西洋參莖葉皂苷保護(hù)大鼠腦缺血再灌注損傷的作用

劉 松， 金梅香， 譚興文

（吉林省人民醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科，吉林長(zhǎng)春130000）

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西洋參莖葉皂苷保護(hù)大鼠腦缺血再灌注損傷的作用

劉 松， 金梅香， 譚興文

（吉林省人民醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科，吉林長(zhǎng)春130000）

摘要:目的 探討西洋參莖葉皂苷（PQS）預(yù)處理對(duì)大鼠腦缺血再灌注損傷的保護(hù)作用及可能機(jī)制。方法 大鼠分別灌胃給予200 mg/（kg·d）和100 mg/（kg·d）PQS，15 d后，采用Longa改良法建立大鼠腦缺血再灌注模型；計(jì)算PQS對(duì)大鼠神經(jīng)功能評(píng)分及腦梗死面積比的影響，檢測(cè)PQS對(duì)血清腫瘤壞死因子-α（TNF-α）和白細(xì)胞介素-10（IL-10）水平的影響，評(píng)價(jià)PQS對(duì)腦組織谷胱甘肽過(guò)氧化物酶（GSH-Px）、超氧化物歧化酶（SOD）活性及丙二醛（MDA）含有量的影響。結(jié)果 PQS可以降低大鼠神經(jīng)功能評(píng)分及腦組織梗塞面積比（P＜0.05或P＜0.01）；PQS也可以降低血清中TNF-α水平，升高IL-10水平（P＜0.01）；同時(shí)，PQS能夠升高腦組織中GSH-Px和SOD活性，降低MDA含有量（P＜0.01）。結(jié)論 PQS預(yù)處理能夠有效的減弱腦缺血再灌注導(dǎo)致的損傷，該作用與抑制腦缺血再灌注引起的炎癥反應(yīng)及氧化損傷有關(guān)。

關(guān)鍵詞:西洋參莖葉皂苷；缺血再灌注；腦；預(yù)處理

dol:10.3969/j.issn.1001-1528.2016.02.040

腦血管疾病是導(dǎo)致人類(lèi)死亡的三大病因之一，其中局灶性腦缺血在各類(lèi)腦血管疾病中最為常見(jiàn)，具有發(fā)病率高、致殘率高、死亡率高的特點(diǎn)［1］。治療腦缺血性損傷的首要原則是盡早恢復(fù)血液再灌注。而研究發(fā)現(xiàn)，腦缺血后的血流恢復(fù)可引起腦組織及功能受損，即腦缺血再灌注損傷［2］。因此，預(yù)防和治療腦缺血再灌注損傷已成為防治缺血性腦血管疾病的關(guān)鍵。PQS是西洋參中的主要活性成分，具有增強(qiáng)免疫力、抗腫瘤及抗心肌缺血再灌注損傷等作用，但對(duì)腦缺血再灌注損傷的保護(hù)作用及機(jī)制研究較少［3］。本研究擬通過(guò)建立大鼠腦缺血再灌注損傷模型，觀察PQS對(duì)大鼠腦缺血再灌注損傷的保護(hù)作用，并初步探討其作用機(jī)制，為PQS應(yīng)用于防治缺血性腦血管疾病提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與儀器

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 Wistar大鼠，雄性，體質(zhì)量（200±20）g，購(gòu)于北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司，許可證號(hào)SCXK（京2012-0001）。

1.2 藥品和試劑 PQS購(gòu)于吉林省集安益盛藥業(yè)股份有限公司，純度為93％，批號(hào)130524；尼莫地平（德國(guó)拜耳公司，30 mg/片，批號(hào)130522）；TNF-α和IL-10檢測(cè)試劑盒購(gòu)自美國(guó)R&D公司；GSH-Px、SOD和MDA檢測(cè)試劑盒采用南京建成生物工程研究所產(chǎn)品；其余試劑為國(guó)產(chǎn)分析純。

1.3 儀器 RM6240型生理記錄儀（成都儀器廠）；顯微手術(shù)器械（浙江寧波醫(yī)用縫針廠）；UNICO LTV 2000型紫外分光光度計(jì)（尤尼柯中國(guó)儀器有限公司）。

2 方法

2.1 分組、給藥及模型建立 雄性Wistar大鼠隨機(jī)分為假手術(shù)組、模型組、尼莫地平組（15 mg/kg）、PQS低劑量組（100 mg/kg）和PQS高劑量組（200 mg/kg），每組8只。PQS給藥組連續(xù)灌胃給藥15 d，1次/d。假手術(shù)組與模型組灌胃給予相同體積的生理鹽水。

采用Longa改良法［4］建立大鼠腦缺血再灌注模型，灌胃給藥15 d后，將麻醉好的大鼠仰臥固定，頸部切口，鈍性分離并暴露右側(cè)頸總動(dòng)脈，在結(jié)扎上端距頸總動(dòng)脈分叉5 mm處剪一小口，插入一尖端光滑、長(zhǎng)50 mm、直徑0.23 mm，并在22 mm處作標(biāo)記的尼龍漁線，當(dāng)感到有輕微阻力并到達(dá)標(biāo)記處時(shí)，扎緊并固定尼龍漁線；結(jié)扎2 h后，拔出尼龍漁線15 mm進(jìn)行再灌注；假手術(shù)組不插線，其余步驟同上，術(shù)中應(yīng)保持大鼠肛溫37～38℃。

2.2 神經(jīng)功能評(píng)分 參照Bederon 4分制評(píng)分方法［5］，在實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，對(duì)模型大鼠神經(jīng)功能進(jìn)行評(píng)分。無(wú)神經(jīng)系統(tǒng)損傷癥狀者記為“0”分；不能完全伸展對(duì)側(cè)前爪者記為“1”分；不轉(zhuǎn)圈、伴有前爪屈曲對(duì)側(cè)壓有抵抗者記為“2”分；向左側(cè)轉(zhuǎn)圈、伴有前爪屈曲對(duì)側(cè)壓有抵抗者記為“3”分；行走時(shí)無(wú)自發(fā)活動(dòng)或死亡記為“4”分。

2.3 腦梗塞面積比的計(jì)算 斷頭處死大鼠，將大腦完整取出后，冰凍5 min；經(jīng)連續(xù)2 mm冠狀切片后，在2，3，5-氯化三苯基四氮唑（TTC，2％）溶液中染色，37℃恒溫孵育30 min，用多聚甲醛（4％）固定24 h。經(jīng)TTC染色后，用美國(guó)NIH公司的Image J 1.41圖像分析軟件分別檢測(cè)著色部分和非著色部分面積，計(jì)算腦梗塞面積比。

2.4 血清中TNF-α和IL-10水平檢測(cè) 實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，頸總動(dòng)脈取血4 mL，加肝素，1 500 r/min離心10 min，收集血清，采用酶聯(lián)免疫吸附法（ELISA）法測(cè)定TNF-α和IL-10含有量，具體操作按試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。

2.5 腦組織中GSH-Px、SOD活性和MDA含有量檢測(cè) 實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，斷頭取腦，取缺血再灌注側(cè)大腦，用濾紙吸去殘血，取0.2 g腦組織，剪碎后，冰水浴下加入細(xì)胞裂解液，高速勻漿，提取腦組織總蛋白，靜置、離心后取上清，采用化學(xué)比色法測(cè)定腦組織中GSH-Px、SOD活性和MDA含有量。

3 結(jié)果

3.1 PQS對(duì)大鼠神經(jīng)功能評(píng)分及腦梗塞面積比的影響 尼莫地平組及PQS高、低劑量組與模型組比較，均能顯著降低Bederon評(píng)分值，改善腦缺血再灌注大鼠的神經(jīng)功能障礙（P＜0.01）。大鼠大腦中動(dòng)脈缺血24 h再灌注2 h后有明顯的腦梗塞發(fā)生，而尼莫地平組及PQS高、低劑量組均可明顯降低缺血再灌注后的腦梗塞面積比，與模型組比較，具有顯著性差異（P＜0.05或P＜0.01）。結(jié)果見(jiàn)表1。

表1　PQS對(duì)大鼠神經(jīng)功能評(píng)分及腦梗塞面積比的影響（x ±s，n=8）

3.2 PQS對(duì)大鼠血清TNF-α和IL-10水平的影響 尼莫地平組及高、低劑量PQS組均能使缺血再灌注損傷大鼠血清中TNF-α水平下降，與模型組比較，具有顯著性差異（P＜0.01）；而與模型組比較，尼莫地平組及高、低劑量PQS組明顯升高缺血再灌注損傷大鼠血清中IL-10水平（P＜0.01）。結(jié)果見(jiàn)表2。

表2　PQS對(duì)大鼠大鼠血清TNF-α和I L-1 0水平的影響（±s，n=8）

表2　PQS對(duì)大鼠大鼠血清TNF-α和I L-1 0水平的影響（±s，n=8）

注:與假手術(shù)組比較，#P＜0.05，##P＜0.01；與模型組比較，*P＜0.05，**P＜0.01

組別　　劑量/ （mg·kg-1）TNF-α/ （ng·L-1）IL-10/ （ng·L-1）假手術(shù)組　　—　7.43±1.43　 263.14±13.39模型組　　—　17.75±2.03##　126.29±13.62##尼莫地平組　15　8.14±1.25**　240.17±16.24**PQS高劑量組　200　9.27±1.38**　217.41±17.45**PQS低劑量組　100　 11.64±1.32**　172.77±20.82**

3.3 PQS對(duì)大鼠腦組織中GSH-Px、SOD活性和MDA含有量的影響 尼莫地平組及高、低劑量PQS組均能使缺血再灌注損傷大鼠腦組織GSH-Px和SOD活性升高，與模型組比較，具有顯著性差異（P＜0.01）；而與模型組比較，尼莫地平組及高、低劑量PQS組明顯降低缺血再灌注損傷大鼠腦組織MDA含有量（P＜0.01）。結(jié)果見(jiàn)表3。

表3　PQS對(duì)大鼠腦組織GSH-Px、S 0 D活性和MDA含有量的影響（±s，n=8）

表3　PQS對(duì)大鼠腦組織GSH-Px、S 0 D活性和MDA含有量的影響（±s，n=8）

注:與假手術(shù)組比較，#P＜0.05，##P＜0.01；與模型組比較，*P＜0.05，**P＜0.01

組別　　劑量/（mg·kg-1）　GSH-Px/（U·mg Prot-1）　SOD/（U·mg Prot-1）　MDA/（nmo1·mg Prot-1）假手術(shù)組　　—　92.11±6.05　134.78±15.29　5.63±0.96模型組　　—　56.29±7.14##　98.64±12.52##　11.65±1.54##尼莫地平組　15　86.37±6.84**　130.32±14.86**　6.24±0.82**PQS高劑量組　200　81.42±6.57**　124.38±13.33**　6.85±0.86**PQS低劑量組　100　70.13±7.45**　115.17±11.71**　7.16±1.21**

4 討論

采用線栓法構(gòu)建局灶性腦缺血再灌注模型，可以很好的模擬人類(lèi)大腦中動(dòng)脈阻塞腦卒中的病理過(guò)程，該模型由Koizumi首創(chuàng)，并經(jīng)Longa改良，具有成功率高、操作簡(jiǎn)單、結(jié)果穩(wěn)定、術(shù)后感染少等優(yōu)點(diǎn)，目前已成為缺血性腦血管病研究中最為常用的經(jīng)典模型之一［6］。神經(jīng)功能缺陷評(píng)分是建模成功的標(biāo)志，同時(shí)也是反映藥物對(duì)腦缺血再灌注損傷保護(hù)作用的重要指標(biāo)［7］。本實(shí)驗(yàn)采用Bederon 4分制評(píng)分方法考察了PQS對(duì)腦缺血再灌注大鼠神經(jīng)功能損害的影響，結(jié)果證實(shí)，PQS高、低劑量組與模型組比較，均能顯著降低Bederon評(píng)分值，改善腦缺血再灌注大鼠的神經(jīng)功能障礙（P＜0.01）。腦梗死面積比是評(píng)價(jià)腦缺血再灌注損傷最常用的客觀指標(biāo)。TTC染色法是目前國(guó)內(nèi)外學(xué)者普遍采用的檢測(cè)腦缺血再灌注損傷梗死區(qū)域的方法［8］。將大鼠腦組織切片放入TTC溶液中，TTC溶液可以使腦梗死灶不染色，呈現(xiàn)蒼白色，而正常組織染為紅色。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，PQS高、低劑量組可明顯降低缺血再灌注后的腦組織梗塞面積比，與模型組比較，具有顯著性差異（P＜0.05或P＜0.01）。PQS具有益氣養(yǎng)心及和血的功效，在臨床上主要用于冠心病、心絞痛等疾病的治療［9-10］。而本研究的結(jié)果證實(shí)了PQS預(yù)處理對(duì)大鼠腦缺血再灌注損傷具有一定的保護(hù)作用，此結(jié)果將為PQS用于缺血性腦血管疾病的防治提供一定的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

炎癥反應(yīng)是造成腦缺血再灌注損傷的重要原因之一，多種細(xì)胞因子和炎癥細(xì)胞均參與了炎癥反應(yīng)。研究表明［11］，當(dāng)腦缺血再灌注損傷發(fā)生后數(shù)小時(shí)內(nèi)，炎癥因子表達(dá)顯著增加，引起腦組織損傷，進(jìn)而導(dǎo)致氧自由基產(chǎn)生、血管舒縮性改變、細(xì)胞毒性酶釋放和微血管閉塞等。在腦缺血再灌注損傷中，TNF-α和IL-10等炎癥因子的表達(dá)量可以直接反應(yīng)炎癥反應(yīng)的發(fā)生水平［12］。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，PQS可以降低腦缺血再灌注模型大鼠血清中TNF-α水平，升高IL-10水平（P＜0.01），此結(jié)果表明PQS可以抑制炎癥反應(yīng)的發(fā)生。氧化損傷也是目前公認(rèn)的腦缺血再灌損傷的重要機(jī)制之一，缺血可以使ATP匱乏，引起線粒體功能下降，使電子傳遞鏈?zhǔn)軗p，導(dǎo)致活性氧產(chǎn)生增加。GSHPx、SOD活性及MDA含有量與活性氧的產(chǎn)生密切相關(guān)，可以反映缺血組織氧化損傷程度［13］。本研究證實(shí)，PQS能夠提高腦缺血再灌注損傷大鼠腦組織中GSH-Px和SOD活性，降低MDA含有量，表明PQS可以在一定程度上起到抗氧化損傷的作用。

總之，通過(guò)以上研究結(jié)果表明，PQS預(yù)處理能夠有效的減弱腦缺血再灌注引起的損傷，該作用與抑制腦缺血再灌注引起的炎癥反應(yīng)及氧化損傷有關(guān)。

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作者簡(jiǎn)介:劉 松（1981—），男，主治醫(yī)師，從事腦血管病的診斷與治療研究。Te1:（0431）85595280，E-mai1: 1iusongcc@126.com

收稿日期:2014-12-21

中圖分類(lèi)號(hào):R285.5

文獻(xiàn)標(biāo)志碼:B

文章編號(hào):1001-1528（2016）02-0418-04