大負(fù)荷運(yùn)動(dòng)對大鼠骨骼肌線粒體融合和分裂蛋白的影響

劉曉然　于　瀅　王蘊(yùn)紅　閻守扶　王瑞元　李俊平

摘要：觀察大負(fù)荷運(yùn)動(dòng)后不同時(shí)間點(diǎn)骨骼肌線粒體融合與分裂蛋白的變化，分析與探究線粒體融合與分裂之間的關(guān)系及其生理意義。方法：56只SD大鼠經(jīng)適應(yīng)后分安靜對照組（8只）和運(yùn)動(dòng)組（48只），運(yùn)動(dòng)模型為一次中大強(qiáng)度離心跑臺(tái)運(yùn)動(dòng)，-16°，20 m/min，90 min。運(yùn)動(dòng)大鼠分別在運(yùn)動(dòng)后即刻、6 h、12 h、24 h、48 h和72 h（各時(shí)間點(diǎn)8只）取比目魚肌。Western blotting方法分析骨骼肌Mfn1、Mfn2、Opa1、Fis1和Drp1的蛋白表達(dá)。結(jié)果：Mfn1蛋白在運(yùn)動(dòng)后即刻表達(dá)升高，而后降低，72 h為最低點(diǎn)；Mfn2蛋白在運(yùn)動(dòng)后呈先降后升的變化趨勢；Opa1蛋白在運(yùn)動(dòng)后表達(dá)先降低后升高，24 h為最高點(diǎn)，而后逐漸降低；Drp1蛋白在運(yùn)動(dòng)后表達(dá)升高，6 h出現(xiàn)高峰，而后逐漸降低；Fis1蛋白在運(yùn)動(dòng)后表達(dá)升高，12 h為最高點(diǎn)，而后在48 h和72 h表達(dá)降低。結(jié)論：一次大負(fù)荷運(yùn)動(dòng)后大鼠骨骼肌線粒體融合、分裂失衡，主要表現(xiàn)為線粒體分裂增強(qiáng)、線粒體融合抑制；而在運(yùn)動(dòng)恢復(fù)期，骨骼肌線粒體融合、分裂之間重塑平衡狀態(tài)。

關(guān)鍵詞： 大負(fù)荷運(yùn)動(dòng)；骨骼??；線粒體；動(dòng)力學(xué)；融合；分裂

中圖分類號(hào)： G 804文章編號(hào)：1009783X（2016）02016705文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A

Abstract：The purpose of this study was to investigate the changes of mitochondrial fusion and fission in skeletal muscle induced by highload exercise，and to analyze the relations of mitochondrial fusion and fission.Methods：56 SD rats were divided into two groups：control group （8） and exercise group （48）.The rats should run on the treadmill，16 °，20m / min，90 minutes.The soleus were taken after exercise immediately，6 hours，12 hours，24 hours，48 hours and 72hours from the rats in exercise groups.WB was used to detect the protein expressions of Mfn1，Mfn2，Opa1，F(xiàn)is1 and Drp1.Results：The expression of Mfn1 protein increased after the exercise，and then decreased gradually.And the lowest appeared at 72hour after the exercise.There were not remarkable changes of the expression of Mfn2 protein.The expression of Opa1 protein decreased after the exercise，and then increased gradually.And the highest appeared at 24hour after the exercise.The expression of Fis1 protein increased after the exercise，and the peak was at 12hour.But the expressions decreased at 48hour and 72hour after the exercise.Conclusion：A bout of highload exercise leads to imbalanced mitochondrial fission and fusion in skeletal muscle，shown by the enhanced mitochondrial fission and the declined mitochondrial fusion.And the balance of mitochondrial fusion and fission rebuilds after the exercise.

Keywords：highload exercise；skeletal muscle；mitochondria；dynamics；fusion；fission

生物體的很多生命活動(dòng)，例如細(xì)胞能量代謝、發(fā)育和凋亡等，都與線粒體繁復(fù)的網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)有著密切的關(guān)系。線粒體是一種高度動(dòng)態(tài)的細(xì)胞器，其形態(tài)時(shí)刻都處于變化中。它通過不斷的融合分裂，使其形態(tài)、分布、數(shù)量等都發(fā)生著改變，進(jìn)而通過其氧化磷酸化產(chǎn)生ATP以適應(yīng)運(yùn)動(dòng)過程能量需求的變化[1]。線粒體融合和分裂的動(dòng)態(tài)過程通常被稱為線粒體動(dòng)力學(xué)（mitochondrial dynamics），它對細(xì)胞能量代謝和收縮功能的維持起著至關(guān)重要的作用[2]。

現(xiàn)已發(fā)現(xiàn)一些線粒體動(dòng)力學(xué)相關(guān)蛋白參與線粒體融合、分裂的精細(xì)調(diào)控。參與線粒體融合的蛋白主要包括線粒體融合蛋白1/2（Mfn1/2，mitofusin1/2）和視神經(jīng)萎縮相關(guān)蛋白1（optic atrophy1，Opa1）。Mfn1和Mfn2位于線粒體外膜，主要調(diào)節(jié)線粒體外膜的融合；Opa1 主要調(diào)節(jié)線粒體內(nèi)膜的融合。線粒體分裂相關(guān)蛋白則包括動(dòng)力相關(guān)蛋白1（dynaminrelated protein 1，Drp1）和分裂蛋白1（fission protein1，F(xiàn)is1）。兩者共同參與線粒體外膜的分裂程序。

目前，大量研究發(fā)現(xiàn)，適應(yīng)強(qiáng)度的運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練可降低骨骼肌線粒體分裂蛋白的激活，線粒體融合趨向增強(qiáng)[3]，而關(guān)于大負(fù)荷強(qiáng)度運(yùn)動(dòng)對線粒體融合分裂的調(diào)控尚未見報(bào)道。本課題組在前期研究中已發(fā)現(xiàn)，大負(fù)荷運(yùn)動(dòng)可導(dǎo)致骨骼肌線粒體在形態(tài)結(jié)構(gòu)和功能上均有一定程度的損傷[4]，而線粒體形態(tài)結(jié)構(gòu)和功能與線粒體融合、分裂之間的聯(lián)系密不可分；故本研究以骨骼肌線粒體動(dòng)力學(xué)為研究視角，建立大鼠大負(fù)荷運(yùn)動(dòng)模型，觀察一次運(yùn)動(dòng)后不同時(shí)間點(diǎn)線粒體融合蛋白（Mfn1、Mfn2和Opa1）、分裂蛋白（Drp1和Fis1）的表達(dá)變化，分析線粒體融合、分裂之間的關(guān)系及其生理意義，從而為探究大負(fù)荷運(yùn)動(dòng)導(dǎo)致的骨骼肌線粒體功能損傷提供更豐富的理論支持。

1材料（對象）與方法

1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物與分組

雄性SD大鼠56只，SPF級(jí)，體重（196.16±6.96）g，由北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司提供，在北京體育大學(xué)科研實(shí)驗(yàn)中心小動(dòng)物房內(nèi)進(jìn)行飼養(yǎng)和運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練。分籠飼養(yǎng)，自由飲食和飲水，室溫（22±2）℃，相對濕度30%～60%，12 h光照/12 h熄燈模擬日晝交替。

根據(jù)運(yùn)動(dòng)后不同時(shí)間點(diǎn)，將實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分為7個(gè)組別，即安靜對照組（NC）、運(yùn)動(dòng)后即刻組（Ep0 h）、運(yùn)動(dòng)后6 h組（Ep6 h）、運(yùn)動(dòng)后12 h組（Ep12 h）、運(yùn)動(dòng)后24 h組（Ep24 h）、運(yùn)動(dòng)后48 h組（Ep48 h）和運(yùn)動(dòng)后72 h組（Ep72 h），每組8只，見表1。

1.2運(yùn)動(dòng)模型的建立

運(yùn)動(dòng)模型為一次中大強(qiáng)度離心跑臺(tái)運(yùn)動(dòng)，正式實(shí)驗(yàn)前對運(yùn)動(dòng)組大鼠進(jìn)行適應(yīng)性跑臺(tái)訓(xùn)練3 d。第1天坡度0°，16 m/min，10 min；第2天坡度-5°，16 m/min，15 min；第3天坡度-10°，16 m/min，30 min；第4天休息；第5天正式實(shí)驗(yàn)，坡度-16°，20 m/min，90 min。

1.3測試樣本采集與處理

取材時(shí)間點(diǎn)設(shè)置為運(yùn)動(dòng)后的0、6、12、24、48和72 h。取材大鼠經(jīng)腹腔注射2%戊巴比妥鈉（0.25 mL/100 g），腹主動(dòng)脈取血，快速分離出比目魚肌，用錫紙包好，保存于液氮中，取材完成后將樣本全部保存至-80 ℃冰箱備用。

1.4Western blotting檢測

蛋白提?。喝∵m量樣品置于液氮研磨，稱取0.1 g組織，以1∶9加入預(yù)冷的裂解液，勻漿，冰上孵育20 min，4 ℃離心，12 000 r/min，20 min，取上清。

蛋白定量：采用BCA 測試法定量蛋白濃度。

取20 μg總蛋白配制成上樣體系，置95 ℃沸水中 5 min，上樣前離心。配制分離膠10%，以及5%積層膠。積層膠90 V，40 min；分離膠120 V，通過預(yù)染蛋白Marker來確定電泳停止時(shí)間。電泳后采用濕法進(jìn)行蛋白質(zhì)電轉(zhuǎn)印，300 mA，90～120 min。5% BSA封閉液室溫孵育2 h。以5% BSA封閉液稀釋一抗Mfn1（1∶500，abcam公司）、Mfn2（1∶1 000，abcam公司）、Opa1（1∶1 000，abcam公司）、Drp1（1∶10 000，Cell Signaling公司）、Fis1（1∶1 000，abcam公司）和GAPDH（1∶1 000，abcam公司），4 ℃ ，過夜。以5% BSA封閉液稀釋二抗（1∶5 000，中杉金僑公司），室溫孵育2 h。用ECL 發(fā)光試劑與膜在暗室中反應(yīng)、曝光。X光片進(jìn)行掃描后經(jīng)ipp 6.0軟件對目的蛋白質(zhì)進(jìn)行光密度相對定量分析，將每個(gè)條帶與相應(yīng)樣品的GAPDH條帶光密度值進(jìn)行比較，計(jì)算出目的條帶的相對含量值。

1.5數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)法

所有數(shù)據(jù)用SPSS 13.0統(tǒng)計(jì)軟件包處理，數(shù)據(jù)均以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差（X±SD）的形式表示。一次性運(yùn)動(dòng)的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)采用雙因素方差分析（Twoway ANOVA），對處理因素（安靜對照和運(yùn)動(dòng)）和不同的取材時(shí)間因素（運(yùn)動(dòng)后即刻、6、12、24、48和72 h）的主效應(yīng)以及兩者的交互作用進(jìn)行分析。如兩因素交互作用不顯著（P>0.05），則進(jìn)一步建立非飽和模型進(jìn)行分析；如兩因素交互作用顯著，則采用SNKq檢驗(yàn)對不同組別間進(jìn)行比較，并參考Bonferron法與Tukey法的比較結(jié)果。統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性水平定為P<0.05。

2結(jié)果

2.1一次大負(fù)荷運(yùn)動(dòng)對骨骼肌線粒體融合蛋白表達(dá)的影響

2.1.1大負(fù)荷運(yùn)動(dòng)后骨骼肌Mfn1蛋白表達(dá)的變化

實(shí)驗(yàn)結(jié)果（表2，圖1）顯示，骨骼肌Mfn1蛋白表達(dá)在一次大負(fù)荷運(yùn)動(dòng)后即刻顯著升高了47.39%（P<0.05），運(yùn)動(dòng)后6、12、24、48 h蛋白表達(dá)均無明顯變化，但在運(yùn)動(dòng)后72 h Mfn1表達(dá)顯著降低了29.73%（P<0.05）。

2.1.2大負(fù)荷運(yùn)動(dòng)后骨骼肌Mfn2蛋白表達(dá)的變化

實(shí)驗(yàn)結(jié)果（表2，圖2）所示，骨骼肌Mfn2蛋白表達(dá)在一次大負(fù)荷運(yùn)動(dòng)后即刻有下降趨勢，而在運(yùn)動(dòng)后6、12、24 h蛋白表達(dá)卻有升高趨勢，運(yùn)動(dòng)后48 h和72 hMfn2表達(dá)已基本降至安靜對照水平。

2.1.3大負(fù)荷運(yùn)動(dòng)后骨骼肌Opa1蛋白表達(dá)的變化

實(shí)驗(yàn)結(jié)果（表2，圖3）顯示，骨骼肌Opa1蛋白表達(dá)在一次大負(fù)荷運(yùn)動(dòng)后即刻、6 h和12 h無明顯變化，但在運(yùn)動(dòng)后24 h蛋白表達(dá)顯著升高了62.49%（P<0.05），而運(yùn)動(dòng)后48 h和72 hOpa1表達(dá)已基本降至安靜對照水平。

2.2一次大負(fù)荷運(yùn)動(dòng)對骨骼肌線粒體分裂蛋白表達(dá)的影響

2.2.1大負(fù)荷運(yùn)動(dòng)后骨骼肌Drp1蛋白表達(dá)的變化

實(shí)驗(yàn)結(jié)果（表3，圖4）顯示，骨骼肌Drp1蛋白表達(dá)在一次大負(fù)荷運(yùn)動(dòng)后即刻有升高趨勢，并在運(yùn)動(dòng)后6 h顯著升高36.73%（P<0.05），但在運(yùn)動(dòng)后12 h、24 h、48 h和72 hDrp1蛋白均無明顯變化。

2.2.2大負(fù)荷運(yùn)動(dòng)后骨骼肌Fis1蛋白表達(dá)的變化

實(shí)驗(yàn)結(jié)果（表3，圖5）顯示，骨骼肌Fis1蛋白表達(dá)在一次大負(fù)荷運(yùn)動(dòng)后即刻和6 h有升高趨勢，并在運(yùn)動(dòng)后12 h顯著升高了33.45%（P<0.05），在運(yùn)動(dòng)后48 h和72 hFis1表達(dá)分別顯著降低了33.06%（P<0.05）和42.61%（P<0.05）。

3討論

3.1運(yùn)動(dòng)與骨骼肌線粒體融合

線粒體融合是一個(gè)復(fù)雜的生物過程，主要步驟包括：錨定、外膜融合、內(nèi)膜融合和基質(zhì)融合。Mfn1、Mfn2和Opa1在線粒體融合中發(fā)揮著各自的作用，且三者之間也存在著相互作用。Mfn1和Mfn2主要調(diào)節(jié)線粒體外膜的融合。Koshiba等[5]和Pich等[6]的研究發(fā)現(xiàn)：Mfn1和Mfn2的C端α螺旋區(qū)域可形成同源或異源二聚體，使2個(gè)臨近線粒體相互靠近，從而融合。Opa1主要調(diào)節(jié)線粒體內(nèi)膜的融合。Opa1常以溶解形式定位于線粒體膜間隙或貼附于線粒體內(nèi)膜，介導(dǎo)線粒體內(nèi)膜的融合，而且其促融合作用依賴于Mfn1的參與[7]。

各種不同的生理刺激，例如冷環(huán)境暴露[8]、運(yùn)動(dòng)[910]和限制進(jìn)食[11]等都可誘發(fā)線粒體動(dòng)力學(xué)的改變。Mfn1/2表達(dá)上調(diào)可引起線粒體融合，使之趨于網(wǎng)絡(luò)化，而抑制Mfn1/2表達(dá)，線粒體則由網(wǎng)絡(luò)化趨向于分裂成單個(gè)線粒體[7]。Ngoh等[12]發(fā)現(xiàn)，誘導(dǎo)小鼠心肌Mfn2基因沉默可導(dǎo)致線粒體碎片化。Chen等[13]將H9C2細(xì)胞采用局部缺血的方式處理后可引起Opa1蛋白丟失，致線粒體片斷化。

本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，骨骼肌Mfn2和Opa1蛋白表達(dá)在運(yùn)動(dòng)后即刻均有表達(dá)下調(diào)的趨勢。這說明，一次大負(fù)荷運(yùn)動(dòng)可能會(huì)導(dǎo)致骨骼肌線粒體融合抑制。Picard等[9]的研究報(bào)道，C57小鼠經(jīng)過3 h轉(zhuǎn)輪跑后趾長伸肌、紅腓腸肌和白腓腸肌的Mfn2和Opa1的蛋白表達(dá)均降低。孫衛(wèi)東等[14]的實(shí)驗(yàn)也觀察到大鼠骨骼肌線粒體Mfn2基因表達(dá)在一次急性運(yùn)動(dòng)過程中逐漸降低。實(shí)驗(yàn)中還觀察到，Mfn1蛋白表達(dá)在運(yùn)動(dòng)后即刻顯著升高了47.39%，有悖于Mfn2和Opa1的變化。Picard等檢測比目魚肌時(shí)也觀察到Mfn2和Opa1的高表達(dá)[9]。究其可能原因，一是與比目魚肌以慢氧化型肌纖維類型為主有關(guān)，二是骨骼肌中Mfn2蛋白水平較高[15]，故Mfn1蛋白需大量表達(dá)才能與Mfn2形成二聚體結(jié)構(gòu)。

在實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)運(yùn)動(dòng)后6、12和24 h，Mfn1、Mfn2和Opa1蛋白均有不同程度的表達(dá)上調(diào)，其中Opa1在運(yùn)動(dòng)后24 h顯著升高了62.49%，說明骨骼肌線粒體已處于恢復(fù)狀態(tài)，趨向于線粒體融合。Cartoni等[16]的研究認(rèn)為，人體在運(yùn)動(dòng)鍛煉24 h后骨骼肌細(xì)胞內(nèi)Mfn1、Mfn2的mRNA表達(dá)顯著上升。漆正堂等[17]的實(shí)驗(yàn)結(jié)果說明，大強(qiáng)度間歇性運(yùn)動(dòng)后24 h Mfn2基因轉(zhuǎn)錄和蛋白表達(dá)水平均升高。而陶小平等[18]在實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，一次定量大負(fù)荷運(yùn)動(dòng)后30、70和110 min Mfn2基因和蛋白表達(dá)均有不同程度的下降，而運(yùn)動(dòng)后110 min能基本恢復(fù)。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，運(yùn)動(dòng)后48 h和72 h Mfn2和Opa1蛋白表達(dá)均已恢復(fù)至安靜對照水平。運(yùn)動(dòng)負(fù)荷的大小與骨骼肌線粒體融合抑制程度呈正相關(guān)。

3.2運(yùn)動(dòng)與骨骼肌線粒體分裂

線粒體分裂是一個(gè)在進(jìn)化中高度保守[19]的由一系列蛋白精確調(diào)控的復(fù)雜生物過程。受線粒體外膜分子Fis的趨化，Drp1從胞質(zhì)轉(zhuǎn)位至線粒體外膜，并富集于潛在的分裂位點(diǎn)，圍繞線粒體形成指環(huán)結(jié)構(gòu)，并通過水解GTP改變分子間的距離或角度，逐漸壓縮直至線粒體斷裂，產(chǎn)生2個(gè)獨(dú)立的線粒體。有研究發(fā)現(xiàn)線粒體分裂蛋白Drp1的突變可導(dǎo)致線粒體變長，抑制Drp1的表達(dá)可導(dǎo)致線粒體融合增強(qiáng)[19]。Smirnova等[20]發(fā)現(xiàn)Drp1突變體的過表達(dá)導(dǎo)致了核周圍簇狀線粒體的產(chǎn)生，并增加了線粒體間的連通性。Toshiyuki等[21]研究觀察到線粒體分裂蛋白Fis1和Drp1的沉默，可使3T3-L1前體脂肪細(xì)胞中的甘油三酯濃度下降，線粒體中Mfn 2和Opa1沉默，可提高甘油三酯濃度；同時(shí)還觀察到線粒體出現(xiàn)片段化，而且，Ashrafian等[22]研究發(fā)現(xiàn)，Drp1基因半敲除的小鼠心肌線粒體數(shù)量減少，ATP缺失。

本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，骨骼肌Drp1蛋白在運(yùn)動(dòng)后6 h表達(dá)顯著增加了36.73%，F(xiàn)is1蛋白在運(yùn)動(dòng)后12 h表達(dá)也顯著增加了33.45%。這說明，一次大負(fù)荷運(yùn)動(dòng)后可能會(huì)誘導(dǎo)骨骼肌線粒體趨向分裂。劉慧君等[23]的實(shí)驗(yàn)表明，以中等強(qiáng)度分別運(yùn)動(dòng)60 min和90 min，大鼠骨骼肌線粒體分裂蛋白Drp1 mRNA及蛋白表達(dá)較安靜組顯著升高，而且Drp1和Fis1蛋白的表達(dá)峰值分別出現(xiàn)在運(yùn)動(dòng)后6 min和12 min。從蛋白表達(dá)峰值的時(shí)序性上觀察，Mfn1/2和Opa1蛋白表達(dá)也是在運(yùn)動(dòng)后6 min或12 min出現(xiàn)低點(diǎn)。數(shù)據(jù)清晰地表明，線粒體融合蛋白Mfn1/2和Opa1蛋白和分裂蛋白Drp1和Fis1蛋白表達(dá)呈現(xiàn)相反的動(dòng)態(tài)變化。

在實(shí)驗(yàn)中還觀察到，Drp1蛋白和Fis1蛋白在運(yùn)動(dòng)后24 h已基本恢復(fù)到安靜對照水平，這與Ding的實(shí)驗(yàn)結(jié)果一致，F(xiàn)is1的轉(zhuǎn)錄水平和蛋白含量在運(yùn)動(dòng)進(jìn)行至120～150 min時(shí)均明顯增加，且持續(xù)到整個(gè)恢復(fù)期直至運(yùn)動(dòng)后24 h[24]，而且，在運(yùn)動(dòng)后48 h和72 h，Drp1蛋白有明顯的表達(dá)下調(diào)趨勢，F(xiàn)is1蛋白表達(dá)分別顯著降低了33.06%和42.61%。由此說明在運(yùn)動(dòng)后48～72 h，骨骼肌線粒體動(dòng)力學(xué)趨于融合，在線粒體融合和分裂之間重塑平衡。

4結(jié)論

1）一次大負(fù)荷運(yùn)動(dòng)后大鼠骨骼肌線粒體融合、分裂失衡，主要表現(xiàn)為線粒體分裂增強(qiáng)、線粒體融合抑制，而在運(yùn)動(dòng)恢復(fù)期，骨骼肌線粒體融合、分裂之間重塑平衡狀態(tài)。

2）線粒體動(dòng)力學(xué)是線粒體運(yùn)動(dòng)適應(yīng)的一種早期機(jī)制，線粒體融合、分裂參與了細(xì)胞對能量需求的快速應(yīng)答。一次大負(fù)荷運(yùn)動(dòng)干擾了骨骼肌線粒體動(dòng)力學(xué)平衡，可能導(dǎo)致線粒體功能降低，骨骼肌能量代謝障礙。

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