雷公藤制劑抑制小鼠耳腫脹譜效關(guān)系研究

劉雪梅， 林 兵， 劉志宏， 楊麗娜， 池 婕， 宋洪濤*

（1.福建中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，福建福州350108；2.南京軍區(qū)福州總醫(yī)院藥學(xué)科，福建福州350025）

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雷公藤制劑抑制小鼠耳腫脹譜效關(guān)系研究

劉雪梅1，2， 林 兵2， 劉志宏2， 楊麗娜2， 池 婕2， 宋洪濤2*

（1.福建中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，福建福州350108；2.南京軍區(qū)福州總醫(yī)院藥學(xué)科，福建福州350025）

摘要:目的 考察不同廠家雷公藤多苷片指紋圖譜及抗炎藥效，并分析指紋圖譜與抗炎藥效的關(guān)聯(lián)性。方法 采用高效液相色譜法（HPLC）建立7個(gè)廠家雷公藤多苷片指紋圖譜，得到11個(gè)共有峰；選擇二甲苯致小鼠耳腫脹炎癥模型進(jìn)行抗炎藥效學(xué)研究；采用灰色關(guān)聯(lián)度分析法研究11個(gè)共有峰與其抗炎藥效的相關(guān)性。結(jié)果 各廠家雷公藤多苷片指紋峰數(shù)目和大小差異較大且均有抗炎作用；構(gòu)建了雷公藤多苷片“譜-效”模型，各共有峰與抗炎藥效的關(guān)聯(lián)度均大于0.5，其中9號(hào)峰和6號(hào)峰對(duì)藥效的貢獻(xiàn)較大（關(guān)聯(lián)度均大于0.77），各峰所代表的化學(xué)成分對(duì)其抗炎作用貢獻(xiàn)的大小順序?yàn)? 9＞6＞3＞5＞1 =10＞4＞8＞2 =11＞7。結(jié)論 不同廠家雷公藤制劑指紋圖譜不同，抗炎藥效亦不同，其是共有峰所代表的化學(xué)成分群綜合作用的結(jié)果，將兩者進(jìn)行關(guān)聯(lián)度分析結(jié)果顯示，各峰與藥效的關(guān)聯(lián)度不等，對(duì)藥效的貢獻(xiàn)強(qiáng)弱不同。

關(guān)鍵詞:雷公藤；雷公藤多苷片；HPLC；抗炎；譜效關(guān)系；灰色關(guān)聯(lián)度法

dol:10.3969/j.issn.1001-1528.2016.02.042

雷公藤是衛(wèi)矛科雷公藤屬植物雷公藤TriPterygium Wilfordii Hook.f.的干燥根。主要含有二萜類、三萜類、生物堿類等成分，具有顯著的抗炎、免疫抑制藥理活性［1］。目前，已經(jīng)上市的雷公藤制劑有雷公藤多苷片、雷公藤片和雷公藤總萜片等，臨床上多用于類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎、系統(tǒng)性紅斑狼瘡、腎病綜合癥等自身免疫疾病，療效顯著。但其毒性較大，不良反應(yīng)高發(fā)，總不良反應(yīng)發(fā)生率為58.1％，嚴(yán)重程度通常是患者不能耐受的［2］，從而嚴(yán)重影響了其臨床應(yīng)用。究其原因，雷公藤制劑中有些成分既是藥效成分又是毒性成分，治療窗口窄，質(zhì)量控制方法不完善［3］。本研究建立了雷公藤多苷片的指紋圖譜，開展雷公藤制劑譜效關(guān)系研究，為深入研究雷公藤藥效物質(zhì)基礎(chǔ)及建立較完善的質(zhì)量控制方法提供參考。

1 材料與方法

1.1 儀器 1200型快速高效液相色譜儀、XDB-CN色譜柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）（美國(guó)Agi1ent公司）；KQ-800KDE型超聲波清洗器（上海超聲波儀器有限公司）；YO-202型電子天平（上海精密儀器科學(xué)有限公司）；SePPak中性氧化鋁柱（6 cc/1 g，美國(guó)Waters公司）；UV-2501型紫外-可見分光光度計(jì)（日本島津公司）；6 mm直徑打孔器（溫州新星五金工具廠）。

1.2 試劑 乙腈、甲醇（色譜純，美國(guó)Sigma公司）；乙酸乙酯、二甲苯（分析純，上海聯(lián)試化工試劑有限公司）；阿司匹林腸溶片（批號(hào)BJ14634拜耳醫(yī)藥保健有限公司）；雷公藤甲素（批號(hào)111567-200502，純度≥99％，南京澤朗醫(yī)藥科技有限公司）；雷公藤內(nèi)酯酮（純度≥98％，南京澤朗醫(yī)藥科技有限公司）；雷公藤次堿（純度≥98％，批號(hào)131229，南京景竹生物科技有限公司）；雷公藤多苷片購買自A（批號(hào)120905）、B（批號(hào)120917）、C（批號(hào)20120802）、D（批號(hào)20120901）、E（批號(hào)120502）、F（批號(hào)121202）、G（批號(hào)120601）7個(gè)廠家。

1.3 動(dòng)物 清潔級(jí)KM小鼠，雄性，90只，體質(zhì)量18～22 g，由南京軍區(qū)福州總醫(yī)院比較醫(yī)學(xué)科提供，合格證號(hào)SCXK（滬）2012-0002。

2 方法與結(jié)果

2.1 供試品及樣品的制備

2.1.1 供試品的制備 取雷公藤多苷片適量，研磨，精密稱取0.2 g，加乙酸乙酯30 mL，超聲提取10 min，放冷，過濾，取15 mL濾液用中性氧化鋁柱純化，收集流出液，再用乙酸乙酯洗脫，收集洗脫液，合并流出液和洗脫液，吹干，殘?jiān)? mL甲醇溶解，過0.22 μm濾膜，即得指紋圖譜所需的供試品。

2.1.2 樣品的制備 雷公藤多苷片按照“2.1.1”項(xiàng)供試品前處理的方法得到吹干后樣品，加吐溫-80水浴加熱（60℃）溶解，再用生理鹽水（0.9 ％ Nac1溶液）稀釋成6 mg/kg的溶液用于藥效試驗(yàn)。

2.1.3 對(duì)照品的制備 取雷公藤甲素、雷公藤內(nèi)酯酮、雷公藤次堿適量于10 mL量瓶中，加乙腈溶液溶解并稀釋至刻度，制得對(duì)照品溶液。

2.2 雷公藤多苷片指紋圖譜的建立

2.2.1 色譜條件 Agi1ent XDB-CN色譜柱（4.6 mm× 250 mm，5 μm）。流動(dòng)相:乙腈（A）-水（B），梯度洗脫（0～15 min，25％～32％ A；15～35 min，32％～42％ A；35～56 min，42％～82％ A）；檢測(cè)波長(zhǎng)218 nm；柱溫30℃。體積流量: 1.0 mL/min。進(jìn)樣量10 μL，記錄56 min色譜圖。

2.2.2 方法學(xué)考察 經(jīng)方法學(xué)考察，共有色譜峰的相對(duì)保留時(shí)間、相對(duì)峰面積的精密度、穩(wěn)定性和重復(fù)性均符合要求，RSD均小于5％。

2.2.3 HPLC指紋圖譜及共有峰的建立 分別精密吸取雷公藤甲素、雷公藤內(nèi)酯酮、雷公藤次堿和供試品溶液照“2.2.1”項(xiàng)色譜條件進(jìn)行檢測(cè)，記錄色譜圖，結(jié)果見圖1和圖2。選定11號(hào)峰為對(duì)照峰，采用國(guó)家藥典委員會(huì)編寫的“中藥色譜指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)2004A版”相似度軟件，對(duì)7個(gè)廠家（A～G表示）雷公藤供試品的HPLC指紋圖譜進(jìn)行處理，得到對(duì)照指紋圖譜，結(jié)果見圖3。

1.雷公藤甲素 3.雷公藤內(nèi)酯酮 11.雷公藤次堿圖1　雷公藤對(duì)照品的HP L C圖

圖2　各廠家雷公藤多苷片樣品H P L C圖

圖3　雷公藤多苷片對(duì)照指紋圖譜

2.3 抗炎藥效研究

2.3.1 實(shí)驗(yàn)方法 選取雄性小鼠（18～22 g）90只，隨機(jī)分為9組，每組10只?？瞻讓?duì)照組給予生理鹽水，陽性對(duì)照組給予阿司匹林腸溶片，試驗(yàn)組給予7個(gè)廠家的樣品。阿司匹林腸溶片與樣品分別按0.4 g/kg和6 mg/kg的劑量灌胃給藥，1次/d，連續(xù)給藥4 d。末次給藥45 min后，于小鼠右耳兩面涂二甲苯30 μL［4］。15 min后將左、右兩耳片切下，以6 mm打孔器取下左、右耳片，立即用電子天平稱重（mg），按下式計(jì)算耳腫脹度。

腫脹度=右耳質(zhì)量-左耳質(zhì)量

2.3.2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果 結(jié)果顯示，實(shí)驗(yàn)組A～G與陰性對(duì)照組比較，7個(gè)廠家雷公藤樣品對(duì)小鼠耳腫脹均有顯著抑制作用，且作用不等，其中A～E廠家的P＜0.01，F(xiàn)和G兩個(gè)廠家的P＜0.05。原因可能是各廠家原料藥的來源、提取純化工藝、質(zhì)量控制方法不同，使得制劑中成分和含有量不同，使得藥效產(chǎn)生差異。結(jié)果見表1。

表1　抗炎活性實(shí)驗(yàn)結(jié)果（n=1 0，±s）

表1　抗炎活性實(shí)驗(yàn)結(jié)果（n=1 0，±s）

注:與空白對(duì)照組比較，*P＜0.05，**P＜0.01

組別　　腫脹度/mg陰性對(duì)照組　9.8±1.7陽性對(duì)照組　2.5±1.2**A 3.3±1.1**B 4.2±1.4**C 5.0±1.3**D 6.0±1.2**E 6.2±1.2**F 7.6±1.3*G 7.2±1.5*

2.4 抗炎譜效關(guān)系的建立

2.4.1 共有峰峰面積與關(guān)聯(lián)度 采用“灰色系統(tǒng)理論建模軟件（GTMS3.0）”，中的灰色關(guān)聯(lián)分析。以各共有峰峰面積和抗炎藥效數(shù)據(jù)為序列，分別計(jì)算藥效與峰面積序列的關(guān)聯(lián)度，用以分析指紋圖譜各色譜峰與抗炎藥效的相關(guān)性，結(jié)果見表2。

2.4.2 譜效關(guān)系的關(guān)聯(lián)度分析 由結(jié)果可知，指紋圖譜中各個(gè)色譜峰所代表的化學(xué)成分與抗炎作用具有一定的關(guān)聯(lián)（關(guān)聯(lián)度均大于0.53），表明雷公藤多苷片的抗炎作用是其化學(xué)成分群共同作用的結(jié)果。依據(jù)關(guān)聯(lián)度的大小，各成分對(duì)抗炎作用貢獻(xiàn)大小的順序?yàn)?＞6＞3＞5＞1，10＞4＞8＞2，11＞7，其中1號(hào)峰為雷公藤甲素，3號(hào)峰為雷公藤內(nèi)酯酮，11號(hào)峰為雷公藤次堿。9和6號(hào)峰的關(guān)聯(lián)度均大于0.77，表明其所代表的化學(xué)成分與抗炎作用的關(guān)聯(lián)性較大。

3 討論

雷公藤制劑化學(xué)成分多，結(jié)構(gòu)復(fù)雜，分析起來難度較大。在試驗(yàn)的過程中以指紋峰數(shù)目和分離度為指標(biāo)分別對(duì)色譜柱、洗脫程序、檢測(cè)波長(zhǎng)、流動(dòng)相、柱溫等色譜條件進(jìn)行了優(yōu)化，將不同廠家的雷公藤制劑供試品溶液應(yīng)用梯度洗脫，使得其中的化學(xué)成分得以分離。

表2　不同樣品共有峰峰面積與關(guān)聯(lián)度

對(duì)流動(dòng)相系統(tǒng)進(jìn)行選擇時(shí)，由于甲醇在203 nm下有較大吸收，而雷公藤制劑中大多數(shù)有效成分均存在末端吸收，因此選擇乙腈作為流動(dòng)相，對(duì)乙腈-水、乙腈-0.1％磷酸、乙腈-0.1％冰醋酸、乙腈-0.1％磷酸-0.2％三乙胺［5-8］系統(tǒng)進(jìn)行選擇，發(fā)現(xiàn)乙腈-水系統(tǒng)作為流動(dòng)相分離效果最好，并對(duì)幾種不同固相萃取方法:中性氧化鋁柱、硅膠柱、MAX柱、HLB柱以及基質(zhì)分散固相萃取方法進(jìn)行比較。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，中性氧化鋁柱能較好的將有效成分保留且能使指紋峰的分離度達(dá)到要求；因此選擇中性氧化鋁柱進(jìn)行萃取。

抗炎藥效研究選擇的是二甲苯致小鼠耳腫脹模型，經(jīng)過預(yù)試驗(yàn)選擇了藥效較好的劑量6 mg/kg，選擇該劑量考察各廠家雷公藤制劑對(duì)耳腫脹的影響。結(jié)果顯示，不同廠家雷公藤制劑樣品均有抑制小鼠耳腫脹的作用且作用強(qiáng)度不同。

目前中藥譜效關(guān)系學(xué)主要應(yīng)用于單味藥材的質(zhì)量評(píng)價(jià)和中藥復(fù)方的藥效物質(zhì)基礎(chǔ)這兩方面［9］。用于譜效分析的方法有相關(guān)分析、聚類分析、灰色關(guān)聯(lián)度分析、回歸分析、主成分分析等［10］。灰色關(guān)聯(lián)度分析來自灰色系統(tǒng)理論，基本思想是一種相對(duì)性的排序分析，根據(jù)序列曲線幾何形狀的相似程度來判斷其聯(lián)系是否緊密。如果一組幾何曲線形狀越相似，則關(guān)聯(lián)度越大，反之則越小，由此從所考察的復(fù)雜系統(tǒng)中找出主次因素，為系統(tǒng)綜合決策及提高綜合效益提供信息。也就是說兩者在發(fā)展過程中相對(duì)變化基本一致，則認(rèn)為兩者關(guān)聯(lián)度大，反之，兩者關(guān)聯(lián)度?。?1］。

本研究采用灰色關(guān)聯(lián)度分析法對(duì)指紋圖譜共有峰峰面積和藥效數(shù)據(jù)分析，結(jié)果表明指紋圖譜中11個(gè)共有峰所代表的化學(xué)成分與抗炎藥效的關(guān)聯(lián)度均大于0.5，說明這11個(gè)峰均與藥效有關(guān)，證明雷公藤的藥效是多成分共同起效的結(jié)果。其中6和9號(hào)峰的關(guān)聯(lián)度大于平均關(guān)聯(lián)度（0.59），是11個(gè)共有成分中的主要藥效組分。再比較各個(gè)峰的變異系數(shù)（CV％），發(fā)現(xiàn)除了11號(hào)峰變異系數(shù)較?。?.8％）外，不同廠家雷公藤制劑其它峰變異較大，提示不同廠家雷公藤制劑主要藥效組分的差異可能是造成藥效（腫脹度）差異的主要原因。

本研究采用灰色關(guān)聯(lián)度分析法建立了雷公藤制劑的指紋圖譜與其抗炎藥效的譜效關(guān)系，明確了指紋圖譜代表的化學(xué)成分與抗炎作用關(guān)聯(lián)的大小，后續(xù)的研究將對(duì)11個(gè)共有峰進(jìn)行質(zhì)譜的分析，表征具體抗炎作用的物質(zhì)成分，為進(jìn)一步對(duì)其它藥效物質(zhì)基礎(chǔ)的深入研究和雷公藤的質(zhì)量控制提供借鑒。

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*通信作者:宋洪濤（1968—），男，博士，主任藥師，博士生導(dǎo)師，研究方向?yàn)樗巹W(xué)和臨床藥學(xué)。Te1:（0591）22859459，E-mai1: sohoto@viP.163.com

作者簡(jiǎn)介:劉雪梅（1987—），女，碩士生，從事藥物新劑型與制劑新技術(shù)。Te1:（0591）22859972，E-mai1: 496294479@qq.com

基金項(xiàng)目:福建省科技計(jì)劃重大項(xiàng)目（2012I1001）

收稿日期:2014-12-24

中圖分類號(hào):R285.5

文獻(xiàn)標(biāo)志碼:B

文章編號(hào):1001-1528（2016）02-0425-03