納米材料在食源性致病菌檢測中的應(yīng)用

王馨，胡文忠*, 陳晨，馮可,2，楊柳

1(大連民族學(xué)院 生命科學(xué)學(xué)院，遼寧 大連，116600)2(大連理工大學(xué)，遼寧 大連，116024)

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納米材料在食源性致病菌檢測中的應(yīng)用

王馨1，胡文忠1*, 陳晨1，馮可1,2，楊柳1

1(大連民族學(xué)院 生命科學(xué)學(xué)院，遼寧 大連，116600)2(大連理工大學(xué)，遼寧 大連，116024)

摘要食品安全問題是國內(nèi)外一直都密切關(guān)注的熱點(diǎn)問題，與每個人的生活都息息相關(guān)，而食源性致病菌則是引發(fā)食品安全問題的主要因素之一?？焖?、準(zhǔn)確的檢測食源性致病菌是控制這類問題的關(guān)鍵所在。傳統(tǒng)的檢測方法存在耗時長，特異性和靈敏性較差等問題。而將納米材料與傳統(tǒng)食源性致病菌檢測方法相結(jié)合，能夠有效解決此類問題，極大程度地促進(jìn)了致病菌檢測的研究進(jìn)展。文章就幾種常見的納米材料在食源性致病菌檢測中的應(yīng)用進(jìn)行了綜合評述并對其未來的研究方向進(jìn)行了展望。

關(guān)鍵詞納米材料；食源性致病菌；檢測

近年來，國內(nèi)外由食源性致病菌引發(fā)的食品安全問題層出不窮，雖然大多數(shù)食源性致病菌在食物中的含量很低，但是產(chǎn)生的危害卻極大，因此食源性致病菌的檢測在預(yù)防和控制此類問題上就顯得尤為重要[1,2]。鑒于檢驗(yàn)的符合性和檢測結(jié)果的穩(wěn)定性，現(xiàn)在最常使用的檢測方法主要有平皿培養(yǎng)分離計數(shù)法、聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)法(polymerase chain reaction，PCR)、熒光 PCR 檢驗(yàn)法與酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)法(enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA)[3-6]。但是，這些方法還是存在步驟繁瑣、耗費(fèi)時間長、檢測特異性差、靈敏度低等問題，因此急需研究出一種快速、靈敏的致病菌檢測方法。

現(xiàn)今納米科技已經(jīng)成為一個世界范圍內(nèi)都在討論和研究的課題。雖然納米材料的研究還處于起步階段，但是國內(nèi)外學(xué)者對于納米材料的制備、應(yīng)用等方面的研究也已取得了一定進(jìn)展。由于納米材料本身具有許多優(yōu)良的生物學(xué)和理化特性，例如：極好的生物相容性、表面效應(yīng)、量子尺寸效應(yīng)等，使得其在生物領(lǐng)域內(nèi)被廣泛使用。國內(nèi)外學(xué)者研究發(fā)現(xiàn)功能化的納米材料在食源性致病菌檢測方面能夠發(fā)揮巨大作用。例如：表面進(jìn)行生物學(xué)修飾后的磁性納米材料由于其具有順磁性和特異性，能夠?qū)χ虏【M(jìn)行分離、富集和純化，快速地達(dá)到傳統(tǒng)檢測方法前增菌的效果，大大縮短檢測時間；金納米顆粒具有優(yōu)良的光學(xué)性能，當(dāng)其發(fā)生粒子團(tuán)聚時體系顏色會發(fā)生相應(yīng)的變化，可進(jìn)行致病菌的半定量檢測，耗時短，適合做現(xiàn)場檢測；量子點(diǎn)納米材料具有量子效應(yīng)，受刺激時會產(chǎn)生熒光，靈敏度高，能夠?qū)χ虏【M(jìn)行定量的測定。本文綜合評述了幾種常見的功能化納米材料在食源性致病菌檢測方面的應(yīng)用，旨在為今后納米材料在食源性致病菌檢測方面的研究提供一定的理論依據(jù)。

1納米材料

1.1納米材料概述

納米材料的概念最早是由德國科學(xué)家HERBERT提出的。從廣義上來說，納米材料是指三維空間中至少有一維處于納米尺度(1～100 nm)范圍內(nèi)的材料，或者是由它們作為基本單元組裝而成的材料[7]。納米材料比較普遍的分類方法是將其分為納米顆粒(零維)、納米纖維(一維)、納米膜(二維)、納米塊體(三維)等四類[8]，我們現(xiàn)在研究最多的是納米顆粒。

納米材料的尺寸極小，屬于非常典型的介觀領(lǐng)域，即介于微觀和宏觀之間的一種領(lǐng)域。由于處在這個領(lǐng)域的納米顆粒的三維尺寸都很小，因此它會在化學(xué)、力學(xué)、電學(xué)、光學(xué)、生物學(xué)等方面展現(xiàn)出許多特殊的性質(zhì)和功能[9]。例如表面效應(yīng)、量子尺寸效應(yīng)、小尺寸效應(yīng)、宏觀量子隧道效應(yīng)、介電限域效應(yīng)等，并且由此還派生出了許多其他常規(guī)材料所不具備的特殊性質(zhì)，這些特殊的性質(zhì)和功能使納米材料在生物、化工、醫(yī)藥等領(lǐng)域都有著極大的競爭力和重大的應(yīng)用價值。

1.2納米材料的制備

納米金顆粒首先是在1984年由原聯(lián)邦德國的Saarlands大學(xué)GLEITER等人使用惰性氣體凝聚和在超高真空條件下原位加壓的技術(shù)制備出來的，在那之后研究者使用不同技術(shù)制備的納米材料已經(jīng)有數(shù)百種，制備方式也越發(fā)多樣化、成熟化。目前對納米材料的制備方式主要有3種分類方法：1種是按照反應(yīng)物的狀態(tài)將其分為濕法和干法；第2種是按照制備原料的狀態(tài)分為固體法、液體法及氣體法；第3種是從制備手段分為物理法和化學(xué)法[10]，其中第3種分類方法最為常見。

2納米材料在食源性致病菌檢測中的應(yīng)用

2.1磁性納米材料在食源性致病菌檢測中的應(yīng)用

磁性納米粒子既具有納米材料的優(yōu)點(diǎn)(4個基本效應(yīng)：表面效應(yīng)、量子尺寸效應(yīng)、小尺寸效應(yīng)、宏觀量子隧道效應(yīng))又具有磁性材料的優(yōu)點(diǎn)(磁導(dǎo)向性、超順磁性)，因此它本身有著獨(dú)特的物理和化學(xué)性質(zhì)，除此之外它的表面還可以連接生物功能活性基團(tuán)，因此在食品安全檢測的過程中被廣泛使用[11]。

基于磁性納米材料的特殊性質(zhì)，在食品安全分析過程中主要是利用它的超順磁性來進(jìn)行目標(biāo)物質(zhì)的分離、富集和純化等。GU[12-13]和ARNOLD[14]等在磁性納米粒子表面進(jìn)行化學(xué)修飾，連接上能夠特異性識別細(xì)菌的萬古霉素，然后使用修飾后的功能化磁性納米粒子去特異性地識別和分離復(fù)雜體系中的革蘭氏陽性菌。再在外界磁場的影響下將識別后的細(xì)菌進(jìn)行分離富集，然后使用其它方法來檢測分離物的純度。支援等[15]使用表面功能化的γ-Fe2O3磁性納米粒子來檢測食源性致病菌(阪崎腸桿菌)，這個方法是根據(jù)抗原抗體的特異性結(jié)合，以及量子點(diǎn)熒光標(biāo)記的高靈敏度來進(jìn)行的，采用免疫磁珠磁性分離和免疫量子點(diǎn)熒光標(biāo)記聯(lián)用的方法，使檢測時間縮短至2 h，靈敏度高達(dá)102CFU/mL。WANG等[16]制備了2種特異性的抗體共同修飾的磁性FeO納米粒子用于同時分離菠菜中的金黃色葡萄球菌和沙門氏菌，檢測限為103CFU/mL。CHOI等[17]使用萬古霉素對磁性FeO納米粒子表面進(jìn)行修飾，并且使用它來分離臨床樣本中的細(xì)菌，實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，革蘭氏陽性菌的捕獲效率為(84.84±1.70)%，而革蘭氏陰性菌的捕獲效率為(48.48±1.79)%。CHEN等[18]用慶大霉素對磁性納米粒子的表面進(jìn)行修飾，用來從磷酸鹽緩沖液中分離出添加的金黃色葡萄球菌，分離的最低細(xì)菌濃度為0.5×103CFU/mL。張錦勝等[19]利用Fe3O4納米材料制備免疫磁珠，特異性地富集目標(biāo)菌株，并且利用Fe3O4的順磁、超順磁特性對核磁共振弛豫時間的影響，在一定范圍能夠定量檢測目標(biāo)菌。JOO[20]小組使用單克隆抗體修飾超順磁性 Fe3O4納米粒子從牛奶中分離出沙門氏菌，后將此復(fù)合物再連接到轉(zhuǎn)化酶上，分散在蔗糖溶劑中，蔗糖水解為葡萄糖與果糖，然后通過血糖儀來測量葡萄糖的濃度來間接測定沙門氏細(xì)菌的濃度，檢測限可達(dá)10 CFU/mL。VARSHNEY等[21]使用生物素-鏈霉親和素將抗大腸桿菌抗體包被到磁性納米粒子的表面，來捕獲牛肉樣本中的大腸桿菌O157:H7，捕獲效率為94.5%。

通過以上研究綜述可知，磁性納米材料主要是用于食源性致病菌的分離、富集和純化，它能夠有效縮短增菌時間，大幅提高檢測效率。

2.2金納米顆粒在食源性致病菌檢測中的應(yīng)用

納米金也稱膠體金，它的制備過程簡單，在生物液體里化學(xué)性質(zhì)穩(wěn)定、生物相容性較好、顆粒均一、具有良好的物理化學(xué)性質(zhì)，因此被廣泛應(yīng)用于生物、環(huán)境、食品檢測等多個領(lǐng)域[22-23]。金納米顆粒尺寸通常小于20 nm，是由幾個或幾十個原子構(gòu)成。這種結(jié)構(gòu)非常穩(wěn)定，受到激發(fā)后會產(chǎn)生很強(qiáng)的熒光，可用于熒光探針的設(shè)計[24]。納米金具有優(yōu)秀的光學(xué)性能，在分散狀態(tài)時溶液體系呈紅色，當(dāng)金納米粒子受外界影響發(fā)生聚集后顏色會由紅色變?yōu)樗{(lán)色，并且間距越小，藍(lán)色越深，因此在食源性致病金檢測時多用于進(jìn)行半定量的分析。

董靜等[25]將聚酰胺-胺固定于納米金顆粒上，提高納米金顆粒的穩(wěn)定性，再與碳納米管形成復(fù)合材料修飾于電極上，用于對沙門氏菌抗體的檢測，最低檢測限為5×102CFU/mL。LI等[26]將電感耦合等離子質(zhì)譜(inductively coupled plasma-mass spectrometry，ICP-MS)與膠體金標(biāo)記技術(shù)相結(jié)合來檢測食品中的大腸桿菌。此方法對ICP-MS高靈敏度的特性以及納米金放大信號的特性進(jìn)行了充分的利用，使檢測限低至500 CFU/mL。SU等[27]使用巰基乙胺對金納米粒子的表面進(jìn)行修飾，當(dāng)納米體系中含有大腸桿菌O157:H7 時，巰基乙胺會通過靜電作用力吸引大腸桿菌O157:H7并與之相結(jié)合，納米金顆粒發(fā)生聚集，顏色也就發(fā)生了相應(yīng)的變化，從紅色變?yōu)樗{(lán)色。這個檢測過程只需要5 min，可以通過觀察體系的顏色變化快速完成檢測，適用于現(xiàn)場檢測。劉陽[28]等將納米金與PCR技術(shù)相結(jié)合，根據(jù)副溶血弧菌(VP)的toxR基因序列，應(yīng)用primer6.0設(shè)計一對特異性引物，建立了納米金PCR方法，并對該方法的最佳反應(yīng)條件、循環(huán)數(shù)、特異性和靈敏度進(jìn)行測定，最后結(jié)果顯示該方法檢測的靈敏度比普通PCR高10倍。YANG等[29]將乙二胺修飾在玻璃碳電極上，通過納米金將沙門氏菌的單克隆抗體(McAbs)固定在電極上，由于沙門氏菌和McAbs之間具有相互作用，因此使用電化學(xué)阻抗譜(EIS)技術(shù)可以直接對沙門氏菌進(jìn)行檢測，檢測限為102CFU/mL。宋靚婧等[30]利用金納米材料良好的導(dǎo)電特性和獨(dú)特的光學(xué)性質(zhì)，構(gòu)建了3種新型的方法對沙門氏菌進(jìn)行檢測。前2種方法在納米金材料上結(jié)合沙門氏菌特異寡核苷酸序列作為目標(biāo)物質(zhì)，基于DNA 互補(bǔ)雜交原理實(shí)現(xiàn)對沙門氏菌目標(biāo) DNA 的檢測，進(jìn)而實(shí)現(xiàn)對目標(biāo)菌的檢測；后一種方法是將沙門氏菌適配體序列通過靜電作用吸附于納米金表面，構(gòu)建納米金-適配體傳感器與沙門氏菌結(jié)合，然后通過觀察體系顏色變化完成檢測。3種方法操作步驟依次簡化、所需時間依次縮短，均達(dá)到良好的靈敏度及特異性。

通過以上研究綜述可知，納米金的使用方式很多，主要是利用其光學(xué)特性引起的體系顏色變化來完成致病菌的快速檢測。

2.3量子點(diǎn)熒光納米材料在食源性致病菌檢測中的應(yīng)用

半導(dǎo)體量子點(diǎn)又稱量子點(diǎn)，是一種準(zhǔn)零維的納米材料，通常是由Ⅱ～Ⅵ族或Ⅲ～Ⅴ族元素組成的穩(wěn)定的、溶于水的、粒徑范圍在1～20 nm之間的納米晶體，具有明顯的量子效應(yīng)，能夠接受激發(fā)光產(chǎn)生熒光的半導(dǎo)體納米顆粒[31]與傳統(tǒng)有機(jī)熒光染料相比，量子點(diǎn)發(fā)射光譜的尺寸可調(diào)、光穩(wěn)定性強(qiáng)、表現(xiàn)出高量子產(chǎn)率[32]、激發(fā)波長寬、發(fā)射波長窄、同一激發(fā)光源可對多個量子點(diǎn)同時激發(fā)、斯托克斯位移較大、生物相容性好、熒光壽命長。鑒于量子點(diǎn)的這些優(yōu)異性能，它在食品安全檢測中被廣泛使用。

WANG等[33]使用量子點(diǎn)和納米磁珠的熒光免疫分析法對絞碎的牛肉、雞肉的洗水、鮮切生菜以及西蘭花中的單增李斯特菌進(jìn)行快速檢測，檢測限為2～3 CFU/0.1 mL，說明該方法可對多種食品樣品中的致病菌進(jìn)行有效檢測。WANG等[34]使用3種量子點(diǎn)，發(fā)射光波長分別為620、580、530nm，作為熒光標(biāo)記物，同時對單增李斯特菌、大腸桿菌O157:H7 和鼠傷寒沙門氏菌進(jìn)行免疫磁分離和量子點(diǎn)熒光檢測，這種方法可同時檢測到樣品中濃度低至20～50 CFU/mL的3種菌。李倩倩等[35]選用三種不同顏色不同發(fā)射波長的量子點(diǎn)標(biāo)記用免疫磁珠富集分離的目標(biāo)菌，在同一反應(yīng)體系中同時檢測3種目標(biāo)菌，檢測限為 103CFU/mL，檢測時間小于2 h。Xu等[36]制成了連接有量子點(diǎn)的免疫層析試紙條，能夠?qū)漳c彎曲桿菌進(jìn)行快速檢測，檢測限能夠達(dá)到 104CFU/ mL，是金試紙條檢測靈敏度的 10倍。HU等[37]將免疫磁珠分離技術(shù)與量子點(diǎn)熒光探針技術(shù)相結(jié)合來檢測金黃色葡萄球菌，檢出限為103CFU/mL，這個方法的樣品不需要進(jìn)行預(yù)處理和分離富集就可以直接進(jìn)行檢測，整個過程只需3 h。白冰等[38]將免疫磁珠分離技術(shù)和量子點(diǎn)熒光標(biāo)記技術(shù)聯(lián)用，建立了一種能對金黃色葡萄球菌、福氏志賀氏菌進(jìn)行快速、定量的免疫熒光檢測方法，靈敏度高，可以捕獲到101CFU/mL 濃度的菌液，整個檢測過程耗時在 2 h 之內(nèi)，可以滿足實(shí)時檢測的需求。

通過以上研究綜述可知，研究者主要是利用量子點(diǎn)的熒光特性來對食品中的致病菌進(jìn)行定量測定，降低了檢測限，提高了靈敏度。

3結(jié)論與展望

社會的進(jìn)步和人民生活水平的提高對食品安全檢測技術(shù)提出了更高的要求，如何從紛雜的各類食品中快速地對各類食源性致病菌進(jìn)行檢測是提高食品安全性、減少食品安全事故發(fā)生的一個主要問題。傳統(tǒng)的檢測方法耗時長、靈敏度低，而近些年納米技術(shù)的飛速發(fā)展為解決此類問題提供了一個新的途徑。將先進(jìn)的納米技術(shù)與傳統(tǒng)的檢測方法相結(jié)合，大大提高了食源性致病菌檢測的靈敏度和特異性，簡化了檢測步驟，減少了檢測所需的時間，在很大程度上改變了食源性致病菌檢測的研究現(xiàn)狀。

納米材料是一種新型材料，而它在食源性致病菌檢測方面的應(yīng)用也還處在一個起步階段，還存在很大的研究空間。首先，目前納米材料的制備方法還不成熟，產(chǎn)品質(zhì)量不均，加工成本較高，且生產(chǎn)規(guī)模較小[39]，因此高質(zhì)量、低成本、大規(guī)模的制備方式急待研究。其次，在致病菌分離富集過程中，磁性納米材料捕獲病原菌的方式很多，但是能夠達(dá)到特異性捕捉效果的生物親和分子種類卻較少[40]，今后應(yīng)該繼續(xù)深入和擴(kuò)大其種類的研究。另外，納米材料與電化學(xué)技術(shù)、生物學(xué)技術(shù)及分子印跡技術(shù)相結(jié)合的應(yīng)用在食品安全領(lǐng)域還不是很普遍[41]，因此還需要結(jié)合食品中污染物的性質(zhì)和特點(diǎn)來開發(fā)出更多的快速、準(zhǔn)確、特異性強(qiáng)的實(shí)時檢測技術(shù)。最后，由于食品種類繁多，營養(yǎng)成分復(fù)雜，現(xiàn)在能夠用于食品前處理的納米材料種類比較少，因此開發(fā)出更多的能夠適用于復(fù)雜樣品前處理納米材料也是需要繼續(xù)研究的。未來，將納米技術(shù)進(jìn)一步結(jié)合到傳統(tǒng)檢測方法中，將研究出更多新型、快速、高質(zhì)量的檢測方法，為食源性致病菌檢測提供強(qiáng)有力的技術(shù)支持，從而更好地保障人民群眾日常生活中的食品安全。

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Application of nanomaterials in detection of foodborne pathogenic bacteria

WANG Xin1, HU Wen-zhong1*, CHEN Chen1, FENG Ke2, YANG Liu1

1(College of Life Science, Dalian Nationalities University, Dalian 116600,China)2(Dalian University of Technology, Dalian 116024, China)

ABSTRACTFood safety is a hot issue which has been closely watched all over the world and it really related to every person’s life. Foodborne pathogenic bacteria are one of the main factors that lead to food safety issues. For this problem, it is the key that how to detect foodborne pathogenic bacteria rapidly and accurately. Traditional detection methods of foodborne pathogenic bacteria have some problems such as time-costing, poor sensitivity and poor specificity. Combination of nanomaterials with traditional detection methods can solve such problems effectively. It has greatly promoted the research progress of pathogen detection. In this paper, the application of several common nanomaterials in the detection of foodborne pathogens was comprehensively reviewed. Besides, the future research direction has been prospected.

Key wordsnanomaterials; foodborne pathogenic bacteria; detection

DOI:10.13995/j.cnki.11-1802/ts.201606042

基金項(xiàng)目：國家科技支撐計劃項(xiàng)目(2012BAD38B05)；國家自然科學(xué)基金項(xiàng)目(31172009)；國家自然科學(xué)基金項(xiàng)目(31471923)

收稿日期：2016-01-18， 改回日期：2016-03-15

第一作者：碩士研究生(胡文忠教授為通訊作者，E-mail：hwz@dlnu.edu.cn)。