羊棲菜多糖的提取和抗氧化活性研究

何 丹, 張 旭, 肖保衡, 吳曉輝, 吳明江

(溫州大學 生命與環(huán)境科學學院, 浙江 溫州 325035)

羊棲菜多糖的提取和抗氧化活性研究

何 丹, 張 旭, 肖保衡, 吳曉輝, 吳明江

(溫州大學 生命與環(huán)境科學學院, 浙江 溫州 325035)

羊棲菜(Sargassum fusiforme)是一種有“長壽菜”美譽的經(jīng)濟藻類, 其中的多糖成分具有良好的抗氧化活性。本文依次用冷水和熱水處理羊棲菜藻粉, 得到兩種多糖: 冷水浸提多糖(SFCP)和熱水煮提多糖(SFHP); 隨后對這兩種多糖的理化性質(zhì)進行比較, 并通過測定二者對DPPH和羥自由基的清除能力評價其抗氧化活性。結果表明, 兩種多糖都是含有硫酸根的巖藻聚糖, 但是SFCP中糖醛酸含量較高,分子質(zhì)量分布集中, 而SFHP中硫酸根含量較多, 分子質(zhì)量分布較寬, 且二者硫酸根取代位置不同。兩種多糖對DPPH和羥自由基均有一定的清除效果, 且清除率與濃度存在劑量依賴關系。相比較而言, SFCP對自由基的清除效率較好。

羊棲菜; 多糖; 抗氧化

羊棲菜(Sargassum fusiforme)是褐藻門馬尾藻屬的藻類植物之一, 在遼東半島、雷州半島均有分布,以浙江沿海最多, 在日本, 稱其為“長壽菜”[1]?！渡褶r(nóng)本草經(jīng)》中記載了羊棲菜的食用價值和藥用價值; 現(xiàn)今已有大量報道, 這種含有硫酸化多糖的羊棲菜, 有抗凝血、降血脂、抗氧化、調(diào)節(jié)免疫等生物學功能[2]。

外界和內(nèi)在的因素會引起體內(nèi)氧化物質(zhì)積累,引發(fā)氧化損傷, 例如缺血再灌注后, 造成大鼠體內(nèi)急性氧化損傷, 不同的自由基含量增加, 抗氧化系統(tǒng)酶活力下降[3]; 在高脂血癥大鼠中, 體內(nèi)氧化產(chǎn)物如丙二醛的含量增加[4]。硫酸化多糖能夠提升機體抗氧化系統(tǒng)的保護作用, 減緩多種疾病的發(fā)生。研究表明硫酸化的羊棲菜多糖可以通過升高體內(nèi)超氧化物歧化酶(SOD)、谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-Px)等抗氧化酶的酶活力, 降低脂質(zhì)氧化產(chǎn)物、活性氧水平[5]。Ye等[6]研究褐藻麒麟藻中提取的硫酸化多糖, 可以清除腫瘤細胞中產(chǎn)生的H2O2, 抑制腫瘤細胞的侵襲。紅藻鹿角菜中的硫酸化多糖可以清除DPPH自由基、羥自由基, 起到抗氧化作用[7]。硫酸化多糖是一種很好的抗氧化劑, 在不同的方面發(fā)揮抗氧化作用。

文獻報道的羊棲菜硫酸化多糖多采用熱水煮提的方法制備, 該法提取的多糖產(chǎn)率較高, 并且具有多種生物活性, 但是產(chǎn)物水溶性有限, 顏色較深, 同時高溫對多糖等活性物質(zhì)有一定的分解風險, 并且重復性稍差。而冷水浸提對多糖的原始結構影響較小, 有利于解讀多糖的結構、活性和其修飾物的研究;其次, 對擴大其活性多糖的生產(chǎn)工藝有利。并且采用冷水浸提法制備羊棲菜多糖尚未見報道。因此, 本研究依次采用冷水浸提和熱水煮提法制備羊棲菜多糖,并對其理化性質(zhì)和抗氧化活性進行研究, 以期為羊棲菜活性多糖的提取工藝、結構和生物功能的挖掘奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 主要材料和試劑

羊棲菜由浙江省洞頭縣羊棲菜養(yǎng)殖地提供。

1, 1-二苯基-2-三硝基苯肼(DPPH), D-葡萄糖醛酸(GlcA), Sigma; 右旋糖酐標樣, D-甘露糖(Man), D-木糖(Xyl), 中國藥品生物制品鑒定所; L-鼠李糖(Rha), D-半乳糖醛酸(GalA), 國藥集團化學試劑有限公司; D-葡萄糖(Glc), TCI; D-半乳糖(Gal), L-阿拉伯糖(Ara), Dr.Ehrenstorfer GmbH; L-巖藻糖(Fuc), FlukaBioChemika等。

1.2 主要儀器和設備

1525高效液相色譜儀, Waters科技有限公司; T6紫外-可見分光光度計, 北京普析通用儀器有限公司; TENSOR27紅外光譜儀, Bruker光譜儀器公司; Milli-Q超純水儀, MILLIPORE公司; ICS-1000離子色譜儀, 戴安公司等。

2 實驗方法

2.1 多糖提取

冷水提取羊棲菜多糖: 首先, 羊棲菜粉碎成末, 95%乙醇, 80, ℃回流脫脂3次(2 h/次), 得到脫脂藻粉; 其次, 按照蒸餾水: 脫脂藻粉=30︰1(V/m)的料液比, 室溫攪拌, 過濾得到提取液, 經(jīng)過適當濃縮后,加入2%氯化鈉和95%乙醇攪拌1 h后, –20℃放置48h; 最后, 離心(3000 r/min, 離心10 min)收集沉淀并復溶于蒸餾水中, 透析(截留分子質(zhì)量14000 Da),透析液經(jīng)濃縮, 減壓凍干, 獲得冷水提取羊棲菜多糖(SFCP)。

熱水提取羊棲菜多糖[8]: 首先, 將上述浸泡過的料渣, 按照相同的料液比, 80℃煮提3次, 煮提時間分別為4、3、2 h, 過濾后將提取液合并濃縮; 其次, 80%乙醇沉淀過夜, 離心, 收集沉淀, 依次用95%的乙醇, 無水乙醇, 丙酮洗滌沉淀, 再經(jīng)45℃減壓干燥; 最后, 配置成5%水溶液, 加入氯化鈣溶液, 離心后得上清, 進行透析, 后續(xù)步驟同上, 獲得熱水提取羊棲菜多糖(SFHP)。

2.2 理化性質(zhì)的測定

以葡萄糖為標準單糖, 用苯酚硫酸法測定樣品的總糖含量[9]。以半乳糖醛酸為標準糖醛酸, 用間羥基聯(lián)苯法測定樣品的糖醛酸含量[10]。牛血清白蛋白為標準品, 用考馬斯亮藍法測定樣品中蛋白含量[11]。

將九種單糖(Glc、Gal、Ara、Rha、Xyl、Man、Fuc、GalA、GlcA)經(jīng)過PMP(1-苯基-3-甲基-5-吡唑啉酮)衍生化處理后作為標準對照品, 選用Waters HPLC系統(tǒng)(1525泵, 2487雙波長紫外可見檢測器, 717自動進樣器), ThermoHypersil ODS-2色譜柱(4.6 mm× 250mm)進行分析, 將多糖完全酸水解為單糖后, 經(jīng)過同樣衍生化處理, HPLC分析其單糖組成[12]。以硫酸鈉做標準曲線, 選用ISC-100離子色譜儀測定硫酸根含量[13]。以中國生物制品所右旋糖苷為分子質(zhì)量標準品, 采用高效凝膠滲透色譜法(HPGPC)對多糖進行分子量測定[14]。選用DEAE-Sepharose CL-6B離子交換層析測定多糖樣品的極性分布。選用干燥樣品加入KBr壓片, FT-IR檢測4000 cm–1~400 cm–1范圍紅外吸收特征[15]。

2.3 抗氧化能力的測定

清除DPPH自由基[16], 每支試管中加入0.1 mmol/L DPPH溶液1 mL, 無水乙醇1 mL, 待測樣品溶液1 mL (樣品溶液分別為: SFCP濃度為0.18、0.36、0.72、1.08、1.44 g/L; SFHP濃度為0.15、0.3、0.6、0.9、1.2、1.5 g/L), 混勻后避光靜置30 min, 在517 nm處測定反應液吸光值。根據(jù)公式計算樣品的自由基清除率。

清除羥自由基[17], 每支試管中加入9 mmol/L硫酸亞鐵溶液1 mL, 9 mmol/L水楊酸溶液1 mL, 待測樣品溶液1 mL(SFCP或SFHP濃度為1、2、4、6、8、10 g/L)。最后加入8.8 mmol/L過氧化氫溶液1 mL, 37℃水浴1 h, 去離子水調(diào)零, 在510 nm處測定反應液吸光值。

二種測定方法分別平行測定3次。以維生素C(Vc)作為陽性對照組。

二者的自由基清除率的計算公式為:

式中, A0: 不加待測樣品溶液的吸光度值; Ax: 加入不同濃度待測樣品的吸光度值; Ax0: 樣品的本底吸收值。

表1 冷熱提取羊棲菜多糖特征性質(zhì)Tab. 1 Characteristics of SFCP and SFHP

3 結果分析

3.1 多糖的提取和理化性質(zhì)分析

羊棲菜經(jīng)過冷浸、乙醇沉淀和氯化鈣除褐藻膠后, 得冷提羊棲菜多糖(SFCP), 產(chǎn)率是6.6%; 冷提后的藻渣再經(jīng)過熱水煮提、乙醇沉淀和氯化鈣除褐藻膠, 獲得熱提羊棲菜多糖(SFHP), 產(chǎn)率是1.8%。含量分析如表1所示, 兩種多糖組分中只含有微量蛋白(<1%)。SFCP的糖和糖醛酸含量較高(分別是82.1%和15.5%), 而硫酸根的含量較少(4%), SFHP的糖和糖醛酸含量稍低(分別是76.1%和11.2%), 而硫酸根含量較多(11.9%)。

高效凝膠滲透色譜如圖1所示。SFCP的分子質(zhì)量分布較集中, 分子質(zhì)量為1.5×105Da; 而SFHP的分子質(zhì)量分布比較分散, 顯示出兩個主要的未完全分離的洗脫峰, 分別為3.7×105Da和8.8×104Da。在煮提過程中, 溫度可能破壞多糖的結構, 預示應用凝膠色譜法對SFHP進一步純化比較困難。

圖1 冷熱提取羊棲菜多糖分子質(zhì)量Fig. 1 Molecular weights of SFCP and SFHP

單糖組成分析如表2所示。這兩種多糖組分都是以巖藻糖為主, 并含有一定量的半乳糖, 同時含有少量的甘露糖、鼠李糖、葡萄糖、木糖、葡萄糖醛酸和半乳糖醛酸。SFCP中巖藻糖含量較SFHP少,而其他單糖的含量稍高一些。

表2 冷熱提取羊棲菜多糖單糖組成Tab. 2 Monosaccharide compositions of SFCP and SFHP

DEAE-Sepharose CL-6B分析羊棲菜多糖與陰離子交換劑的吸附能力, 可以反映出多糖的分子質(zhì)量與極性的均一性。結果如圖2所示。冷提多糖的分布比較集中, 除少部分在0.15 mol/L NaCl和1.0 mol/L NaCl洗脫下來, 大部分在0.62 mol/L NaCl濃度洗脫下來, 預示其均一性較好, 后續(xù)純化較容易; 而熱提多糖的分布較分散, 除在0.3 mol/L NaCl有一較好對稱的洗脫峰, 其他級分在0.6~1.3 mol/L NaCl逐漸洗脫下來, 預示其組分更復雜, 后續(xù)的純化比較困難。

圖2 SFCP(A)與SFHP(B)的DEAE-Sepharose CL-6B洗脫曲線Fig. 2 Elution curve of SFCP(A) and SFHP(B) DEAE-Sepharose CL-6B column

3.2 紅外圖譜分析

冷熱水提取的羊棲菜多糖紅外圖譜如圖3所示。兩種多糖在3400 cm–1~3500 cm–1處有很寬的O-H伸縮振動吸收峰; 在2800 cm–1~2912 cm–1處有吡喃環(huán)的C-H彎曲伸縮振動峰, 及巖藻糖和半乳糖基C-6;在1600 cm–1~1650 cm–1處有羰基非對稱伸縮振動, 1430 cm–1~1450 cm–1處為半乳糖、木糖CH2的剪切震動, 巖藻糖和O-乙?；鵆H3的非對稱彎曲振動; 1384 cm–1為巖藻糖和O-乙?；鵆H3的對稱彎曲振動; 1230 cm–1~1250 cm–1處兩種多糖都對應部分表現(xiàn)出硫酸酯中O=S=O的非對稱伸縮振動, SFHP在該處峰較冷提多糖更為明顯, 與其硫酸根含量較多相一致; 1089 cm–1~1047 cm–1為吡喃環(huán)CC、CO及糖苷鍵COC伸縮振動。SFCP在877 cm–1處有β糖苷鍵特征峰, 在821 cm–1處顯示其所含硫酸根鏈接在糖環(huán)赤道軸C-2和C-3的位置; SFHP除在82 5cm–1處有硫酸根連接峰, 還在840 cm–1處顯示有硫酸根連接于垂直軸C-4的位置, 在580 cm–1處有明顯的O-S-O非對稱變形吸收, 即SFCP與SFHP在硫酸根含量和取代基位置上有明顯差別。

圖3 冷熱提取羊棲菜多糖紅外光譜掃描圖Fig. 3 Infrared absorption spectroscopy results of SFCP and SFHP

3.3 羊棲菜多糖對DPPH自由基的清除作用

兩種羊棲菜多糖對DPPH自由基的清除率在0.1~1.5 g/L內(nèi)與濃度呈正相關(圖4), 當兩種糖濃度為1.4 g/L時, 對DPPH自由基的清除率接近Vc對DPPH自由基的清除率。說明羊棲菜多糖對DPPH自由基有良好的清除作用。但兩種不同處理方法得到的羊棲菜多糖相比較, SFCP對DPPH自由基的清除能力相對SFHP清除能力更好。

圖4 羊棲菜多糖對DPPH自由基的清除能力Fig. 4 Scavenging ability of S. fusiforme polysaccharide on DPPH radical

3.4 羊棲菜多糖對羥自由基的清除作用

冷熱水提取羊棲菜多糖對羥自由基的清除作用如圖5所示, 兩種多糖對羥自由基的清除率在1~10 g/L內(nèi)與濃度呈正相關, 當兩種糖濃度為6 g/L時, 對羥自由基的清除率接近Vc對羥自由基的清除率, 說明羊棲菜多糖對羥自由基有良好的清除作用。兩種不同處理方法得到的羊棲菜多糖相比較, 二者對羥自由基的清除能力差別很小。

圖5 羊棲菜多糖對羥自由基的清除能力Fig. 5 Scavenging ability of S.fusiforme polysaccharide on hydroxyl radical

4 結論與討論

在本研究中, 冷水浸提和熱水煮提條件下, 分別獲得水溶性較好的多糖SFCP和SFHP。組成分析和紅外光譜分析證明二者都是硫酸化的羊棲菜多糖, SFHP中巖藻糖含量高, 硫酸根含量也相對較高, 但是兩種多糖在單糖和取代基種類上沒有變化, 只是含量有所不同。SFCP和SFHP相比, 糖含量和糖醛酸含量都較高, 分子質(zhì)量和極性分布更均一, 水溶性更強, 對DPPH的清除作用更強。而SFHP的硫酸根含量較高, 在較高濃度時對羥自由基的清除能力稍強。由此推測多糖的分子質(zhì)量和糖醛酸對DPPH的清除影響較大, 而硫酸根含量對羥自由基的作用更明顯?？紤]到冷提方法多糖產(chǎn)率較高, 產(chǎn)品純度較好, 生產(chǎn)過程耗能少, 易于生產(chǎn)和進一步的深入研究, 室溫冷提法是更理想的羊棲菜多糖制備方法。

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Received:Feb. 29, 2016

Extraction and antioxidative activity of fucoidan from Sargassum fusiforme

HE Dan, ZHANG Xu, XIAO Bao-heng, WU Xiao-hui, WU Ming-jiang
(College of life and Environmental Science, Wenzhou University, Wenzhou 325035, China)

Sargassum fusiforme; polysaccharide; antioxidant

Sargassum fusiforme is an alga with economic significance and a good reputation for food longevity. Its polysaccharide also demonstrates good biological activities. In this study, we extracted two polysaccharide fractions—S. fusiforme cold-water-extracted polysaccharide (SFCP) and S.fusiforme hot-water-extracted polysaccharide (SFHP)—from S. fusiforme with water at 4℃ and 80℃, successively. We determined the physical and chemical properties of the polysaccharide fractions and evaluated their anti-oxidative activities by the radical scavenging ratios of 2, 2-diphenyl-1-picrylhydrazyl (DPPH) free and hydroxyl radicals. The results show that the two polysaccharide fractions were both fucosan with sulfate. SFHP showed a wider molecular weight distribution than SFCP and contained more sulfate, whereas SFCP contained more uronic acid. Their sulfate radical substitution positions also differed. SFHP and SFCP demonstrated certain dose-dependent activities for scavenging DPPH and ·OH. SFCP demonstrated better efficiency in removing free radicals.

TS254

A

1000-3096(2016)12-0024-06

10.11759/hykx20160229002

(本文編輯: 康亦兼)

2016-02-19;

2016-06-01

國家自然科學基金資助項目(31470430, 31200266); 溫州市科技計劃項目(N20150034)

[Foundation: National Natural Science Foundation of China, No.31470430, 31200266; Wenzhou Science and Technology Project, No.N20150034]

何丹(1990-), 女, 黑龍江齊齊哈爾人, 碩士研究生, 研究方向: 糖生物學, 電話: 18857734957, E-mail: hepan1990@163.com;吳明江, 男, 教授, 碩士生導師, 研究方向: 糖生物學, 電話: 0577-86689078, E-mail: wmj@wzu.edu.cn