粘蟲CYP6AE88和CYP332A1基因的鑒定和生物信息學分析

李敏，李生才，王青，張虎芳*

(1.太原師范學院 生物系，山西 太原 030031; 2.山西農(nóng)業(yè)大學 農(nóng)學院，山西 太谷 030801)

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粘蟲CYP6AE88和CYP332A1基因的鑒定和生物信息學分析

李敏1, 2，李生才2，王青1，張虎芳2*

(1.太原師范學院 生物系，山西 太原 030031; 2.山西農(nóng)業(yè)大學 農(nóng)學院，山西 太谷 030801)

摘要：鑒定粘蟲Mythimna separata CYP450家族基因，分析其序列特征并推測可能的功能，為研究粘蟲殺蟲劑抗性分子機制提供理論依據(jù)。以棉鈴蟲Helicoverpa armigera CYP6AE20v2和CYP332A1作為詢問序列，通過雙向Blast方法分別檢索粘蟲轉錄組中CYP6AE和CYP332A cDNA序列，通過生物信息學的方法預測基因所編碼的蛋白質序列的理化性質、疏水性、跨膜區(qū)、結構域、3D結構等以及可能的功能，并采用最大似然法(Maximum Likelihood，ML)分析夜蛾科代表物種的CYP6AE和CYP332A亞家族序列的系統(tǒng)發(fā)育關系。從粘蟲轉錄組測序數(shù)據(jù)中鑒定出CYP6AE和CYP332A兩個亞家族的基因，分別命名為CYP6AE88(GenBank登錄號：KU145393)和CYP332A1(GenBank登錄號：KU145394)。cDNA序列分析顯示，CYP6AE88和CYP332A1的全長分別為1 713 bp和1 815 bp，分別編碼509和503個氨基酸。蛋白質序列基本性質分析顯示：CYP6AE88蛋白理論相對分子質量為58.9 kD，等電點是7.95；CYP332A1蛋白理論相對分子質量為58.4 kD，等電點是8.03。CYP6AE88和CYP332A1分別在5-22位和5-23位氨基酸之間有一個典型的疏水性區(qū)域；分別在2～21位和2～24位氨基酸之間形成一個典型的跨膜區(qū)。兩個蛋白均不存在信號肽，亞細胞定位均為細胞質。蛋白質結構域分析分析顯示：兩個蛋白均含P450特有的5個特征序列，并且含有多個酶結合位點。3D結構分析顯示，CYP6AE88含有α 螺旋的數(shù)目是18條和β 折疊數(shù)目是9股，CYP332A1含有α螺旋的數(shù)目是19條和β折疊10股。CYP6AE的系統(tǒng)發(fā)育分析顯示：粘蟲CYP6AE88與(草地貪夜蛾CYP6AE43 + ?；页嵋苟闏YP6AE49)聚為一支(BP=72%)，然后再與棉鈴蟲CYP6AE20v2/50/19形成單系(BP=100%)；CYP332A的聚類分析顯示：粘蟲CYP332A1與棉鈴蟲CYP332A1聚為一支，bootstrap值為100%。研究結果為進一步研究粘蟲CYP6AE88和CYP332A1基因殺蟲劑抗性分子機制奠定了基礎。

關鍵詞：粘蟲；CYP450；CYP6AE88；CYP332A1；生物信息學分析

粘蟲Mythimnaseparata(Walker)屬于鱗翅目，夜蛾科，是一種遠距離遷飛害蟲，也是糧食作物的重大害蟲。其發(fā)生危害具有發(fā)生范圍廣，危害世代多；危害的作物種類和組織多；暴發(fā)性明顯；發(fā)生危害歷史長等特點[1]。在中國，1950-2013年的64年中有20年全國粘蟲發(fā)生面積在666.7萬hm2(1億畝)以上，2012年總損失達657.8萬t[2]。在亞洲和澳洲其它國家以及太平洋一些島嶼上也常發(fā)生粘蟲危害[3,4]。噴灑化學殺蟲劑是現(xiàn)階段防治粘蟲的主要方法，然而隨著殺蟲劑的應用不斷增加，粘蟲對殺蟲劑產(chǎn)生了一定程度的抗藥性[5,6]。

細胞色素P450(CYP)、羧酸酯酶(CXE)和谷胱甘肽S-轉移酶(GST)是昆蟲體內(nèi)三種重要的代謝解毒酶。其中細胞色素P450 是細胞色素P450酶系的末端氧化酶，在殺蟲劑的氧化、還原反應中起到重要作用。系統(tǒng)發(fā)育分析表明昆蟲的P450蛋白可分為4個大的分支：CYP2族，CYP3族，CYP4族和Mitochondrial CYP族[7]，其中CYP3族包括CYP6、CYP9、CYP28、CYP300、CYP400、CYP408及CYP413等家族成員，與代謝外源性物質及植物天然化合物有關[8,9]。如溴氰菊酯抗性的棉鈴蟲中CYP4L5,CYP4L11,CYP6AE11,CYP332A1 和CYP9A14基因產(chǎn)生了過量表達[10]；CYP6G1與黑腹果蠅(DrosophilamelanogasterMeigen)對DDT抗性有關[11]；CYP6M2能夠引起岡比亞按蚊(Anophelesgambiae)對惡蟲威、擬除蟲菊酯和DDT三種殺蟲劑的抗性[12]；CYP6BQ23的過量表達是歐洲油菜露尾甲(Meligethesaeneus)對擬除蟲菊酯殺蟲劑產(chǎn)生抗性主要機制[13]。因此，鑒定粘蟲抗藥性相關基因，研究其功能，對于闡釋粘蟲抗藥性分子機理乃至粘蟲病蟲害的有效控制具有指導意義。

本研究基于粘蟲轉錄組測序數(shù)據(jù)，采用雙向Blast方法搜索得到粘蟲的CYP6AE88和CYP332A1 cDNA序列，并通過生物信息學方法分析其序列特征，對編碼的蛋白質的結構和功能進行預測，并運用最大似然法(maximum likelihood，ML)構建鱗翅目夜蛾科代表性物種的系統(tǒng)發(fā)育關系，為深入研究粘蟲CYP6AE88和CYP332A1基因的功能以及參與殺蟲劑抗性的分子機制奠定了基礎。

1材料與方法

1.1數(shù)據(jù)來源

粘蟲(M.separate，Ms)飼養(yǎng)于人工氣候箱中，飼養(yǎng)條件為：RH≥75%，溫度保持在≤25 ℃，L∶D 為14∶10，未接觸任何藥物。提取卵，1～6齡幼蟲，蛹，成蟲的總RNA后，等量混合建庫。對原始測序數(shù)據(jù)進行過濾后，得到高質量序列進行從頭拼接，獲得53 159 618 高質量的 clean reads，21 051(69.05%)unigenes被注釋到Nr, Swiss-Prot, KEGG, COG, Go 和 Nt databases等數(shù)據(jù)庫中。轉錄組數(shù)據(jù)提交至NCBI(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)，可通過以下3種方式獲得：BioProject: PRJNA301662；BioSample: SAMN03105778和Short Read Archive (SRA): SRP065982。其它昆蟲的CYP450同源序列直接下載自NCBI的GenBank數(shù)據(jù)庫。

1.2序列鑒定

在粘蟲轉錄組功能注釋結果中，將“P450”設置為關鍵詞進行搜索，將搜索到的預測序列在NCBI中利用BlastX程序進行比對。如果與已知P450蛋白序列一致性高于40%(E值 ≤ e-7)，則認為其可能是粘蟲的P450基因[14]。然后分別以棉鈴蟲的CYP6AE20v2(GenBank登錄號：KM016742)和CYP332A1(GenBank登錄號：KM016708)作為問詢序列在NCBI中進行BlastX搜索，找出粘蟲的CYP6AE和CYP332A亞家族基因[15]。

1.3序列分析

利用軟件對粘蟲CYP6AE88和CYP332A1的cDNA的序列特征、編碼蛋白質的結構和功能進行預測分析，選用的軟件見表1。

表1　分析內(nèi)容及所用軟件的名稱和網(wǎng)址

1.4CYP6AE和CYP332A同源性與系統(tǒng)發(fā)育分析

從BlastX結果中分別統(tǒng)計粘蟲CYP6AE和CYP332A與其它昆蟲統(tǒng)同源氨基酸的一致率(identity)和相似率(positive)。以粘蟲的CYP6AE88和CYP332A1為問詢序列，用NCBI的BlastX檢索代表性鱗翅目昆蟲以及外群的CYP6和CYP332的同源性序列。將黑腹果蠅的CYP6A14序列設為外群，采用最大似然法，用MEGA 6.0軟件分析粘蟲、?；页嵋苟辏莸刎澮苟?，棉鈴蟲，煙草天蛾，家蠶，稻縱卷葉螟，黑腹果蠅的CYP6AE序列之間的系統(tǒng)發(fā)育關系，1 000次重復計算bootstrap(BP)值。采用最大似然法，用MEGA 6.0軟件對粘蟲、棉鈴蟲、家蠶、煙草天蛾的CYP332A序列進行聚類分析。

2結果

2.1cDNA序列分析

通過比對得出粘蟲CYP6AE和CYP332A亞家族的兩條基因序列，分別命名為CYP6AE88(GenBank登錄號：KU145393)和CYP332A1(GenBank登錄號：KU145394)。這兩個基因的cDNA均為該基因的全長序列，其中前者cDNA全長為 1 713 bp，包括1 509 bp的編碼區(qū)，編碼502個氨基酸。后者cDNA全長為1 815 bp，包括1 512 bp的編碼區(qū)，編碼526個氨基酸。蛋白質結構域分析表明這兩個基因均為CYP超家族基因，cDNA編碼的氨基酸序列包含昆蟲細胞色素P450的5個保守結構域(圖1a, b)，分別為WxxxR，A/GGxE/DTT/S，ExxR，PxxFxPE/DRF和FxxGxxxCxG(亦稱血紅素結合區(qū))[16]。

2.2CYP6AE88和CYP332A1所編碼的蛋白質特性分析及功能預測

2.2.1蛋白質一級結構特性分析

軟件ProtParam預測結果表明，CYP6AE88的編碼蛋白的分子式為C2803H4303N715O779S25，理論相對分子質量為58.9 kD，等電點是7.95，不穩(wěn)定指數(shù)為34.64，親水性平均數(shù)為-0.238；CYP332A1 的編碼蛋白的分子式為C2690H4104N666O742S25，理論相對分子質量為58.4 kD，等電點是8.03，不穩(wěn)定指數(shù)40.16，親水性平均數(shù)-0.205。軟件ProtScale預測結果表明CYP6AE88在N端5-22位氨基酸之間有一個典型的疏水性區(qū)域；

圖1a　粘蟲CYP6AE88 cDNA序列及其翻譯的氨基酸序列Fig.1a　cDNA and its translated amino acid sequence of CYP6AE88 from M. separata　　注：起始密碼子和終止密碼子在圖中被紅色線框標出，左側編號為核苷酸和氨基酸對應的編號，P450保守結構域：WxxxR，A/GGxE/DTT/S，ExxR，PxxFxPE/DRF和FxxGxxxCxG 用紅色下劃線標出。圖1b同。Note:The start and stop codon are marked with red boxes，the numbers on the left are the positions of nucleotides and amino acids on the sequences，and the insect P450 conserved motifs including WxxxR，A/GGxE/DTT/S，ExxR，PxxFxPE/DRF and FxxGxxxCxG are underlined in bold red lines．The same for Figure 1b.

圖1b　粘蟲CYP332A1 cDNA序列及其翻譯的氨基酸序列Fig.1b　cDNA and its translated amino acid sequence of CYP332A1 from M. separata

圖2　粘蟲CYP6AE88(a)和CYP332A1(b)蛋白序列的疏水區(qū)預測Fig.2　Hydrophobic region predication of the amino acid sequence of M. separata CYP6AE88 (a) and CYP332A1 (b) proteins. 　　注：正值代表疏水區(qū)，負值代表親水區(qū)。Note: Positive values represent the hydrophobic regions and negative values represent the hydrophilic regions.

圖3　粘蟲CYP6AE88(a)和CYP332A1(b)蛋白跨膜區(qū)域Fig.3　The deduced transmembrane domain topology model of M. separata CYP6AE88 (a) and CYP332A1 (b) proteins

CYP332A1在N端5-23位氨基酸之間有一個典型的疏水性區(qū)域(圖2a，2b)。利用TMHMM Server v.2.0軟件對粘蟲兩個蛋白是否存在跨膜區(qū)進行預測，發(fā)現(xiàn)CYP6AE88編碼的蛋白質跨膜片段約在2～21位氨基酸之間(圖3a)，預測膜上的一些物質與蛋白質有結合部位；CYP332A1編碼的蛋白質在約2～24位氨基酸之間具有跨膜片段(圖3b)，同樣預測膜上的一些物質與蛋白質有結合部位。SignalP 4.1預測2個基因的編碼蛋白均不存在信號肽，亞細胞定位均為細胞質。

2.2.2蛋白功能位點分析

利用ScanProsite軟件對粘蟲CYP6AE88和CYP332AE1進行功能位點分析，預測CYP6AE88含有8個蛋白激酶C磷酸化位點、3個酪氨酸激酶磷酸化位點、6個N端?；稽c、5個酪蛋白激酶Ⅱ磷酸化位點、1個N端糖基化位點和1個細胞色素P450-半胱氨酸血紅素配體信號區(qū)(表2a)。CYP332AE1含有2個N端糖基化位點、2個酪氨酸激酶磷酸化位點、5個酪蛋白激酶Ⅱ磷酸化位點、6個蛋白激酶C磷酸化位點、4個N端?；稽c、1個酰胺化位點和1個細胞色素P450-半胱氨酸血紅素配體信號區(qū)(表2b)。

表2a　ScanProsite預測的粘蟲CYP6AE88蛋白功能位點

表2b　ScanProsite預測的粘蟲CYP332AE1蛋白功能位點

2.2.3蛋白質結構域分析

蛋白質結構域分析表明，CYP6AE88的5個保守結構與昆蟲P450的保守結構存在正常的差異：昆蟲P450的Meander區(qū)(PxxFxPE/DRF)結構域中的第4個氨基酸為苯丙氨酸，而CYP6AE88的(PxxYxPE/DRF)中的第4個氨基酸為酪氨酸，兩者均為芳香族氨基酸，僅有一個基團——苯環(huán)上羥基的差別。CYP332A1的5個保守結構與昆蟲P450的保守結構也存在一定差異：昆蟲P450的Meander 區(qū)(PxxFxPE/DRF)中的苯丙氨酸被CYP332A1的結構域(PxxWxPE/DRF) 中色氨酸代替，兩者均為芳香族氨基酸，也僅有一個基團的差別，一個為苯基，一個為吲哚基。以上兩蛋白的5個結構保守區(qū)在圖4a和圖4b中用紅色線框標出。

2.2.4蛋白質的空間結構預測

應用GORIV方法在線分析粘蟲CYP6AE88基因和CYP332A1基因編碼蛋白質的二級結構，分析顯示： CYP6AE88蛋白質中無規(guī)卷曲占49.31%，所占比例最大，α-螺旋占30.06%，延伸鏈占20.63%(圖5a)；在CYP332A1蛋白質中無規(guī)卷曲占44.14%，所占例最大，α-螺旋占34.99%，延伸鏈占20.87%(圖5b)。由以上數(shù)據(jù)可以推測，兩個蛋白質二級結構中無規(guī)卷曲是所占比例最大，α-螺旋和延伸鏈則可能分散于整個蛋白質中。

通過 PSI-BLAST的搜索CYP6AE88和CYP332AE1與人CYP3A4 氨基酸序列一致性最高，所得相似性參數(shù)為32.17%和26.77%，選擇人CYP3A4 氨基酸序列作為同源建模的模板進行建模。利用SWISSMODEL建模如圖6a，b所示，得到CYP6AE88和CYP332A1的蛋白質三級結構。使用Swiss-PdbViewer4.1.0分析建模所得三級結構進行，軟件運行結果顯示: CYP6AE88有α螺旋18條和β折疊9股， CYP332A1有α螺旋19條和β折疊10股。

2.3粘蟲CYP6AE和CYP332A亞家族相似性和系統(tǒng)發(fā)育分析

將粘蟲CYP6AE88蛋白序列與CYP6AE家族氨基酸序列進行比對，結果表明粘蟲CYP6AE88與?；页嵋苟闏YP6AE49和草地貪夜蛾CYP6AE43氨基酸序列相似性最高，一致率分別為75%和71%，相似率分別為相似率為87%和84%，其次是棉鈴蟲，一致率和相似率分別為69%和85%；將粘蟲CYP332A1蛋白序列與CYP332A家族氨基酸序列進行比對，結果表明粘蟲CYP332A1與棉鈴蟲CYP332A1氨基酸序列相似性最高(一致率為78%，相似率為91%)，其次是家蠶和煙草天蛾，一致率均為63%(見表3)。

圖4a　粘蟲CYP6AE88基因與昆蟲CYP6AE亞家族基因氨基酸序列比較Fig.4a　 Amino acid sequence alignment of CYP6AE88 gene from M. separata with CYP6AE genes from other Noctuidae species　　注：Ms：粘蟲；Sl：?；页嵋苟辏籗f：草地貪夜蛾；Ha：棉鈴蟲 Helicoverpa armigera； Mse：煙草天蛾 ；Bm：家蠶；Cm：稻縱卷葉螟。圖中用紅色線框標出了P450的5個保守結構域，黑色、灰色和白色陰影分別代表氨基酸序列保守性為100%，80%和80%以下。圖4b同。Note：Ms：Mythimna separata；Sl： Spodoptera_littoralis；Sf：Spodoptera frugiperda；Mse：Manduca sexta；Bm： Bombyx mori；Cm：Cnaphalocrocis medinalis。Five conserved domains are line-boxed out in the figure. Black, grey and white shade denote amino acids with 100%, 80% and below 80% identity, respectively．The same for Figure 4b.

選擇粘蟲CYP6AE88和其它6種夜蛾科昆蟲的同源氨基酸序列，以黑腹果蠅CYP6G1氨基酸序列為外群構建系統(tǒng)發(fā)育樹，結果表明草地貪夜蛾CYP6AE43 和?；页嵋苟闏YP6AE49首先聚為一支(BP=100%)，然后與粘蟲CYP6AE88構成單系(BP=72%)，這三者再與棉鈴蟲CYP6AE20v2/50/19形成一支(BP=97%)，系統(tǒng)發(fā)育樹所有節(jié)點的bootstrap值均大于65%(圖7a)。選擇粘蟲CYP332A1和其他3種夜蛾科昆蟲的同源氨基酸序列進行聚類分析，結果表明粘蟲CYP332A1與棉鈴蟲CYP332A1聚為一支，bootstrap值為100%，聚類樹所有節(jié)點的bootstrap值均大于95%(圖7b)。

圖4b　粘蟲CYP332A1基因與昆蟲CYP332A亞家族基因氨基酸序列比較Fig.4b　Amino acid sequence alignment of CYP332A1 gene from M. separata with CYP332A genes from other Noctuidae species　　Ms：粘蟲 Mythimna separata； Ha：棉鈴蟲 Helicoverpa armigera； Bm：家蠶 Bombyx mori； Mse： 煙草天蛾 Manduca sexta．

圖5　粘蟲CYP6AE88(a)和CYP332A1(b)蛋白二級結構預測Fig.5　Predicted secondary structure of M. separata CYP6AE88 (a) and CYP332A1 (b) proteins

表3a粘蟲CYP6AE88與7種其它昆蟲的GenBank登錄號、相似率和一致率

Table 3aThe GenBank accession number, positive and identity in homologous CYP6AE sequences betweenM.separataand 7 other insect species

物種SpeciesGenBank登錄號Accessionnumber相似率/%Positive一致率/%Identity?；页嵋苟闍FP20593.18775草地貪夜蛾AID55427.18471棉鈴蟲AID54896.18569煙草天蛾ADE05581.17862家蠶BAM73891.17660稻縱卷葉螟CAX94849.17455黑腹果蠅NP_610389.35634

3討論

CYP6AE亞家族基因在鱗翅目的草地貪夜蛾、稻縱卷葉螟、?；页嵋苟辍⒓倚Q、棉鈴蟲和煙草天蛾均有報道，分別有2、4、4、16、16和2個該亞家族基因，本研究發(fā)現(xiàn)了粘蟲CYP6AE亞家族具有1個基因。CYP332A亞家族基因位于15號染色體上，截止2015年12月，僅在鱗翅目部分昆蟲中有報道：草地貪夜蛾、稻縱卷葉螟和家蠶各1個，在棉鈴蟲和煙草天蛾中各2個，很可能為在其鄰近轉座子的作用下進行了一次復制[10,17～20]，其它昆蟲中暫未發(fā)現(xiàn)，或許與鱗翅目的某些特殊功能有關，需要進一步研究。也正由于在其它目昆蟲中尚未發(fā)現(xiàn)CYP332A亞家族基因，所以在后續(xù)建樹時未選擇外群，對鱗翅目的代表種類進行聚類分析。

表3b粘蟲CYP332A1與3種其它昆蟲的GenBank登錄號、相似率和一致率

Table 3bThe GenBank accession number, positive and identity in homologous CYP332A sequences betweenM.separataand 3 other Noctuidae species

物種SpeciesGenBank登錄號Accessionnumber相似率/%Positive一致率/%Identity棉鈴蟲AID54860.19178家蠶NP_001108340.18263煙草天蛾ADE05588.17863ADE05587.18062

圖6　粘蟲CYP6AE88(a)和CYP332A1(b)的三維結構預測Fig.6　The 3D structure of M. separata CYP6AE88 (a) and CYP332A1 (b) proteins

圖7a　基于最大似然法構建的7種夜蛾科昆蟲CYP6AE亞家族的系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.7a　The phylogenetic tree of homologous CYP6AE amino acid sequences of 7 Noctuidae species　　注：各序列名稱后為序列的GenBank 登錄號，>50%的bootstrap值標記在樹的分支節(jié)點上。各種中文名及其CYP6AE亞家族蛋白序列的GenBank登錄號見表3。圖7b同。Note: The GenBank accession numbers are listed after the sequence names. The bootstrap values greater than 50% are indicated on each branch．Species name and GenBank accession number are seen in Table 3a, b. The same for Figure 7b.

圖7b　基于最大似然法構建的4種夜蛾科昆蟲CYP332A亞家族的系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.7b　The phylogenetic tree of homologous CYP332A amino acid sequences of 4 Noctuidae species

本研究基于粘蟲轉錄組數(shù)據(jù)獲得了其CYP6AE88和CYP332A1的cDNA全長序列，以其編碼的氨基酸序列與夜蛾科其他昆蟲同源序列對比，發(fā)現(xiàn)P450家族的5個保守序列在兩個基因均存在，證明上述的兩條序列均為細胞色素 P450家族的成員。不同的是粘蟲的這兩個基因的Meander區(qū)都存在一個氨基酸的替換：昆蟲P450的Meander區(qū)(PxxFxPE/DRF)結構域中的第4個氨基酸為苯丙氨酸，在粘蟲CYP6AE88 和CYP332A1的相同位置分別被替換為酪氨酸和色氨酸，三者均為芳香族氨基酸，這可能與不同的昆蟲物種有關。

真核生物的CYP蛋白質的分子量大多在55～60 kD這一范圍內(nèi)[21,22]，在本研究中，粘蟲CYP6AE88的理論分子量為58.9 kD，CYP332A1理論分子量為58.4 kD，位于上述范圍內(nèi)。軟件ProtParam tool和TMHMM Server v. 2.0推測以上兩個蛋白為親水性的膜結合蛋白，關于其功能的研究有待進一步推進。

通過相似性(表3a，b)和系統(tǒng)發(fā)育或聚類樹(圖7a，b)的比較發(fā)現(xiàn)，相似性高的序列在系統(tǒng)發(fā)育樹或聚類樹上聚為一支。在圖7a中，粘蟲CYP6AE88與草地貪夜蛾CYP6AE43首先聚為一支，然后再與棉鈴蟲CYP6AE50成為單系。粘蟲CYP6AE88與草地貪夜蛾CYP6AE43的一致率為71%，相似率為84%，與棉鈴蟲CYP6AE50的一致率為69%，相似率為85%，可見序列的一致率的大小與樹形拓撲結構更吻合。

本研究基于粘蟲轉錄組測序信息鑒定出CYP6AE88和CYP332A1兩個亞家族基因，豐富了粘蟲乃至鱗翅目CYP450超家族基因的數(shù)據(jù)；并利用多種生物信息學軟件，全面分析了其序列特征，預測了蛋白功能，構建了系統(tǒng)發(fā)育樹，為粘蟲的殺蟲劑抗性分子機制研究提供了一定的理論基礎。

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(編輯：張貴森)

Identification and bioinformatics analyses of genesofCYP6AE88 andCYP332A1 inMythimnaseparata

Li Min1, 2， Li Shengcai2， Wang Qing1， Zhang Hufang2*

(1.DepartmentofBiology,TaiyuanNormalUniversity,Taiyuan030031,China； 2.CollegeofAgriculture,ShanxiAgriculturalUniversity,Taigu030801,China)

Abstract:To identify CYP450 genes of Mythimna separate, analyze their bioinformatic characteristics and infer the possible functions for further research on their roles in insecticide resistance. CYP6AE88 and CYP332A1 of M.separata were retrieved from its transcriptome annotation data and identified with bidirectional Blast using Helicoverpa armigera CYP6AE20v2 and CYP332A1 as query, respectively. The structure, characteristics and possible functions of CYP6AE88 and CYP332A1 genes were analyzed using bioinformation methods. The phylogenetic relationships of CYP6AE88 and CYP332A1 sequences of M. separate and representative noctuid species was constructed using maximum likelihood methods, respectively. Two CYP450 genes were identified from M.separata transcriptome sequenced data and named as CYP6AE88 (GenBank accession number: KU145393) and CYP332A1 (GenBank accession number: KU145394), respectively. They were 1590 bp and 1542 bp in length，encoding 509 and 503 amino acids, respectively. Basic properties of the protein CYP6AE88 and CYP332A1 showed that the molecular weight was 58.9kD and 58.4 kD, the isoelectric point was 7.95 and 8.03, the predicted hydrophobic region was 5-22 and 5-23, the transmembrane region was 2-21 and 2-24, respectively. Both of the two deduced amino acid sequences had no signal peptide sequence and were localized in cytoplasm. Protein domain prediction showed that the encoded proteins of these two genes contained five P450 characteristic sequences and had multiple enzyme active sites. The 3D structural prediction showed that CYP6AE88 had 18 α-helix and 9 β-strands, while CYP332A1 had 19 α-helix and 10 β-strands. Phylogenetic analysis of CYP6AE showed that M.separate CYP6AE88 were grouped with (Spodoptera frugiperda CYP6AE43 + Spodoptera littoralis CYP6AE49) (BP=72%), and then formed monophyletic relationship with Helicoverpa armigera CYP6AE20v2/50/19 (BP=100%). Clustering analysis of CYP332A showed that M.separate CYP332A1 and H.armigera CYP332A1 were the first cluster (BP=100%). This study laid a foundation for further study on the roles of CYP6AE88 and CYP332A1 in M.separate insecticide resistance.

Key words:Mythimna separata; CYP450; CYP6AE88; CYP332A1; Bioinformatics analysis

中圖分類號：S433.4

文獻標識碼：A

文章編號：1671-8151(2016)03-0191-10

基金項目：中國博士后研究經(jīng)費(134845)；國家自然科學基金項目(31501840)；山西省科技攻關項目(NO.20150311010-7)；太原師范學院大學生創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)項目(CXCY1610)

作者簡介：李敏(1983-)，女(漢)，山東萊蕪人，博士研究生，研究方向：昆蟲分子生物學*通訊作者：張虎芳，教授，碩士生導師。Tel:0354-6288225，E-mail: zh_hufang@sohu.com

收稿日期：2015-12-05修回日期：2016-01-06