我國(guó)西部漢族人IL-10基因多態(tài)性與肺結(jié)核易感性的相關(guān)性研究

譚國(guó)超　徐春娟　馬紀(jì)龍

721006 寶雞，解放軍第三醫(yī)院石壩河分院1

邊　靜1　溫　煜1　來(lái)力偉1

張方琪2　成家軍2

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·論著·

我國(guó)西部漢族人IL-10基因多態(tài)性與肺結(jié)核易感性的相關(guān)性研究

譚國(guó)超1徐春娟1馬紀(jì)龍1

721006 寶雞，解放軍第三醫(yī)院石壩河分院1

邊靜1溫煜1來(lái)力偉1

張方琪2成家軍2

【摘要】目的探討白介素-10(IL-10)基因單核苷酸多態(tài)性與肺結(jié)核易感性的相關(guān)性，為肺結(jié)核的早期預(yù)警提供新的候選分子標(biāo)志物。方法檢測(cè)147例肺結(jié)核患者(病例組)及206例健康個(gè)體(對(duì)照組)中IL-10基因-819(C>T)、-1 082(A>G)多態(tài)位點(diǎn)基因型，進(jìn)行關(guān)聯(lián)分析。結(jié)果樣本均衡性檢驗(yàn)顯示病例組與對(duì)照組個(gè)體之間在性別(P=0.575)、年齡(P=0.840)分布無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異；基因分型檢出率為99.7%；哈德溫伯格平衡檢測(cè)顯示對(duì)照組個(gè)體符合遺傳學(xué)規(guī)律(P值分別為0.137與0.311)；-819位點(diǎn)CC、CT、TT基因型分布在病例組與對(duì)照組間無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P=0.901)；-1 082多態(tài)位點(diǎn)AA、AG、GG基因型在病例組中的分布頻率分別為48.6%、43.2%和8.2%，而在對(duì)照組中分別為60.5%、36.1%和3.4%，二者之間存在統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P=0.032)，G為風(fēng)險(xiǎn)等位基因(OR=1.55, 95%CI 1.10～2.19)。結(jié)論IL-10基因-1 802(A>G)位點(diǎn)單核苷酸多態(tài)性與我國(guó)西部漢族人群肺結(jié)核易感性顯著相關(guān)，可作為該地區(qū)肺結(jié)核早期預(yù)警篩查的候選分子標(biāo)志物。

【關(guān)鍵詞】肺結(jié)核；白介素-10；單核苷酸多態(tài)性

結(jié)核病(tuberculosis, TB)是一類由結(jié)核分枝桿菌引起的、多發(fā)的、在許多情況下能夠致死的傳染性疾病，大多發(fā)生在肺部。我國(guó)是肺結(jié)核的高發(fā)地區(qū)，每年發(fā)病人數(shù)占全球發(fā)病總?cè)藬?shù)的11%，居世界第二位，尤以西部地區(qū)和農(nóng)村地區(qū)疫情最為嚴(yán)重。結(jié)核病的易感性與嚴(yán)重程度與多種因素相關(guān)[1-2]。有研究報(bào)道細(xì)胞因子基因如白介素-10(IL-10)多態(tài)性與肺結(jié)核易感性之間存在相關(guān)性，但這種關(guān)聯(lián)存在地域和人種的差異。本研究采用病例對(duì)照方法，對(duì)我國(guó)西部漢族人群肺結(jié)核易感性與IL-10基因單核苷酸多態(tài)性的相關(guān)性進(jìn)行了關(guān)聯(lián)分析，旨在為該地區(qū)提供肺結(jié)核早期預(yù)警篩查的候選分子標(biāo)志物。

資料與方法

一、研究對(duì)象

選取2013年2月至2015年2月寶雞市解放軍第三醫(yī)院石壩河分院結(jié)核科收治的肺結(jié)核患者147例為病例組，206例同期來(lái)院體檢的健康個(gè)體為對(duì)照組。病例組年齡分布為26~75歲，平均(55.4±12.4)歲，其中男性87例，女例60例。對(duì)照組年齡分布為23~72歲，平均(55.7±12.1)歲，其中男性128例，女性78例?？紤]到環(huán)境與遺傳因素對(duì)肺結(jié)核易感性的影響，所有研究對(duì)象均為寶雞市及陜西省常住漢族人口(居住5年以上)，標(biāo)本采集嚴(yán)格遵守知情同意原則。

二、研究方法

采用病例對(duì)照方法分析IL-10基因-819(C>T)、-1 082(A>G)位點(diǎn)單核苷酸多態(tài)性與研究對(duì)象肺結(jié)核易感性的相關(guān)性。采用北京天根生物技術(shù)公司全血基因組DNA提取試劑盒對(duì)研究對(duì)象外周血樣本進(jìn)行基因組DNA提取，所得標(biāo)本于-20 ℃保存?zhèn)溆谩Ｊ褂镁酆厦告湻磻?yīng)序列特異性引物(PCR-SSP)對(duì)IL-10基因-819(C>T)、-1 082(A>G)兩位點(diǎn)進(jìn)行基因分型。

三、統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用χ2檢驗(yàn)、t檢驗(yàn)對(duì)病例組與對(duì)照組樣本均衡性進(jìn)行檢驗(yàn)；采用哈德溫伯格平衡檢驗(yàn)分析對(duì)照組個(gè)體是否符合遺傳學(xué)定律；比較病例組與對(duì)照組之間基因型、等位基因分布是否存在差異，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié)果

一、 樣本均衡性檢驗(yàn)

表1所示為病例組和對(duì)照組的一般情況。共納入肺結(jié)核患者147例(病例組)，健康個(gè)體206例(對(duì)照組)。病例組平均年齡55.4歲，對(duì)照組平均年齡55.7歲，兩組無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P=0.840)；病例組中男性87例(59.2%)、女性60例(40.8%)，對(duì)照組中男性128例(62.1%)、女性78例(37.9%)，兩組無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P=0.575)。

二、基因分型

對(duì)提取的DNA樣本進(jìn)行基因分型，819(C>T)位點(diǎn)在病例組與對(duì)照組中分別檢出147例與206例，1 802(A>G)位點(diǎn)分別檢出146例與205例，總檢出率達(dá)99.7%。哈德溫伯格平衡檢測(cè)兩位點(diǎn)在對(duì)照組中的基因型分布，P值分別為0.137與0.311，顯示對(duì)照樣本符合遺傳學(xué)規(guī)律, 見表2。

表1　病例組和對(duì)照組一般情況

表2　IL-10基因-819(C>T)、-1 082(A>G)兩位點(diǎn)基因

三、候選位點(diǎn)多態(tài)性與肺結(jié)核易感性之間的相關(guān)性分析

比較病例組與對(duì)照組之間-819(C>T)、-1 082(A>G)兩位點(diǎn)在基因型、等位基因分布頻率之間的差異。發(fā)現(xiàn)-819(C>T)的CC、CT、TT三種基因型在病例組中所占比例分別為34.0%、51.7%和14.3%，在對(duì)照組中所占比例分別為35%、52.4%和12.6%，在兩組間無(wú)顯著差異(表3，P=0.901)。-1 082(A>G)AA、AG、GG三種基因型在病例組中所占比例分別為48.6%、43.2%和8.2%，而在對(duì)照組中分別為60.5%、36.1%和3.4%，兩組在基因型與等位基因分布均有顯著差異(表3，P值分別為0.032和0.012)，其中G為風(fēng)險(xiǎn)等位基因(OR=1.55, 95%CI1.10～2.19)。

表3　IL-10基因-819(C>T)、 -1 082(A>G)兩位點(diǎn)等

討論

本研究旨在探索以IL-10為代表的細(xì)胞因子單核苷酸多態(tài)性與我國(guó)西部漢族人群肺結(jié)核易感性的相關(guān)性，通過采用病例對(duì)照研究方法，入組了147例肺結(jié)核患者(病例組)和206例健康個(gè)體(對(duì)照組)，對(duì)其外周血樣本進(jìn)行核酸提取、基因分型與關(guān)聯(lián)分析。結(jié)果顯示，IL-10基因-1 082(A>G)位點(diǎn)單核苷酸多態(tài)性與我國(guó)西部漢族人群肺結(jié)核易感性顯著相關(guān)，為該地區(qū)肺結(jié)核的預(yù)警與早期診斷提供了新的候選分子標(biāo)志物。

肺結(jié)核是一類由結(jié)核分枝桿菌引起的多發(fā)性的慢性呼吸系統(tǒng)疾病，是全世界致死率最高的傳染性疾病之一。2010年我國(guó)新增肺結(jié)核病例數(shù)約100萬(wàn)，占全球發(fā)病總?cè)藬?shù)的11%，居世界第二位。已知肺結(jié)核易感性與多種因素相關(guān)。其中最受關(guān)注的是HIV病毒，約13%的肺結(jié)核患者是HIV感染者。肺結(jié)核還是貧困相關(guān)的主要疾病之一，受地區(qū)經(jīng)濟(jì)狀況影響明顯，人群的擁擠程度和營(yíng)養(yǎng)狀況與肺結(jié)核發(fā)病率顯著相關(guān)[3]。慢性肺部疾病也是肺結(jié)核感染的另一高危因素，矽肺能夠使肺結(jié)核發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)提高近30倍[4]。而吸煙者患肺結(jié)核的風(fēng)險(xiǎn)是非吸煙者的近2倍。2012年進(jìn)行的一項(xiàng)meta分析則表明，在同一人群中年輕人比老年人更易患肺結(jié)核[5]。

而隨著研究的不斷深入，人們發(fā)現(xiàn)在結(jié)核分枝桿菌感染者中只有約10%的人群會(huì)發(fā)展為活動(dòng)性肺結(jié)核[6]。因此，環(huán)境——病原微生物——宿主遺傳易感性之間相互作用引發(fā)肺結(jié)核的模式越來(lái)越被人們所認(rèn)可。近年來(lái)，多項(xiàng)研究表明個(gè)體遺傳因素與肺結(jié)核易感性之間存在著顯著關(guān)聯(lián)，包括領(lǐng)養(yǎng)研究、雙胞胎研究、全基因組連鎖研究、病例—對(duì)照關(guān)聯(lián)研究等。由于目前仍沒有關(guān)于肺結(jié)核病開展的全基因組關(guān)聯(lián)研究數(shù)據(jù)可供解讀，所以候選基因策略由于其低成本、尤其在探索低等位基因頻率易感基因的作用中仍然具有很好的應(yīng)用前景。我國(guó)西部地區(qū)是肺結(jié)核高發(fā)區(qū)，針對(duì)我國(guó)西部地區(qū)開展肺結(jié)核易感性與候選基因多態(tài)性的關(guān)聯(lián)研究，以鑒定出特異、高效的分子標(biāo)志物是目前亟待解決的問題。

大量關(guān)聯(lián)研究結(jié)果顯示，結(jié)核患者的病理狀態(tài)與某些促炎、細(xì)胞因子的上調(diào)或下調(diào)相關(guān)聯(lián)[7]，而位于細(xì)胞因子基因啟動(dòng)子和編碼區(qū)的單核苷酸多態(tài)性位點(diǎn)能夠通過改變所在基因的轉(zhuǎn)錄活性而影響分泌[8]。在發(fā)病部位中由于T淋巴細(xì)胞與被感染的巨噬細(xì)胞的相互作用而產(chǎn)生的細(xì)胞因子對(duì)于肺結(jié)核的發(fā)病機(jī)制起到了重要作用[9]。結(jié)核分枝桿菌感染宿主細(xì)胞的過程受到2種T細(xì)胞輔助因子的調(diào)節(jié)。其中，T細(xì)胞輔助因子1(IL-2和IFN-γ)與抗感染相關(guān)，而T細(xì)胞輔助因子2(IL-4和IL-13)被認(rèn)為與疾病的發(fā)展相關(guān)[10]。

IL-10是一種具有多重功能的細(xì)胞因子，最初發(fā)現(xiàn)能夠抑制小鼠Th1細(xì)胞IFN-γ的0合成，而被認(rèn)為具有抑制細(xì)胞因子合成的作用[11]。IL-10能夠在炎癥發(fā)生過程中通過下調(diào)促炎細(xì)胞因子IL-12和TNF-α的表達(dá)，從而起到抑制單核/巨噬細(xì)胞的作用，并能抑制主要組織相容性復(fù)合體Ⅱ在細(xì)胞表面的表達(dá)[12]。IL-10還可以抑制CD4+的T細(xì)胞對(duì)IL-8的趨化作用[11]，并通過上調(diào)Bcl-2的表達(dá)抑制T細(xì)胞的凋亡[13]。近期研究表明，IL-10對(duì)T細(xì)胞的抑制作用能夠通過阻斷CD28分子的信號(hào)通路以及隨后的磷脂酰肌醇3-激酶的活化來(lái)完成[14]。作為T細(xì)胞調(diào)節(jié)因子之一，IL-10被認(rèn)為可能在慢性/潛伏期肺結(jié)核的發(fā)展過程中發(fā)揮重要作用。研究表明，在小鼠體內(nèi)，上調(diào)其表達(dá)能夠促進(jìn)慢性肺結(jié)核的激活并抑制細(xì)胞免疫對(duì)胞內(nèi)感染的抵抗[15]。

據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道，IL-10基因單核苷酸多態(tài)性-1 082(A>G)位點(diǎn)與非洲西部的岡比亞[16]、馬拉維[17]人群肺結(jié)核易感性之間并無(wú)顯著關(guān)聯(lián)。另一方面，有研究發(fā)現(xiàn)IL-10-1 082(A>G)位點(diǎn)A基因型與意大利西西里島人肺結(jié)核易感性顯著相關(guān)[18]；在柬埔寨人群中進(jìn)行的另一項(xiàng)關(guān)聯(lián)研究發(fā)現(xiàn)其GA雜合型攜帶者患肺結(jié)核風(fēng)險(xiǎn)較野生純合型個(gè)體顯著升高[19]；而IL-10-592(C>A)位點(diǎn)的C基因型與韓國(guó)人群肺結(jié)核患病風(fēng)險(xiǎn)降低相關(guān)[20]。此外，基于單體型的分析顯示，IL-10基因1 082(A>G)、819(C>T)、592(C>A)三位點(diǎn)能夠形成GCC、ACC、ATA三種主要單體型，在與加納人群結(jié)核菌素皮膚試驗(yàn)反應(yīng)的相關(guān)性研究中關(guān)聯(lián)顯著，但與肺結(jié)核易感性的關(guān)聯(lián)并無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義[21]；在我國(guó)香港進(jìn)行的一項(xiàng)研究則表明單體型-GCC與肺結(jié)核患者復(fù)發(fā)呈輕度相關(guān)[22]。

然而，細(xì)胞因子基因多態(tài)位點(diǎn)的等位基因頻率隨著地域、人種的不同呈現(xiàn)出顯著的差異，這在一定程度上決定了其與肺結(jié)核易感性相關(guān)性的不同。本研究結(jié)果表明，IL-10基因-819(C>T)CC、CT、TT三種基因型在病例組中所占比例分別為34.0%、51.7%和14.3%，在對(duì)照組中所占比例分別為35%、52.4%和12.6%，在兩組間無(wú)顯著差異(P=0.901)。-1 082(A>G)AA、AG、GG三種基因型在病例組中所占比例分別為48.6%、43.2%和8.2%，而在對(duì)照組中分別為60.5%、36.1%和3.4%，病例組中的突變率顯著高于對(duì)照組，基因型分布頻率顯示兩組之間存在顯著差異(P=0.032)。按等位基因比較發(fā)現(xiàn)，A到G的突變能夠使個(gè)體肺結(jié)核的發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)上調(diào)55%(P=0.012,OR=1.55，95%CI1.10～2.19)。

綜上，本研究發(fā)現(xiàn)IL-10基因-1 082(A>G)位點(diǎn)單核苷酸多態(tài)性與我國(guó)西部漢族人群患肺結(jié)核的風(fēng)險(xiǎn)升高顯著相關(guān)，表明其多態(tài)性有望作為該地區(qū)肺結(jié)核早期預(yù)警和診斷的候選分子標(biāo)志物，為建立和完善我國(guó)西部地區(qū)肺結(jié)核易感因素的資料具有很重要的理論和臨床意義。

參考文獻(xiàn)

1高振秋, 王東方, 任成山. 耐多藥結(jié)核病臨床研究的回顧與展望[J/CD]. 中華肺部疾病雜志： 電子版, 2010, 3(5): 353-363.

2王細(xì)文, 胡明冬. 耐多藥結(jié)核病—預(yù)防和控制的關(guān)鍵步驟[J/CD]. 中華肺部疾病雜志： 電子版, 2010, 3(6): 443-450.

3Floe A, Hilberg O, Wejse C, et al. The economic burden of Tuberculosis in Denmark 1998-2010. Cost analysis in patients and their spouses[J]. Int J Infect Dis, 2015, 32: 183-190.

4Byrne AL, Marais BJ, Mitnick CD, et al. Tuberculosis and chronic respiratory disease: a systematic review[J]. Int J Infect Dis, 2015, 32: 138-146.

5Mahasirimongkol S, Yanai H, Mushiroda T, et al. Genome-wide association studies of tuberculosis in Asians identify distinct at-risk locus for young tuberculosis[J]. J Hum Genet, 2012, 57(6): 363-367.

6Moller M, Hoal EG. Current findings, challenges and novel approaches in human genetic susceptibility to tuberculosis[J]. Tuberculosis (Edinb), 2010, 90(2): 71-83.

7Ferraz JC, Melo FB, Albuquerque MF, et al. Immune factors and immunoregulation in tuberculosis[J]. Braz J Med Biol Res, 2006, 39(11): 1387-1397.

8Ansari A, Talat N, Jamil B, et al. Cytokine gene polymorphisms across tuberculosis clinical spectrum in Pakistani patients[J]. PLoS One, 2009, 4(3): e4778.

9Sher A, Coffman RL. Regulation of immunity to parasites by T cells and T cell-derived cytokines[J]. Annu Rev Immunol, 1992, 10: 385-409.

10Wallis RS, Ellner JJ. Cytokines and tuberculosis[J]. J Leukoc Biol,

1994, 55(5): 676-681.

11Gesser B, Leffers H, Jinquan T, et al. Identification of functional domains on human interleukin 10[J]. Proc Natl Acad Sci U S A 1997, 94(26): 14620-14625.

12de Waal Malefyt R, Abrams J, Bennett B, et al. Interleukin 10(IL-10) inhibits cytokine synthesis by human monocytes: an autoregulatory role of IL-10 produced by monocytes[J]. J Exp Med, 1991, 174(5): 1209-1220.

13Cohen SB, Crawley JB, Kahan MC, et al. Interleukin-10 rescues T cells from apoptotic cell death: association with an upregulation of Bcl-2[J]. Immunology, 1997, 92(1): 1-5.

14Akdis CA, Joss A, Akdis M, et al. A molecular basis for T cell suppression by IL-10: CD28-associated IL-10 receptor inhibits CD28 tyrosine phosphorylation and phosphatidylinositol 3-kinase binding[J]. Faseb J, 2000, 14(12): 1666-1668.

15Turner J, Gonzalez-Juarrero M, Ellis DL, et al. In vivo IL-10 production reactivates chronic pulmonary tuberculosis in C57BL/6 mice[J]. J Immunol, 2002, 169(11): 6343-6351.

16Bellamy R. Susceptibility to mycobacterial infections: the importance of host genetics[J]. Genes Immun, 2003, 4(1): 4-11.

17Fitness J, Floyd S, Warndorff DK, et al. Large-scale candidate gene study of tuberculosis susceptibility in the Karonga district of northern Malawi[J]. Am J Trop Med Hyg, 2004, 71(3): 341-349.

18Scola L, Crivello A, Marino V, et al. IL-10 and TNF-alpha polymorphisms in a sample of Sicilian patients affected by tuberculosis: implication for ageing and life span expectancy[J]. Mech Ageing Dev, 2003, 124(4): 569-572.

19Delgado JC, Baena A, Thim S, et al. Ethnic-specific genetic associations with pulmonary tuberculosis[J]. J Infect Dis, 2002, 186(10): 1463-1468.

20Shin HD, Park BL, Kim YH, et al. Common interleukin 10 polymorphism associated with decreased risk of tuberculosis[J]. Exp Mol Med, 2005, 37(2): 128-132.

21Thye T, Browne EN, Chinbuah MA, et al. IL10 haplotype associated with tuberculin skin test response but not with pulmonary TB[J]. PLoS One, 2009, 4(5): e5420.

22Tso HW, Ip WK, Chong WP, et al. Association of interferon gamma and interleukin 10 genes with tuberculosis in Hong Kong Chinese[J]. Genes Immun, 2005, 6(4): 358-363.

(本文編輯：王亞南)

譚國(guó)超，徐春娟，馬紀(jì)龍，等. 我國(guó)西部漢族人IL-10基因多態(tài)性與肺結(jié)核易感性的相關(guān)性研究[J/CD]. 中華肺部疾病雜志： 電子版， 2015， 9(1)： 56-59.

Association Analysis of IL-10 Gene Polymorphisms with Tuberculosis SusceptibilityTanGuochao1,XuChunjuan1,MaJilong1,BianJing1,WenYu1,LaiLiwei1,ZhangFangqi2,ChengJiajun2(1TheThirdHospitalofPLAShibaheBranch,Baoji721006,China,2DepartmentofRespiratoryandCriticalCareMedicine,XijingHospitaloftheFourthMilitaryMedicalUniversity,Xi′an710032,China)

【Abstract】ObjectiveTo explore the association of tuberculosis susceptibility with IL-10 gene polymorphisms and to provide reference for early warning of tuberculosis. Methods147 tuberculosis patients and 209 healthy individuals were enrolled. χ2 test, T test and HWE test were conducted to examine the study populations, then the association between gene polymorphisms and tuberculosis susceptibility was analyzed. ResultsSample balance test showed all of the cases in two groups were no statistical difference in sex(P=0.575) and age(P=0.840). Genotyping detection rate was 99.7%. Hardy Weinberg equilibrium detection showed the individual in control was conformed to the laws of genetics(P=0.137, 0.311). The genotype frequencies of IL-10_2 849 polymorphism between case and control were not statistically significant (P=0.901). While the difference of IL-10_1 082 polymorphism between case and control was identified (P=0.032). G is a risk alleles (OR=1.55, 95%CI 1.10-2.19). Conclusions-1 082 polymorphism of IL-10 gene is associated with tuberculosis susceptibility of northwest Han Chinese, which may be helpful for the early warning of tuberculosis.

【Key words】Tuberculosis;Interleukin-10;Single Nucleotide Polymorphism

(收稿日期：2015-04-08)

Corresponding author：Tan Guochao, Email: tgcbj147@163.com

中圖法分類號(hào)：R562

文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A

通訊作者：譚國(guó)超，Email: tgcbj147@163.com

DOI：10.3877/cma.j.issn.1674-6902.2016.01.013

710032 西安，第四軍醫(yī)大學(xué)西京醫(yī)院呼吸與危重癥醫(yī)學(xué)科2