小麥蛋白肽的酶解制備方法及研究進展

王明皓，劉建龍，*，史建國，李亮，王謙

（1.山東師范大學生命科學學院，山東濟南250014；2.山東省科學院生物研究所，山東濟南250014；3.山東省食品發(fā)酵工業(yè)研究設(shè)計院，山東濟南250014）

小麥蛋白肽的酶解制備方法及研究進展

王明皓1，劉建龍1，*，史建國2，李亮3，王謙1

（1.山東師范大學生命科學學院，山東濟南250014；2.山東省科學院生物研究所，山東濟南250014；3.山東省食品發(fā)酵工業(yè)研究設(shè)計院，山東濟南250014）

小麥蛋白肽具有多種生物活性，具備很好的保健功能，且具有成本低的優(yōu)勢，因而在功能性食品領(lǐng)域、保健品領(lǐng)域市場前景廣闊。其制備方法已由原本制備效果較差的酸水解逐漸轉(zhuǎn)向酶解。綜述國內(nèi)外幾種酶解小麥蛋白制備多肽的方法及研究進展。

小麥蛋白；酶解；蛋白肽

小麥蛋白粉又稱谷朊粉或活性面筋粉，是以小麥為原料生產(chǎn)的高蛋白產(chǎn)物，蛋白含量大約在80%左右，呈淡黃色，其中所含氨基酸種類較齊全，具有與水稻蛋白、玉蜀黍蛋白不同的功能性[1]，因而是一種營養(yǎng)價值較高、物美價廉的天然植物蛋白源。小麥蛋白粉中的蛋白質(zhì)主要包括麥谷蛋白、麥醇溶蛋白、清蛋白和球蛋白等，其中麥谷蛋白與麥醇溶蛋白含量較高，可達90%左右。麥谷蛋白分子量為0.1Mu～3.0Mu，呈纖維狀；麥醇溶蛋白分子量為30.0 ku～0.1 Mu，呈球狀[2]。這兩種蛋白因分子內(nèi)疏水作用區(qū)域較大，在水中溶解性較差，限制了其在食品加工中的應用。若對小麥蛋白質(zhì)進行水解，便可增加其溶解度，擴展其應用，提升產(chǎn)品附加值。

目前其水解方法主要有酸水解和酶解兩種方法，酸水解易生成氯丙醇且可能會使小麥蛋白粉中的非蛋白氮水解成氨類及醛酮類而使風味變差，而酶水解小麥蛋白粉不僅能增加溶解度，還能產(chǎn)生數(shù)種活性肽，具有參與機體免疫調(diào)節(jié)、降血壓、促進礦物質(zhì)吸收、抗血栓等作用[3-5]，研究還顯示，多肽在生物體內(nèi)利用率較游離氨基酸高[6]，故而酶解法具有更佳前景。因此本文綜述了國內(nèi)外幾種酶解小麥蛋白制備多肽的方法及進展。

1 胃蛋白酶

小麥蛋白在酸性條件下蛋白質(zhì)溶解率較高，在胃蛋白酶（Pepsin）的最適pH值條件下，其溶解率可達50%以上，因此采用胃蛋白酶水解具有一定的優(yōu)勢。張銳昌等[7]對胃蛋白酶水解小麥蛋白粉工藝進行了研究，得出胃蛋白酶水解谷朊粉最佳條件為溫度37℃、pH 2.0、底物濃度1.0%、加酶量為1.5 kU/g、酶解時間7.0 h。在此條件下蛋白質(zhì)水解度DH值為7.80%。此研究意在探索使用胃蛋白酶制取小麥蛋白肽的最佳條件，并未考慮制取功能性多肽，但可見若單純從水解蛋白制備多肽的量的角度來看，胃蛋白酶法制取產(chǎn)量太低，并不適合工業(yè)用。本文考慮加進胃蛋白酶法作為備選方法之一，因其水解產(chǎn)物中小分子肽占比非常高，產(chǎn)出的多肽幾乎都為小分子肽。王歲樓等[8]研究了胃蛋白酶水解小麥蛋白粉制取分子量較小的多肽，得出最佳條件為溫度為35℃、pH 2.0、底物濃度10.0%、酶濃度7.0%、酶解時間3.0 h，在此條件下蛋白質(zhì)水解度DH值為4.62%，水解產(chǎn)物的分子量均小于7 ku，大多數(shù)處于1.4 ku～4.1 ku之間。雖然未見胃蛋白酶法產(chǎn)出蛋白肽的功能性研究，但其產(chǎn)物中高占比的小分子肽決定了胃蛋白酶法在小麥功能性蛋白肽的制備中定有其獨特的地位。但胃蛋白酶水解小麥蛋白粉對酸性條件要求較高，如若工業(yè)化生產(chǎn)則對設(shè)備抗酸能力具有較高要求，這必然會提高生產(chǎn)成本，因而能否從其水解產(chǎn)物中找出高價值的功能性肽就成為了決定該法能否應用于工業(yè)生產(chǎn)的決定性因素。

2 中性蛋白酶

中性蛋白酶（Neutrase）水解條件較為溫和，不需添加酸堿調(diào)節(jié)劑，對制取設(shè)備抗酸耐堿性要求較低，因而更為環(huán)保、成本也更低，利于工業(yè)生產(chǎn)。中性蛋白酶法水解小麥蛋白的肽得率高于胃蛋白酶法。

谷中華等[9]研究了中性蛋白酶水解小麥蛋白粉的工藝，得出最佳酶解條件為溫度52℃、pH 6.5、底物質(zhì)量分數(shù)為10.0%、加酶量為12 kU/g，酶解時間4.0 h，蛋白質(zhì)水解度DH值為15.80%，溶解率提升至72.2%，分子量在3 ku以下的肽占總肽的70%左右。N.A.Hardt等[10]的研究表明，高固體濃度不利于酶解，提升溶解率可增加小分子肽含量，因此提升溶解率對酶解有實質(zhì)上的利好作用，中性蛋白酶水解小麥蛋白可顯著提高蛋白溶解率，這是其蛋白水解度顯著高于胃蛋白酶法的原因之一，這一特性對工業(yè)生產(chǎn)來說有較高價值。有關(guān)中性蛋白酶法制取多肽活性的研究可見劉立芳等[11]的研究。其利用中性蛋白酶制備了具有抗氧化性的活性肽，酶解液羥自由基清除率達65%以上，其制備條件為溫度52℃、底物濃度8.0%、加酶量2 800 U/g、酶解時間4.7 h左右。抗氧化性肽是近年來對功能性肽研究的熱門，其抗氧化的功能性決定了其在保健食品等領(lǐng)域價值較高，因而中性蛋白酶法具有較好的工業(yè)利用前景。但其產(chǎn)量低這一不利因素會是限制其應用的最大障礙，有研究使用超聲波或微波法在一定程度上能夠提升其產(chǎn)量。陳海英等[12]利用200 W超聲波使中性蛋白酶水解小麥蛋白的水解度提高了47.93%，并證明了超聲波不改變酶解的其他條件。喬曉林等[13]利用540 W功率微波大幅提高中性蛋白酶水解小麥蛋白的水解度，且得出微波作用亦不改變酶解的其他條件。此外，R.Kammoun等[14]研究了中性蛋白酶水解度較低的原因主要是小于1 ku的肽的抑制作用，因此R.Kammoun等建議采用復合蛋白酶作用及連續(xù)膜反應器法聯(lián)合使用解決此問題，從而可使中性蛋白酶水解小麥蛋白的水解度進一步提升。以上方法均不難應用于中性蛋白酶法制取小麥蛋白肽的工業(yè)生產(chǎn)當中，且提升產(chǎn)量所帶來的價值理應大于相關(guān)技術(shù)設(shè)備的投入。所以中性蛋白酶法值得進一步探索其應用于工業(yè)化生產(chǎn)的條件。

3 木瓜蛋白酶

木瓜蛋白酶（Papain）是一種源自番木瓜的天然植物蛋白酶，具有酶活高、熱穩(wěn)定性好、使用安全等優(yōu)點。其水解條件溫和，成本較低。木瓜蛋白酶法的最大優(yōu)點即是采用天然植物蛋白酶，這在產(chǎn)品推廣中必然有很大優(yōu)勢，也是該法的最大價值所在。目前關(guān)于木瓜蛋白酶的水解產(chǎn)物活性的研究結(jié)果與中性蛋白酶法制取產(chǎn)物類似，亦是抗氧化活性。劉樹興等[15]利用木瓜蛋白酶酶解小麥蛋白粉得到自由基（DPPH）清除率達到96.59%的抗氧化多肽，酶解條件為溫度40℃、加酶量125 U/g、酶解時間4.0 h。木瓜蛋白酶法工業(yè)應用的最大限制與胃蛋白酶法類似，也是產(chǎn)率問題。付雅麗等[16]在溫度60℃、底物濃度4.0%、pH 6.6、酶濃度0.475%條件下，水解度DH值為4.32%。由此可見木瓜蛋白酶法制取小麥蛋白肽的產(chǎn)量實在太低，有關(guān)提高其產(chǎn)量的研究目前未可見，需要進一步的研究來支持其工業(yè)化應用。

4 堿性蛋白酶

有關(guān)堿性蛋白酶（Alcalase）水解小麥蛋白粉的研究較多，主要是因為堿性蛋白酶酶解效果較好，在同樣水解度時與胃蛋白酶及中性蛋白酶水解產(chǎn)物的小肽得率對比中發(fā)現(xiàn)，使用堿性蛋白酶的水解產(chǎn)物小肽的得率可超過80%，遠高于胃蛋白酶及中性蛋白酶[17]，因此堿性蛋白酶法被視為單酶法中最接近工業(yè)生產(chǎn)實際應用的方法。有關(guān)堿性蛋白酶法制取產(chǎn)物活性的研究可見趙源等[18]的文章，其利用堿性蛋白酶水解小麥蛋白粉水解度可達22.96%，并制備出了抗凍多肽，分子量在8 ku～50 ku之間，此時水解條件為溫度55℃、底物濃度9%、pH 8.0、酶濃度4%、酶解時間2.5 h。抗凍多肽具有控制冰晶生長、減少細胞損傷及保持產(chǎn)品原有組織結(jié)構(gòu)、質(zhì)地和品質(zhì)的特點和突出意義而成為熱點研究主題[19]，若能夠用小麥蛋白生產(chǎn)抗凍多肽，其成本優(yōu)勢會很明顯，市場前景甚好。另外，陳思思等[20]在乙醇溶液中用堿性蛋白酶酶解小麥蛋白粉制備谷氨酰胺肽，得出乙醇溶液中有利于谷氨酰胺的制備，得到酰胺氮含量為3.07 mmol/g，最佳條件為溫度47.5℃、底物濃度14%、加酶量7 kU/g、酶解時間3.5 h、乙醇濃度40%。谷氨酰胺肽在醫(yī)學中已被證明用途廣泛，如對小腸粘膜修復效果顯著等[21]，使用小麥蛋白制取谷氨酰胺肽不失為一件利事。需要補充的是：張弦等[22]制備固定化堿性蛋白酶水解谷朊粉，發(fā)現(xiàn)固定化并不能改變水解度，但固定化堿性蛋白酶酶活力保留比較高。這使采用堿性蛋白酶制取小麥活性肽的工業(yè)應用更近了一步，該法也是工業(yè)制取小麥活性肽最成熟最可行的單酶法。

5 米曲霉蛋白酶

S.R.Drago等[23]使用一種源自米曲霉（Aspergillus oryzae）的蛋白酶處理經(jīng)過熱處理的小麥蛋白，水解對于pH值的要求不苛刻，最佳pH值范圍為6.5～9.0，水解0.5 h，水解度DH值為14.00%，且得到多肽并無苦味。由于較為寬泛的pH值，此項研究對于工業(yè)制取小麥蛋白肽具有較大意義，但還缺乏針對其制取的小麥蛋白肽相關(guān)功能性的研究。

6 復合酶作用

不同蛋白酶復配的復合酶種類較多，其蛋白酶的最佳作用條件不同，其適宜的作用條件也各有差別，研究適宜的復合酶或酶解時序及工藝控制尤其重要。復合酶法制取小麥蛋白肽產(chǎn)率一般比相應單酶法高，Kingsley K等[24]發(fā)現(xiàn)使用糜蛋白酶（chymotrypsin）水解小麥蛋白后使用微生物谷氨酰胺轉(zhuǎn)移酶（MTGase）在55℃條件下處理1.0 h可顯著提高小麥蛋白溶解性，從而可提高小麥蛋白肽得率。Brahim Mimouni等[25]使用胃蛋白酶和堿性蛋白酶分步水解小麥蛋白以及使用鹽酸脫酰胺后胃蛋白酶與木瓜蛋白酶分步水解小麥蛋白，均發(fā)現(xiàn)氮溶指數(shù)（NSI）顯著提升至90.0%，小麥蛋白肽得率很高。復合酶法不僅產(chǎn)率高，產(chǎn)物活性也頗為多樣化，Hirofumi Motoi等[26]使用胃蛋白酶和源自米曲霉的M蛋白酶分步水解小麥蛋白，水解度達到48.80%，并得到活性達51.6%的血管緊張素轉(zhuǎn)化酶抑制肽。血管緊張素轉(zhuǎn)化酶抑制肽在控制高血壓方面具有很好的作用，使用小麥蛋白作為原料生產(chǎn)血管緊張素轉(zhuǎn)化酶抑制肽不僅具有廣闊的市場，而且也必然是眾多高血壓患者的福音。復合酶法產(chǎn)物活性也比單酶法高。王章存等[27]對堿性蛋白酶單酶與堿性蛋白酶和風味酶（Flavourzyme）雙酶水解小麥蛋白粉進行了對比，發(fā)現(xiàn)雙酶水解后溶解性顯著高于單酶水解，且雙酶水解產(chǎn)物的抗氧化性明顯高于單酶水解。改變復合酶的單酶配比以及加酶順序可以得到具有不同活性的多肽。喬曉林等[28]發(fā)現(xiàn)用木瓜蛋白酶與堿性蛋白酶分步水解可得到抗氧化能力較強的肽，且加酶順序?qū)τ诳寡趸芰τ休^大影響。復合酶法效果明顯要比單酶法好很多，改變酶的配比及添加順序還可以得到不同活性的產(chǎn)物，其理應還有很多活性產(chǎn)物暫未被發(fā)現(xiàn)，但從已知結(jié)果來看，復合酶法必然是今后工業(yè)生產(chǎn)小麥蛋白肽的重點方法，應該進一步探究，使其盡早應用于工業(yè)生產(chǎn)中。

7 結(jié)語

隨著人民生活條件不斷提升，高血壓等“富貴病”發(fā)病率也逐年攀升。由于藥物治療毒副作用較高，人們對于功能性食品的需求日益增長。活性肽具有的眾多生理功能恰恰迎合了大眾需要。目前堿性蛋白酶水解小麥蛋白粉制備小肽的得率較高，以堿性蛋白酶和其他酶復合作用水解可進一步提高得率。但制備特定活性肽需用特定酶進行水解，因而如若將堿性蛋白酶與特定酶制備活性肽的優(yōu)點結(jié)合起來，便可得到得率高、活性高的肽，有關(guān)此方面的研究值得進一步探索。另外，有關(guān)小麥蛋白肽的功能特異性及規(guī)模化工業(yè)生產(chǎn)也是進一步的研發(fā)方向。

小麥在我國種植面積和產(chǎn)量均占谷物產(chǎn)量的1/4以上，原料充裕，小麥深加工符合國家產(chǎn)業(yè)政策。但長期以來，小麥深加工業(yè)卻表現(xiàn)為產(chǎn)業(yè)鏈條短、產(chǎn)品品種少、產(chǎn)品附加值低等現(xiàn)象。因此，小麥深加工業(yè)也亟需吻合發(fā)展。

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Enzymatic Hydrolysis Preparation Methods and the Research Progress of Wheat Protein Peptid

WANG Ming-hao1，LIU Jian-long1，*，SHI Jian-guo2，LI Liang3，WANG Qian1
（1.College of Life Science，Shandong Normal University，Jinan 250014，Shandong，China；2.Biology Institute，Shandong Academy of Sciences，Jinan 250014，Shandong，China；3.Shandong Academy of Food and Fermentation Industries，Jinan 250014，Shandong，China）

Multiple bioactivities have been found in the wheat protein peptide.The healthcare function of wheat protein peptide is considered to be good.In addition，it has the advantage of price.Therefore，the market prospects of it in functional food and health care products are deemed to be great.The preparation methods of wheat protein peptide have been changed from acid hydrolysis which is not so good in its effects to enzymatic hydrolysis.The research progress and enzymatic hydrolysis preparation methods to make wheat protein peptide are summed up in the paper.

wheat protein；enzymatic hydrolysis；protein peptide

10.3969/j.issn.1005-6521.2016.14.053

王明皓（1992—），男（漢），碩士研究生在讀，主要從事小麥蛋白肽加工研究。

*通信作者：劉建龍，研究員。

2015-08-10