green fluorescent protein (GFP) in the study of hostpathogen interactions[J]. Gene, 1996, 173(1): 47-52.

[19] Rekecki, A, Gunasekara R A Y S A, Dierckens K, et al. Bacterial host interaction of GFP-labelled Vibrio anguillarum HI-610 with gnotobiotic sea bass, Dicentrarchus labrax (L.), larvae[J]. Journal of Fish Diseases, 2012, 35(4): 265-273.

Received:Dec. 24, 2015

Construction and application of green fluorescent protein for Aeromonas salmonicida strain

DU Yi-shuai1, ZHANG Li-na1, MA Xiao-na1, XIAO Peng1, SUN Bin4, CAI Bi-ying3, WANG Shun-kui2, YU Kai-song2, LIU Ying1
(1. Institute of Oceanology, Chinese Academy of Sciences, Qingdao 266071, China; 2. Shandong Oriental Ocean Sci-Tech Co., Ltd., Yantai 264003, China; 3. Qingdao University of Science and Technology, Qingdao 266042, China; 4. Tianjin Normal University, Tianjin 300387, China)

Aeromonas salmonicida; green fluorescent protein; electroporation; Salmo salar

Aeromonas salmonicida is a typical causative agent of furunculosis in salmonids and causes considerable economic loss in salmonid farms. In this study, we used electroporation to transform a pGFPuv plasmid into the A. salmonicida C4 strain and successfully obtained a green fluorescent protein (GFP)-tagged strain AS-C4GFP. The AS-C4GFPstrain grew well on plates with ampicillin and could be easily identified as bright green fluorescing colonies under UV light. The results from viewing AS-C4GFPunder a fluorescent microscope as well as our polymerase chain reaction (PCR) detection of gfp and vapA verified that we had successfully transformed pGFPuv into A. salmonicda. In an artificial infection experiment, we used the streak plate method to isolate AS-C4GFPfrom the spleen, liver, and kidney of dead Atlantic salmon (Salmo salar) and the results showed the spleen to have the most AS-C4GFP. GFP-tagged AS-C4GFPmade A. salmonicida more easily and specifically detectable, thus providing good biological material for the study of the infection route of A. salmonicida in Atlantic salmon.

S941.42

A

1000-3096(2016)12-0030-06

10.11759/hykx20151224002

(本文編輯: 譚雪靜)

2015-12-24;

2016-05-10

第56批中國博士后科學基金(2014M560580); 山東省博士后創(chuàng)新基金(201402005); 國家自然科學基金(31472312, 41306152, 31402283); 青島市創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)人才計劃項目(13-CX-16)

[Foundation: the 56th China Postdoctoral Science Foundation, No.2014M560580; Postdoctoral Innovation Project Special Funds of Shandong Province, No. 201402005; National Natural Science Foundation of China, No. 31472312, No. 41306152, No. 31402283; Qingdao Innovation Talents Program No.13-CX-16]

杜以帥(1985-), 男, 山東棗莊人, 助理研究員, 主要從事魚類病害預防與預警研究, E-mail: duyishuai@qdio.ac.cn; 劉鷹, 通信作者, 電話: 0532-82898919, E-mail: yinliu@qdio.ac.cn