乳酸桿菌S-層蛋白的結(jié)構(gòu)及免疫調(diào)控功能研究進(jìn)展

張英春，向鑫玲，張?zhí)m威，馬 放，李少慧

（1.哈爾濱工業(yè)大學(xué)化工學(xué)院，黑龍江 哈爾濱 150090；2.哈爾濱工業(yè)大學(xué)市政環(huán)境工程學(xué)院，黑龍江 哈爾濱 150090）

乳酸桿菌S-層蛋白的結(jié)構(gòu)及免疫調(diào)控功能研究進(jìn)展

張英春1,2，向鑫玲1，張?zhí)m威1，馬 放2，李少慧1

（1.哈爾濱工業(yè)大學(xué)化工學(xué)院，黑龍江 哈爾濱 150090；2.哈爾濱工業(yè)大學(xué)市政環(huán)境工程學(xué)院，黑龍江 哈爾濱 150090）

本文綜述了乳酸桿菌S-層蛋白的結(jié)構(gòu)及功能，包括S-層蛋白對(duì)膽鹽及消化酶的耐受能力、參與乳酸桿菌對(duì)宿主的黏附作用、抑制病原菌對(duì)宿主細(xì)胞的黏附及侵入作用。并且詳細(xì)闡述了S-層蛋白對(duì)細(xì)胞信號(hào)通路的調(diào)節(jié)功能，證明S-層蛋白對(duì)于乳酸桿菌發(fā)揮免疫調(diào)節(jié)功能具有重要的作用。

乳酸桿菌；S-層蛋白；信號(hào)通路；免疫調(diào)節(jié)

S-層蛋白是古細(xì)菌和某些細(xì)菌表面的一種蛋白成分。在乳酸菌中，目前僅證實(shí)乳酸桿菌的細(xì)胞壁外存在S-層蛋白[1]。乳酸桿菌S-層蛋白由于其黏附作用、抑制病原菌及非致病性的特性，使得其在口服型活性疫苗中表現(xiàn)出潛在的應(yīng)用價(jià)值[2]。國(guó)內(nèi)外對(duì)乳酸桿菌S-層蛋白功能的研究已經(jīng)逐漸興起，使得它在生物技術(shù)、納米科技和生物醫(yī)藥方面展現(xiàn)了巨大的應(yīng)用前景[3]。但目前對(duì)乳酸桿菌S-層蛋白生理功能的具體作用機(jī)制仍不明確。許多研究已表明乳酸桿菌具有調(diào)節(jié)人體免疫系統(tǒng)功能的作用，并且這種調(diào)節(jié)作用與S-層蛋白具有一定的關(guān)系，所以需對(duì)S-層蛋白的免疫調(diào)節(jié)功能進(jìn)行深入研究，以便進(jìn)一步闡明乳酸桿菌的益生功能。

1 乳酸桿菌S-層蛋白的結(jié)構(gòu)

乳酸桿菌的S-層蛋白是由蛋白質(zhì)或者糖蛋白亞基組成，呈規(guī)則的晶狀排列，其晶格有傾斜形、正方形和六角形3 種。S-層蛋白能夠整個(gè)覆蓋細(xì)胞表面的固態(tài)表層，厚度通常為5～15 nm[4]，分子質(zhì)量一般為40～200 kD，占據(jù)了細(xì)胞總蛋白含量的10%～15%[5]。乳酸桿菌表面蛋白均為堿性蛋白，這是乳酸桿菌獨(dú)有的特性。S-層蛋白含有大量疏水性氨基酸，占總氨基酸含量的31.9%～38.7%。正是因?yàn)楦吆康氖杷园被?，S-層蛋白才不會(huì)被水等溶劑溶解，這是S-層蛋白自動(dòng)聚集性的基礎(chǔ)[6]。帶負(fù)電氨基酸與帶正電氨基酸的比值為7.0∶12.3～4.3∶7.0，其高含量的帶正電氨基酸也是乳酸桿菌S-層蛋白所特有的。目前已證實(shí)的乳酸桿菌細(xì)胞壁外存在S-層蛋白的菌株有：嗜酸乳酸桿菌（L. acidophilus）、卷曲乳酸桿菌（L. crispatus）、短乳酸桿菌（L. brevis）、布氏乳酸桿菌（L. buchneri）、雞乳酸桿菌（L. gallinarum）、瑞士乳酸桿菌（L. helveticus）、發(fā)酵乳酸桿菌（L. fermentum）、高加索奶乳酸桿菌（L. kefir）、嗜淀粉乳酸桿菌（L. amylovorus）、約氏乳酸桿菌（L. johnsonii）、格氏乳酸桿菌（L. gasseri）、干酪乳酸桿菌（L. casei）、類高加索乳酸桿菌（L. parakefi r）共13 種。

乳酸桿菌S-層蛋白的一級(jí)結(jié)構(gòu)具有高變性，同一菌株中的S-層蛋白的氨基酸序列也可能不同[7]。乳酸桿菌S-層蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)，平均由20%的α-螺旋和40%的β-折疊區(qū)域構(gòu)成，5%～45%以β-轉(zhuǎn)角和無(wú)規(guī)卷曲排列[8]。S-層蛋白的亞基通過(guò)非共價(jià)鍵相互連接，且通過(guò)非共價(jià)鍵與宿主表面連接[9]。乳酸桿菌S-層蛋白的同源性主要集中于C端，該區(qū)域主要負(fù)責(zé)蛋白對(duì)細(xì)胞外膜的錨定作用，而N端的區(qū)域主要與蛋白的自身組裝及對(duì)細(xì)胞的黏附作用相關(guān)，變異概率較大[10]。雖然鑒定發(fā)現(xiàn)S-層蛋白具有多糖結(jié)構(gòu)，但乳酸桿菌中的多數(shù)S-層蛋白并沒(méi)有糖基化，目前只發(fā)現(xiàn)L. buchneri和L. kefi r的表層帶有糖鏈[7]。

許多乳酸桿菌基因組中編碼S-層蛋白的基因都已經(jīng)被發(fā)現(xiàn)，乳酸桿菌都具有多個(gè)S-層蛋白基因，但并不是所有的基因都同時(shí)表達(dá)。L. acidophilus有S-層蛋白A（S-layer protein A，SlpA）和S-層蛋白B（S-layer protein B，SlpB）2 個(gè)基因編碼S-層蛋白，L. brevis具有SlpB、SlpC、SlpD共3 個(gè)編碼S-層蛋白的基因[11]。同一菌株可編碼不同的S-層蛋白，同種乳酸桿菌S-層蛋白基因相似度非常高，并且不同種菌株間相似度也較高。

2 乳酸桿菌S-層蛋白的功能

2.1 S-層蛋白對(duì)膽 鹽及消化酶的耐受能力

乳酸桿菌是人和動(dòng)物胃腸道中的正常菌群，在腸道中存活的數(shù)量越多、定殖的時(shí)間越長(zhǎng)，對(duì)人及動(dòng)物的健康就會(huì)越有利。同時(shí)，存活數(shù)量和定殖時(shí)間也是評(píng)價(jià)益生菌的重要指標(biāo)之一。因此，乳酸桿菌是否能夠克服消化道中的物理和化學(xué)因素的影響，對(duì)胃、腸液具有良好的耐受特性，是發(fā)揮益生功效的前提。S-層蛋白位于乳酸桿菌的表面，對(duì)保護(hù)乳酸桿菌菌體免受外界環(huán)境的侵害具有重要作用。胡斌等[12]分別用pH 2.0的鹽酸溶液和含質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.3%的膽鹽的乳酸細(xì)菌培養(yǎng)基（MRS）來(lái)模擬胃酸環(huán)境和膽汁環(huán)境，測(cè)定L. acidophilus NCFM的存活率。實(shí)驗(yàn)先用5 mol/L LiCl溶液除去菌體的S-層蛋白，在一定的培養(yǎng)條件下使S-層蛋白再生，每4 h取樣進(jìn)行菌體的耐酸性和耐膽鹽測(cè)試。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，0～8 h期間，S-層蛋白的再生能夠使菌體在酸處理的條件下，存活率由52.5%升至85.9%；在膽鹽處理?xiàng)l件下，存活率由43.4%升至81.8%。結(jié)果表明，隨著S-層蛋白的再生，L. acidophilus NCFM的耐酸和耐膽鹽能力不斷提高，說(shuō)明S-層蛋白能夠增強(qiáng)菌體對(duì)酸和膽鹽的耐受能力。肖榮等[13]通過(guò)胰蛋白酶和胃蛋白酶模擬胃腸道的環(huán)境，測(cè)定L. brevis M8菌株S-層蛋白的耐受能力，通過(guò)十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（sodium dodecyl sulfatepolyacrylamide gelelectrophoresis，SDS-PAGE）進(jìn)行分析，結(jié)果表明S-層蛋白有少部分降解，但大量的S-層蛋白不被消化。Meng Jun等[14]用胃蛋白酶及胰酶與膽鹽的混合物模擬消化環(huán)境，分別檢測(cè)L. helveticus fb213、L. acidophilus fb116、L. acidophilus fb214完整的菌體及除去S-層蛋白的菌體的存活率。結(jié)果表明：經(jīng)模擬胃液處理了菌株，除去S-層蛋白的乳酸桿菌的存活率降低了104～105個(gè)數(shù)量級(jí)。但是，完整的乳酸桿菌其數(shù)量級(jí)僅降低了101～101.5個(gè)數(shù)量級(jí)；經(jīng)模擬腸液處理的菌株，除去S-層蛋白的乳酸桿菌的存活率降低104～105個(gè)數(shù)量級(jí)，完整的乳酸桿菌存活率僅降低102～103個(gè)數(shù)量級(jí)。以上結(jié)果均表明，S-層蛋白位于乳酸桿菌的表面，能夠形成生理屏障，抵抗胃腸液對(duì)菌體的破壞，有助于乳酸桿菌在腸道中的生長(zhǎng)繁殖并發(fā)揮益生功能。

2.2 S-層蛋白參與乳酸桿菌對(duì)宿主的黏附作用

乳酸桿菌對(duì)腸道表面的黏附能力是在消化道中長(zhǎng)期存在的必要條件，也是評(píng)價(jià)乳酸桿菌益生功能的重要指標(biāo)之一。乳酸桿菌對(duì)宿主的黏附過(guò)程共2 步：第1步是非特異性黏附，主要通過(guò)疏水作用力、靜電相互作用力、氫鍵等來(lái)實(shí)現(xiàn)。其中，疏水作用力和靜電作用力是主要作用力；第2步是特異性黏附，菌體細(xì)胞上的特異性配體進(jìn)一步與宿主細(xì)胞相應(yīng)的受體特異性結(jié)合，使菌株黏附于宿主細(xì)胞。

研究表明，乳酸桿菌與宿主的相互作用主要與菌體的S-層蛋白有關(guān)。陳臣等[15]利用熒光標(biāo)記法來(lái)檢測(cè)L. plantarum ST-Ⅲ對(duì)Caco-2細(xì)胞的黏附機(jī)理，利用化學(xué)法或酶法去除乳酸桿菌的S-層蛋白，進(jìn)行黏附性實(shí)驗(yàn)。結(jié)果表明，去除S-層蛋白的L. plantarum ST-Ⅲ對(duì)Caco-2細(xì)胞的黏附能力顯著降低，利用表面蛋白結(jié)合能力的可逆性，將除去S-層蛋白的菌體與提取的表面蛋白進(jìn)行孵育，再進(jìn)行黏附性實(shí)驗(yàn)，黏附率從4.82%提高至8.46%。結(jié)果驗(yàn)證了S-層蛋白具有可逆地結(jié)合到細(xì)胞壁的能力，同時(shí)證明了表面蛋白參與黏附過(guò)程。

乳酸桿菌與宿主細(xì)胞的相互作用主要是表面的S-層蛋白黏附于腸上皮細(xì)胞的細(xì)胞外基質(zhì)，這些細(xì)胞外基質(zhì)包括糖蛋白（如纖連蛋白和層黏連蛋白）或是膠原。Leeuw等[16]通過(guò)表面離子共振的方法進(jìn)行研究，L. brevis ATCC8287的S-層蛋白表現(xiàn)出對(duì)纖連蛋白和層黏連蛋白高度的親和力，而對(duì)纖維蛋白原和膠原的親和能力相對(duì)較低。其中，S-層蛋白對(duì)纖連蛋白的親和力是層黏連蛋白的3 倍，而二者比對(duì)纖維蛋白原和膠原的親和力要高出3 個(gè)數(shù)量級(jí)。研究表明，S-層蛋白與纖連蛋白的連接能力與位于S-層蛋白N末端的一個(gè)含81 個(gè)氨基酸的區(qū)域有關(guān)，這段區(qū)域能夠使沒(méi)有黏附能力的細(xì)菌黏附于人的腸上皮細(xì)胞，這個(gè)區(qū)域的功能與完整的S-層蛋白相似[17]。2.3 S-層蛋白抑制病原菌對(duì)宿主細(xì)胞的黏附及侵入作用

黏附是病原菌入侵宿主細(xì)胞的先決條件之一，病原菌通過(guò)黏附、定殖到宿主細(xì)胞后發(fā)揮一系列致病作用。致病菌黏附到腸上皮細(xì)胞的機(jī)制之一是和腸上皮細(xì)胞表面分子的受體結(jié)合，而益生菌在黏附位點(diǎn)的占據(jù)則會(huì)抑制病原菌的入侵[18]。乳酸桿菌的S-層蛋白對(duì)抑制病原菌的入侵和黏附具有重要的作用，其抑菌機(jī)制，有的研究認(rèn)為S-層蛋白能夠與宿主腸上皮細(xì)胞的受體相互作用，因而封鎖了腸細(xì)胞表面的受體位點(diǎn)，抑制了病原菌的黏附[19]，也有研究表明S-層蛋白能與病原菌表面的特異性位點(diǎn)直接相互作用，從而修改或者掩蓋了病原菌黏附和入侵人腸細(xì)胞所必需的表面物質(zhì)[20]。

乳酸桿菌的S-層蛋白對(duì)多種腸道致病菌黏附或入侵宿主細(xì)胞均有拮抗作用。Ren Dayong等[21]通過(guò)L. salivarius和L. plantarum來(lái)研究表面蛋白對(duì)抑制Staphylococcus aureus黏附于Caco-2細(xì)胞的作用。2 種菌株去除S-層蛋白后，L. salivarius對(duì)病原菌的抑制率由58%降為4%，表明S-層蛋白是該菌表面最重要的黏附因素。而L. plantarum的抑制率仍能保持在42%的較高水平，可能是由于其表面存在著對(duì)病原菌進(jìn)行作用的其他物質(zhì)。進(jìn)一步用純化的S-層蛋白來(lái)研究其抑制病原菌黏附的作用，實(shí)驗(yàn)證明這種抑制作用隨著S-層蛋白濃度的增加而增強(qiáng)。同時(shí)，S-層蛋白的一些特性也使得益生菌具有良好的黏附能力，如高度的疏水性、自動(dòng)聚集性及共聚作用。其中，自動(dòng)聚集性和共聚作用與益生菌的競(jìng)爭(zhēng)性抑制高度相關(guān)[22]。Golowczyc等[23]分別研究了能發(fā)生共聚作用的菌株L. kefir CIDCA8321和不能發(fā)生共聚作用的菌株L. kefir CIDCA83113對(duì)Salmonella的作用，結(jié)果表明，CIDCA8321在抑制Salmonella入侵Caco-2細(xì)胞及TC-7細(xì)胞方面具有顯著的效果，而在CIDCA83113卻未發(fā)現(xiàn)這種作用。并且，將L. kefi r CIDCA83113的S-層蛋白除去后，其對(duì)抑制Salmonella入侵作用的能力顯著降低。這進(jìn)一步證明了S-層蛋白與病原菌的共聚作用能夠掩蓋病原菌細(xì)胞的表面物質(zhì)，從而干擾病原菌的入侵作用，為乳酸桿菌的益生作用提供了可能。

3 乳酸桿菌S-層蛋白的免疫調(diào)控作用

絲裂原活化蛋白激酶（mitogen-acivated protein kinases，MAPK）是細(xì)胞內(nèi)的一類絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶，是真核生物內(nèi)的一類重要的信號(hào)系統(tǒng)。目前已鑒定的MAPK信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路有4 條：細(xì)胞外信號(hào)調(diào)節(jié)激酶（extracellular signal regulated kinase，ERK1/2）、c-Jun氨基末端激酶（c-Jun N-terminal kinases，JNK）、p38MAPK和ERK5[24]。近年來(lái)發(fā)現(xiàn)，MAPK信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑在固有性免疫和獲得性免疫應(yīng)答中起著重要調(diào)節(jié)作用，可以誘導(dǎo)初始CD4＋T細(xì)胞向Th1或Th2分化，從而引發(fā)不同的免疫反應(yīng)[25-26]。自然的進(jìn)化使得病原菌擁有抗衡宿主細(xì)胞固有免疫防御系統(tǒng)的能力，病原菌通過(guò)保守的蛋白分泌系統(tǒng)將效應(yīng)物運(yùn)輸至宿主細(xì)胞，從而影響細(xì)胞的細(xì)胞骨架，并調(diào)節(jié)相關(guān)的信號(hào)通路[27]。大量研究已經(jīng)證實(shí)，伴隨細(xì)菌的黏附或入侵，眾多病原菌如Escherichia coli、Salmonella、Shigella、Listeria monocytogenes等常將MAPK信號(hào)通路作為攻擊目標(biāo)，通過(guò)抑制或激活該信號(hào)通路，增強(qiáng)其自身感染力，同時(shí)也會(huì)引起一系列的細(xì)胞炎癥反應(yīng)[28]。如存在于Shigella的OspF以及Salmonella的SpvC等磷酸化蘇氨酸裂合酶（phosphothreoninelyase），能夠通過(guò)不可逆的去磷酸化作用有效地避免MAPK的再磷酸化，有效地抑制宿主細(xì)胞的固有免疫應(yīng)答，從而有助于病原菌的進(jìn)一步侵染[29-30]。而有些細(xì)菌如Mycobacterium leprae則通過(guò)激活MAPK信號(hào)通路，促進(jìn)細(xì)胞的炎性反應(yīng)，刺激細(xì)胞分泌促炎性細(xì)胞因子[31]。在腸道系統(tǒng)中，促炎性細(xì)胞因子分泌增多會(huì)導(dǎo)致促炎與抑炎平衡被破壞，引起炎癥[32]。有些乳酸桿菌株可刺激免疫系統(tǒng)，并誘導(dǎo)促炎細(xì)胞因子和抗炎細(xì)胞因子的產(chǎn)生，使兩者達(dá)到動(dòng)態(tài)平衡，從而對(duì)炎癥進(jìn)行調(diào)控[33-34]。

乳酸桿菌黏附于樹(shù)突細(xì)胞和胃腸上皮細(xì)胞被認(rèn)為是其定殖于胃腸道并刺激人體進(jìn)行免疫調(diào)節(jié)的重要過(guò)程[35]。而S-層蛋白作為乳酸桿菌細(xì)胞壁外重要的黏附物質(zhì)，乳酸桿菌這種拮抗病原菌作用細(xì)胞信號(hào)通路及調(diào)節(jié)免疫系統(tǒng)的能力是否涉及S-層蛋白的作用，目前還鮮有報(bào)道。

Sun Zhilan等[36]研究了2 種具有高黏附能力的乳酸桿菌菌株L. crispatus K243和L. crispatus K313，SDSPAGE分析表明其表面存在的S-層蛋白可能分別為SlpA和SlpB。用這2 種乳酸桿菌分別作用經(jīng)S. braenderup H9812刺激后的HT-29細(xì)胞，結(jié)果表明細(xì)胞經(jīng)刺激后能夠引起編碼促炎性信號(hào)分子白細(xì)胞介素-8（interleukin-8，IL-8），生長(zhǎng)調(diào)節(jié)致癌基因-α（chemokine(C-X-C motif)ligand 1，CXCL-1），巨噬細(xì)胞炎癥蛋白-3α（chemokine(C-C motif)ligand 20，CCL20）的基因轉(zhuǎn)錄水平提高，2 種乳酸桿菌能降低這3 種炎性信號(hào)分子的轉(zhuǎn)錄能力，且下調(diào)水平約為36.2%～58.8%。酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定（enzyme linked immuno sorbent assay，ELISA）分析進(jìn)一步證明了L. crispatus K243和L. crispatus K313能夠抑制細(xì)胞分泌IL-8，且抑制水平分別為32.8%和47%。K313相比于K243能夠在S. braenderup感染人腸上皮細(xì)胞時(shí)表現(xiàn)出更強(qiáng)的抗炎性作用。2 種乳酸桿菌引起的細(xì)胞免疫響應(yīng)的差異與其表面的S-層蛋白的不同是否有關(guān)，目前尚不清楚。

李鵬成[37]用Caco-2細(xì)胞作為體外模型，研究了從L. acidophilus ATCC4356菌株中分離純化的S-層蛋白拮抗S. typhimurium SL1344對(duì)細(xì)胞MAPKs信號(hào)通路的影響。結(jié)果表明，在MAPKs通路mRNA水平的表達(dá)中，S-層蛋白能夠消除S. typhimurium SL1344引起的細(xì)胞ERK2的基因表達(dá)的下調(diào)及JNK1的基因表達(dá)的上調(diào)，且S-層蛋白對(duì)p38基因的表達(dá)有顯著的下調(diào)作用。而在MAPKs通路蛋白水平的表達(dá)中，S-層蛋白能夠降低S. typhimurium SL1344引起的ERK1/2的磷酸化水平，拮抗病原菌引起的Caco-2細(xì)胞的JNK的磷酸化，同時(shí)顯著減少p38磷酸化水平。實(shí)驗(yàn)表明乳酸桿菌的S-層蛋白可能通過(guò)阻斷S. typhimurium SL1344對(duì)MAPK信號(hào)通路的活化拮抗病原菌的黏附與入侵，阻止致病菌對(duì)細(xì)胞的進(jìn)一步感染。Li Pengcheng等[38]的研究也證實(shí)了S-層蛋白能夠修復(fù)S. typhimurium SL1344引起的Caco-2的細(xì)胞凋亡，并且通過(guò)對(duì)Caspase-3活性的抑制作用來(lái)拮抗細(xì)胞凋亡。結(jié)果與S-層蛋白能夠顯著誘導(dǎo)ERK1/2的活化相一致，表明乳酸桿菌S-層蛋白對(duì)Salmonella引起的上皮細(xì)胞的破壞具有保護(hù)作用。

Valentina等[39]通過(guò)Caco-2細(xì)胞作為體外模型證實(shí)了L. helveticus MIMLh5及其SlpA能夠通過(guò)降低IL-1β引起的核因子-κB（nuclear factor-κB，NF-κB）的活性進(jìn)行抗炎性反應(yīng)。當(dāng)以人的巨噬細(xì)胞系U937作為刺激模型時(shí)，MIMLh5通過(guò)引起細(xì)胞的促炎性細(xì)胞因子——腫瘤壞死因子-α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）和環(huán)氧酶-2（cyclo-oxyge-nase-2，COX-2）的表達(dá)來(lái)刺激非特異性免疫反應(yīng)。并且，TNF-α和COX-2的表達(dá)量與MIMLh5菌體SlpA的存在與否及SlpA的濃度直接相關(guān)，菌體表面存在的SlpA含量高， 能引起TNF-α和COX-2基因的表達(dá)能力提高。同時(shí)，SlpA對(duì)鼠的骨髓細(xì)胞（bone marrow differentiation of mouse，BMDMs）與鼠的腹腔巨噬細(xì)胞（peritoneal cavity macrophage，PCMs）的刺激效應(yīng)也表明SlpA能夠提高M(jìn)IMLh5菌株誘導(dǎo)細(xì)胞產(chǎn)生TNF-α的能力。不同的細(xì)胞模型均表明，MIMLh5的SlpA能夠誘導(dǎo)細(xì)胞TNF-α和COX-2基因的表達(dá)。但是，不能將SlpA等同于脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）這種促炎性刺激物，因?yàn)閷?shí)驗(yàn)將SlpA與LPS共同作用刺激U937時(shí)，LPS與S-層蛋白同時(shí)存在并未在促炎性響應(yīng)中產(chǎn)生疊加或者協(xié)同效應(yīng)。相反，SlpA能夠顯著降低由LPS誘導(dǎo)引起的TNF-α的產(chǎn)生。并且當(dāng)二者分別作用細(xì)胞時(shí)，僅當(dāng)SlpA的作用劑量高于LPS 10 倍時(shí)，二者引起的細(xì)胞關(guān)于TNF-α和COX-2的響應(yīng)結(jié)果才能相同。TNF-α不僅與誘發(fā)炎癥性疾病相關(guān)，對(duì)腫瘤及傳染病也具有抑制作用[40]。有研究表明，為響應(yīng)機(jī)體損傷和炎癥引起的COX-2迅速上調(diào)有助于恢復(fù)黏膜的完整性[41]。因此，SlpA對(duì)調(diào)節(jié)細(xì)菌的免疫刺激活動(dòng)具有重要的作用，能夠幫助宿主抵御病原菌和響應(yīng)感染的作用。

Sergey等[42]研究了L. acidophilus NCFM表面主要的SlpA對(duì)樹(shù)突細(xì)胞（dendritic cells，DCs）及T細(xì)胞功能的調(diào)節(jié)。DCs表面存在各種模式識(shí)別受體（pattern recognition receptors，PRRs）來(lái)識(shí)別病原體和共生細(xì)菌中的特征分子。這些受體包括Toll樣受體（tolllike receptors，TLRs）和C-型凝集素（C-type lectins，CLRs）。其中CLRs中的一種DC-SIGN（DC-specific ICAM-3-grabbing nonintegrin）能夠特異性識(shí)別乳酸桿菌的SlpA并與其發(fā)生相互作用，從而調(diào)節(jié)DCs和T細(xì)胞的功能。DCs具有產(chǎn)生細(xì)胞因子的重要功能，將L. acidophilus NCFM的SlpA分離純化，作用于DCs，發(fā)現(xiàn)SlpA能夠促進(jìn)IL-10的大量產(chǎn)生，并且當(dāng)SlpA與病原菌的LPS共同刺激DCs時(shí)，產(chǎn)生的IL-10的水平更高。DC-SIGN也參與激活T細(xì)胞分化，將成熟的DCs與未成熟的T細(xì)胞共同培養(yǎng)，在LPS與SlpA共同刺激DCs時(shí)，能夠誘導(dǎo)T細(xì)胞分泌大量的IL-4。而用DC-SIGN特異性抗體對(duì)培養(yǎng)物進(jìn)行處理，SlpA未引起細(xì)胞因子比率的改變。純化的SlpA單獨(dú)作用DCs也未引起T細(xì)胞的增殖。結(jié)果說(shuō)明，T細(xì)胞的分化與DC-SIGN相關(guān)，并且在LPS刺激DCs后，通過(guò)DC-SIGN對(duì)SlpA的識(shí)別和相互作用，促進(jìn)未成熟的T細(xì)胞向Th2型分化。所以L. acidophilus NCFM的SlpA與DCs表面的相應(yīng)受體的相互作用能夠調(diào)節(jié)細(xì)胞的免疫功能，證明了乳酸桿菌的S-層蛋白能夠直接或間接的干涉病原體在宿主免疫系統(tǒng)引起的不利影響。Ashida等[43]利用L. acidophilus L-92和L. acidophilus CP-23這2 種乳酸桿菌表面SlpA表達(dá)含量的不同，證明SlpA的含量與乳酸桿菌刺激細(xì)胞產(chǎn)生Th1型細(xì)胞炎性因子IL-12的能力直接相關(guān)。L-92相比于CP-23能夠在菌體細(xì)胞表面表達(dá)更高水平的SlpA，2 種乳酸桿菌分別作用鼠的DC一定時(shí)間，檢測(cè)培養(yǎng)基中的IL-12的含量，結(jié)果表明SlpA表達(dá)量少的CP-23刺激DCs釋放IL-12的水平也低。即乳酸桿菌通過(guò)表面的SlpA影響DCs釋放IL-12，從而影響細(xì)胞的免疫調(diào)節(jié)。Yanagihara等[44]進(jìn)一步研究確定CP-23表面低水平的SlpA對(duì)免疫調(diào)節(jié)作用影響的原因。實(shí)驗(yàn)通過(guò)對(duì)L-92和CP-23細(xì)菌表面SlpA錨定作用進(jìn)行重建分析，表明CP-23相較于L-92對(duì)細(xì)胞表面的SlpA的錨定能力低，從而導(dǎo)致CP-23重新整合SlpA的能力較低，CP-23表面的SlpA被大量釋放于培養(yǎng)基中。同時(shí)也證明了乳酸桿菌的免疫調(diào)節(jié)作用需要表面的SlpA進(jìn)行錨定的重要性質(zhì)。

Johnson等[45]將編碼S-層蛋白的Lba1029基因從L. acidophilus NCK1909菌株的染色體上刪除，產(chǎn)生一種突變體菌株L. acidophilus NCK2258。為了研究S-層蛋白的免疫調(diào)節(jié)功能，將乳酸桿菌與鼠的DC以10∶1的濃度比共培養(yǎng)，檢測(cè)DC的細(xì)胞因子產(chǎn)生水平。結(jié)果表明，DCs分別與2 種乳酸桿菌共培養(yǎng)后，DCs產(chǎn)生IL-6、IL-10、IL-12的水平?jīng)]有顯著差別，但是NCK2258刺激DCs產(chǎn)生的TNF-α比NCK1909產(chǎn)生的低36%。即Lba1029編碼的S-層蛋白有助于細(xì)胞的促炎性反應(yīng)，S-層蛋白通過(guò)對(duì)TNF-α的誘導(dǎo)表現(xiàn)對(duì)細(xì)胞的免疫調(diào)節(jié)作用。

根據(jù)以上的研究結(jié)果可以看出，在體外實(shí)驗(yàn)中，乳酸桿菌的S-層蛋白能夠誘導(dǎo)不同的細(xì)胞如DCs、Caco-2、HT-29、BMDMs以及PCMs發(fā)生不同的細(xì)胞因子。研究發(fā)現(xiàn)，乳酸桿菌免疫調(diào)節(jié)性質(zhì)的差異與乳酸桿菌菌株的不同、細(xì)胞的來(lái)源有關(guān)[33]。也有研究表明，乳酸桿菌誘導(dǎo)T細(xì)胞分泌不同的細(xì)胞因子與乳酸桿菌的劑量直接相關(guān)。低劑量乳酸桿菌可以誘導(dǎo)T淋巴細(xì)胞分泌IL-4、IL-5、IL-10、IL-13等細(xì)胞因子，促進(jìn)Th2分化，主要介導(dǎo)體液免疫應(yīng)答。最適劑量乳酸桿菌的調(diào)節(jié)作用正好相反，可以抑制Th2分化，轉(zhuǎn)向Th1分化，分泌IL-2、IL-8、干擾素-α（interferon-α，IFN-α）、IFN-γ、IFN-β、TNF-α、IL-12 等細(xì)胞因子，主要介導(dǎo)細(xì)胞免疫應(yīng)答。高劑量乳酸桿菌則使T細(xì)胞產(chǎn)生不應(yīng)答現(xiàn)象[46]。而乳酸桿菌的S-層蛋白所引起的細(xì)胞免疫響應(yīng)的差異與S-層蛋白的來(lái)源、細(xì)胞的種類和S-層蛋白的濃度是否有關(guān)，還需進(jìn)一步的證實(shí)。

4 結(jié) 語(yǔ)

近年來(lái)的研究發(fā)現(xiàn)乳酸桿菌對(duì)病原菌的拮抗作用及對(duì)腸道炎癥的調(diào)節(jié)作用與S-層蛋白密切相關(guān)。目前關(guān)于乳酸桿菌S-層蛋白免疫調(diào)節(jié)作用的相關(guān)實(shí)驗(yàn)都是基于體外實(shí)驗(yàn)。體外模型通常僅通過(guò)細(xì)胞因子的分泌水平來(lái)預(yù)測(cè)乳酸桿菌S-層蛋白具有潛在的免疫調(diào)節(jié)作用。未來(lái)關(guān)于乳酸桿菌S-層蛋白的研究應(yīng)注重體內(nèi)分析實(shí)驗(yàn)，為進(jìn)一步證實(shí)S-層蛋白的免疫調(diào)節(jié)作用提供支持。同時(shí)，進(jìn)一步研究S-層蛋白的生化特性和功能，闡明S-層蛋白對(duì)腸炎的調(diào)控作用及機(jī)制，對(duì)于開(kāi)發(fā)新型的微生態(tài)制劑具有重要的意義。

我國(guó)乳酸桿菌菌種豐富、來(lái)源廣泛，不同來(lái)源的S-層蛋白具有不同的結(jié)構(gòu)、性質(zhì)和功能，全面研究S-層蛋白的異同及功能特性，對(duì)乳酸桿菌及S-層蛋白在食品、生物、醫(yī)藥等領(lǐng)域中的應(yīng)用具有重要的價(jià)值。

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ZHANG Yingchun1,2, XIANG Xinling1, ZHANG Lanwei1, MA Fang2, LI Shaohui1
(1. School of Chemical Engineering and Technology, Harbin Institute of Technology, Harbin 150090, China; 2. School of Municipal and Environmental Engineering, Harbin Institute of Technology, Harbin 150090, China)

The structure and function of Lactobacillus S-layer protein are reviewed in this paper with special focus on its tolerance to digestive enzymes and bile salts, involvement in host cell adhesion of Lactobacillus and role in inhibiting host cell adhesion and intrusion by pathogens. Meanwhile, the regulatory effect of Lactobacillus S-layer protein on cell signaling pathways is expounded. In conclusion, this review suggests that Lactobacillus S-layer protein plays an important role in the immunoregulatory effect of Lactobacillus.

Lactobacillus; S-layer protein; signaling pathways; immunoregulation

10.7506/spkx1002-6630-201603040

R378.992

A

1002-6630（2016）03-0229-06

張英春, 向鑫玲, 張?zhí)m威, 等. 乳酸桿菌S-層蛋白的結(jié)構(gòu)及免疫調(diào)控功能研究進(jìn)展[J]. 食品科學(xué), 2016, 37(3): 229-234.DOI:10.7506/spkx1002-6630-201603040. http://www.spkx.net.cn

ZHANG Yingchun, XIANG Xinling, ZHANG Lanwei, et al. A review on the structure and immune regulation function of Lactobacillus S-layer protein[J]. Food Science, 2016, 37(3): 229-234. (in Chinese with English abstract)DOI:10.7506/ spkx1002-6630-201603040. http://www.spkx.net.cn

2015-03-21

國(guó)家自然科學(xué)基金面上項(xiàng)目（3130151 5）；中國(guó)博士后科學(xué)基金特別資助項(xiàng)目（2013T6 0382）；中國(guó)博士后基金第51批科研資助基金項(xiàng)目（2012M510093）；黑龍江省自然科學(xué)基金項(xiàng)目（C201433）

張英春（1975—），女，副教授，博士，主要從事乳酸桿菌及其活性產(chǎn)物研究。E-mail：zyc229@163.com