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    高效液相色譜法同時(shí)測定肝微粒體中咪達(dá)唑侖及代謝產(chǎn)物含量

    2016-04-09 05:57:05胡春偉鄭州市第一人民醫(yī)院藥劑科鄭州450001
    關(guān)鍵詞:微粒體咪達(dá)唑侖精密度

    胡春偉(鄭州市第一人民醫(yī)院藥劑科,鄭州 450001)

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    高效液相色譜法同時(shí)測定肝微粒體中咪達(dá)唑侖及代謝產(chǎn)物含量

    胡春偉*(鄭州市第一人民醫(yī)院藥劑科,鄭州450001)

    DOI10.14009/j.issn.1672-2124.2016.01.018

    摘要目的: 建立高效液相色譜法測定大鼠肝微粒體中咪達(dá)唑侖及1-OH咪達(dá)唑侖的含量。 方法:色譜柱為COSMOSIL C18柱(4.6 mm×250 mm,5μm),流動(dòng)相為甲醇∶乙腈∶水(V∶V∶V=55∶11∶34),流速為1.0 ml/min,柱溫為25 ℃,檢測波長為220 nm。結(jié)果:咪達(dá)唑侖和1-OH咪達(dá)唑侖線性范圍分別是1.0~64.0 μm(r=0.999 2)和0.125~8.0 μm(r=0.999 4),呈良好的線性關(guān)系。咪達(dá)唑侖的批內(nèi)、批間精密度為3.7%~11.2%和4.2%~13.1%,提取回收率為(91.46±9.03)%~(94.54±7.62)%;1-OH咪達(dá)唑侖的批內(nèi)、批間精密度為5.9%~10.4%和7.7%~12.3%,提取回收率為(92.27±8.11)%~(95.16±5.72)%。咪達(dá)唑侖和1-OH咪達(dá)唑侖在室溫保存8 h、反復(fù)凍融3次和-20 ℃保存1周含量穩(wěn)定,與新鮮樣品比較,差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。結(jié)論:本法快速、準(zhǔn)確、重現(xiàn)性好,可同時(shí)測定大鼠肝微粒體中咪達(dá)唑侖及1-OH咪達(dá)唑侖的濃度。

    關(guān)鍵詞咪達(dá)唑侖; 1-OH咪達(dá)唑侖; 高效液相色譜法

    Simultaneous Determination of Content of Midazolam and Its Metabolite in Liver Microsome by HPLC

    HU Chunwei(Dept.of Pharmacy, the First People’s Hospital of Zhengzhou, Zhengzhou 450001, China)

    ABSTRACTOBJECTIVE:To establish a HPLC method for content determination of midazolam and 1-OH midazolam in rat liver mircosome. METHODS: The column was COSMOSIL C18(4.6 mm×250 mm,5 μm)with the mobile phase of methanol-acetonitrile-water (V∶V∶V=55∶11∶34) at flow rate of 1.0 ml/min. The temperature was 25 ℃, and the detection wavelength was at 220 nm. RESULTS: The liner range of midazolam and 1-OH midazolam were respectively 1.0~64.0 μm(r=0.999 2) and 0.125~8.0 μm(r=0.999 4). The RSD range of intra-precision and inter-precision of midazolam were respectively 3.7%~11.2% and 4.2%~13.1%, and the average extraction recoveries were (91.46±9.03)%~(94.54±7.62)%, meanwhile, the RSD range of intra-precision and inter-precision of 1-OH midazolam were respectively 5.9%~10.4% and 7.7%~12.3%, and the average extraction recoveries were (92.27±8.11)%~(95.16±5.72)%. The tests for the stability showed that there is no significantly difference between midazolam and 1-OH midazolam during the storage at room temperature for 8 hours, Freeze-thaw cycles for 3 times and stored at -20 ℃ for 1 week(P>0.05). CONCLUSIONS: The method is simple, accurate and repeatable, and can be used for the simultaneous concentration determination of midazolam and 1-OH midazolam in rat liver mircosome.

    KEYWORDSMidazolam; 1-OH midazolam; HPLC

    咪達(dá)唑侖為短效苯二氮卓類藥物,在臨床上廣泛應(yīng)用于誘導(dǎo)麻醉、鎮(zhèn)靜和控制癲癇持續(xù)狀態(tài)[1]。CPY3A是肝藥酶家族中含量最為豐富的一個(gè)亞家族,咪達(dá)唑侖是美國食品藥品監(jiān)督管理局(food and drug administration,FDA)推薦進(jìn)行CYP3A體外、體內(nèi)研究的探針?biāo)幬颷4-6]。咪達(dá)唑侖在體內(nèi)主要代謝為1-OH咪達(dá)唑侖,并且其代謝速度可以反映出CYP3A的活性。文獻(xiàn)報(bào)道測定咪達(dá)唑侖的方法包括高效液相-紫外檢測法(HPLC-UV)、液-質(zhì)聯(lián)用法(HPLC-MS)、氣-質(zhì)聯(lián)用法(GS-MS)等[7-10]。盡管質(zhì)譜檢測器具有靈敏度較高、所需樣品體積小等優(yōu)點(diǎn),但是由于其使用及維護(hù)價(jià)格較為昂貴,導(dǎo)致其在臨床和實(shí)驗(yàn)室研究過程中應(yīng)用受到局限。目前報(bào)道的檢測咪達(dá)唑侖HPLC-UV中,大多數(shù)存在靈敏度低、保留時(shí)間長和使用流動(dòng)相價(jià)格較貴等缺點(diǎn)。為此,本試驗(yàn)建立了同時(shí)檢測肝微粒體中咪達(dá)唑侖及其代謝產(chǎn)物1-OH咪達(dá)唑侖濃度的HPLC-UV檢測法,為CYP3A代謝藥物研究提供了一種快速簡便、準(zhǔn)確可靠的方法。

    1材料

    1.1儀器

    島津LC-2010A高效液相色譜系統(tǒng)(日本島津公司);SPA-10AVP UV/VIS檢測器;LC-Solution工作站;Biofuge Stratos型低溫高速離心機(jī)(Heraeus,德國);XW-80A型旋渦混合器(江蘇金壇醫(yī)療儀器廠);BP121S電子分析天平(Sartorious,德國)。

    1.2藥品與試劑

    咪達(dá)唑侖注射液(江蘇恩華藥業(yè)股份有限公司,批號:20141008);1-OH咪達(dá)唑侖(cerilliant analylical reference standards,批號:FN-31309-01);甲醇、乙腈(色譜純);天津四友精細(xì)化學(xué)品有限公司;水為純化水;其他試劑均為國產(chǎn)。

    1.3試驗(yàn)動(dòng)物

    SD雄性大鼠,體質(zhì)量250~300 g,由河南省中醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供,動(dòng)物合格證號:0008906。

    2方法與結(jié)果

    2.1色譜條件

    COSMOSIL C18柱(4.6 mm×250 mm,5 μm);流動(dòng)相∶甲醇∶乙腈∶水(V∶V∶V=55∶11∶34);流速:1.0 ml/min;柱溫:25 ℃;檢測波長:220 nm;進(jìn)樣量:20 μl。

    2.2溶液的制備

    2.2.1對照品溶液的制備:在具塞塑料離心管中加入磷酸鹽緩沖液(0.1 mol/L,pH 7.0),咪達(dá)唑侖標(biāo)準(zhǔn)溶液,肝微粒體蛋白重懸液(0.25 mg/L),使之成為200 μl體系。渦旋均勻后,加入乙腈終止反應(yīng),渦旋2 min,15 000 g冷凍離心10 min,取上清液20 μl進(jìn)樣,記錄色譜圖。

    2.2.2方法學(xué)考察:(1)專屬性:將空白肝微粒體、一定濃度的咪達(dá)唑侖標(biāo)準(zhǔn)液和一定濃度的1-OH咪達(dá)唑侖標(biāo)準(zhǔn)液,按照“2.2”項(xiàng)下處理方法,進(jìn)樣,記錄色譜圖。(2)標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備:在具塞離心管中分別依次精密加入咪達(dá)唑侖標(biāo)準(zhǔn)液和1-OH咪達(dá)唑侖標(biāo)準(zhǔn)液適量,氮?dú)獯蹈桑偌尤肓姿猁}緩沖液,體系同“2.2”,渦旋混合均勻后,配成含咪達(dá)唑侖1.0、2.0、4.0、8.0、16.0、32.0、64.0 μm和1-OH咪達(dá)唑侖0.125、0.25、0.5、1.0、2.0、4.0、8.0 μm的標(biāo)準(zhǔn)系列濃度的樣品體系,按照“2.2”項(xiàng)下處理方法,對樣品進(jìn)行處理后進(jìn)樣,記錄色譜圖峰面積(A)。以樣品中待測物質(zhì)的濃度C為橫坐標(biāo),以樣品峰面積A為縱坐標(biāo)做線性回歸,得到標(biāo)準(zhǔn)曲線。

    2.3精密度試驗(yàn)

    在具塞離心管中,按照標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備方法,分別配制成咪達(dá)唑侖的終濃度為2.0、16.0、64.0 μm,1-OH咪達(dá)唑侖的終濃度為0.25、2.0、8.0 μm的待測樣品各5份,按照“2.2”項(xiàng)下處理方法,對樣品進(jìn)行處理后進(jìn)樣,記錄色譜圖峰面積(A)。測得體系中咪達(dá)唑侖和1-OH咪達(dá)唑侖的精密度。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算相應(yīng)的濃度。1 d內(nèi)對高、中、低濃度樣品分析5次,得到批內(nèi)精密度,連續(xù)3 d測定3個(gè)分析批,得到批間精密度。

    2.4回收率試驗(yàn)

    在具塞離心管中,按照標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備方法,分別配制成咪達(dá)唑侖的終濃度為2.0、16.0、64.0 μm,1-OH咪達(dá)唑侖的終濃度為0.25、2.0、8.0 μm的待測樣品各5份,按照“2.2”項(xiàng)下處理方法,對樣品進(jìn)行處理后進(jìn)樣,記錄色譜圖峰面積(A),帶入標(biāo)準(zhǔn)曲線,考察樣品的回收率。

    2.5穩(wěn)定性試驗(yàn)

    在具塞離心管中,按照標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備方法,分別配制成咪達(dá)唑侖的終濃度為2.0、16.0、64.0 μm,1-OH咪達(dá)唑侖的終濃度為0.25、2.0、8.0 μm的待測樣品各5份,分別置室溫8 h、反復(fù)凍融3次和-20 ℃保存7 d條件下,按照“2.2”項(xiàng)下處理方法,對樣品進(jìn)行處理后進(jìn)樣,記錄色譜圖峰面積(A),帶入標(biāo)準(zhǔn)曲線,考察樣品的穩(wěn)定性。

    2.6專屬性試驗(yàn)

    在選定“2.1”項(xiàng)下的色譜條件,1-OH咪達(dá)唑侖和咪達(dá)唑侖峰型尖銳,分離完全,大鼠肝微粒體中無內(nèi)源性物質(zhì)和雜質(zhì)干擾。咪達(dá)唑侖和1-OH咪達(dá)唑侖的保留時(shí)間分別為9.6 min 和7.1 min,見圖1。

    2.7標(biāo)準(zhǔn)曲線

    取空白肝微粒體重懸液配制成含咪達(dá)唑侖1.0、2.0、4.0、8.0、16.0、32.0、64.0 μm和含有1-OH咪達(dá)唑侖0.125、0.25、0.5、1.0、2.0、4.0、8.0 μm的系列濃度樣品和的系列濃度樣品,按照“2.2”項(xiàng)下處理并測定,原始數(shù)據(jù)見表1~2。以峰面積A對肝微粒體中相應(yīng)的咪達(dá)唑侖和1-OH咪達(dá)唑侖濃度做線性回歸,咪達(dá)唑侖在1.0~64.0 μm之間線性關(guān)系良好,回歸方程為:Y=0.0137X-0.077 (r=0.999 2),1-OH咪達(dá)唑侖在0.125~8.0 μm之間線性關(guān)系良好,回歸方程為:Y=0.0135X+0.0339(r=0.999 4)。

    表1 肝微粒體中系列濃度咪達(dá)唑侖與峰面積

    表2 肝微粒體中系列濃度1-OH咪達(dá)唑侖與峰面積

    2.8精密度試驗(yàn)結(jié)果

    測得咪達(dá)唑侖和1-OH咪達(dá)唑侖的低、中、高3個(gè)濃度的批內(nèi)、批間差結(jié)果見表3,結(jié)果顯示,二者批內(nèi)、批間RSD﹤15.0%。

    2.9回收率試驗(yàn)結(jié)果

    測得咪達(dá)唑侖和1-OH咪達(dá)唑侖的提取回收率結(jié)果見表4。結(jié)果顯示,二者的低、中、高濃度的提取回收率,均符合生物樣品測定要求。

    2.10穩(wěn)定性試驗(yàn)

    測得肝微粒體中1-OH咪達(dá)唑侖和咪達(dá)唑侖的低、中、高濃度室溫保存8 h、反復(fù)凍融3次、-20 ℃下保存1周的結(jié)果見表5。結(jié)果經(jīng)過配對t檢驗(yàn)顯示,上述處理組的樣品和新鮮配制的待測樣品比較,差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05),符合血漿中生物樣品穩(wěn)定性的測定要求。

    (A) 空白肝微粒體 (B) 含咪達(dá)唑侖肝微粒體 (C) 含1-OH咪達(dá)唑侖肝微粒體(A) blank liver mircosome (B) liver mircosome with midazolam (C)liver mircosome with 1-OH midazolam圖1 大鼠肝微粒體中咪達(dá)唑侖和1-OH咪達(dá)唑侖HPLC色譜圖Fig 1 HPLC chromatograms of midazolam and 1-OH midazolam in rat liver mircosome

    樣品濃度/μm批內(nèi)精密度批間精密度x±sRSD/%x±sRSD/%咪達(dá)唑侖2.02.11±0.2211.22.03±0.2613.116.015.8±1.076.715.6±1.267.964.064.68±2.573.763.63±2.694.21-OH咪達(dá)唑侖0.250.26±0.0210.40.26±0.0211.12.01.94±0.178.91.93±0.2412.38.08.05±0.475.97.92±0.617.7

    表4 肝微粒體中咪達(dá)唑侖和1-OH咪達(dá)唑侖提取回收率結(jié)果

    表5 肝微粒體中咪達(dá)唑侖和1-OH咪達(dá)唑侖穩(wěn)定性結(jié)果

    3討論

    咪達(dá)唑侖在體內(nèi)外的代謝速率可以作為大鼠和人體肝CYP3A活性的重要指標(biāo)之一。據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道,測定咪達(dá)唑侖的方法中,往往僅能檢測出咪達(dá)唑侖,而不能對其代謝產(chǎn)物1-OH咪達(dá)唑侖進(jìn)行定量[11-13],本研究建立了一個(gè)在大鼠肝微粒體中同時(shí)檢測該2種物質(zhì)的方法。咪達(dá)唑侖在生物樣品中的提取多采用甲苯、氯仿、乙酸乙酯和乙醚萃取的方法,萃取法提取回收率低,并且所使用的甲苯、氯仿、乙醚等有機(jī)溶劑具有毒性,對人體危害較大;乙酸乙酯不易揮發(fā),萃取操作時(shí)間較長。本研究采用在反應(yīng)體系中加入乙腈直接沉淀蛋白的方法,離心后直接進(jìn)樣,有機(jī)溶劑暴露時(shí)間短,不用萃取,操作簡便,色譜峰雜質(zhì)干擾少,回收率高。

    據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道,咪達(dá)唑侖的保留時(shí)間較長[13],本文考察了甲醇、乙腈和水作為不同比例作為流動(dòng)相對分離測定的影響,結(jié)果顯示,當(dāng)甲醇∶乙腈∶水(V∶V∶V=55∶11∶34)時(shí),1-OH咪達(dá)唑侖和咪達(dá)唑侖保留時(shí)間短,分離度好。

    本研究建立的方法可同時(shí)檢測大鼠肝微粒體中的咪達(dá)唑侖及其代謝產(chǎn)物1-OH咪達(dá)唑侖的含量,其專屬性、線性范圍、精密度、回收率和穩(wěn)定性均符合生物樣品的分析要求,為研究大鼠和人體肝CYP3A的代謝提供了一個(gè)高效、簡便、快捷的方法。

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    (收稿日期:2015-09-07)

    中圖分類號R927.11

    文獻(xiàn)標(biāo)志碼A

    文章編號1672-2124(2016)01-0042-04

    *副主任藥師。研究方向:婦科臨床用藥指導(dǎo)。E-mail:Tofkj@126.com

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