藏藥四味辣根菜湯散對大鼠心肌缺血再灌注損傷的保護作用

保善錄， 陳湘宏， 李永芳， 段雅彬， 熱增才旦， 姚星辰， 孫 娟， 王津慧

（青海大學醫(yī)學院，青海西寧810001）

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藏藥四味辣根菜湯散對大鼠心肌缺血再灌注損傷的保護作用

保善錄， 陳湘宏， 李永芳， 段雅彬， 熱增才旦， 姚星辰， 孫 娟， 王津慧*

（青海大學醫(yī)學院，青海西寧810001）

摘要:目的 探討藏藥四味辣根菜湯散對大鼠心肌缺血再灌注損傷的保護作用。方法 48只SPF級Wistar雄性大鼠隨機分為假手術組，缺血再灌注模型組，陽性丹參［1.75 g/（kg·d）］組，四味辣根菜湯散低［0.7 g/（kg·d）］、中［1.4 g/（kg·d）］、高［2.1 g/（kg·d）］劑量組。灌胃給藥10 d后采用結(jié)扎大鼠左冠狀動脈前降支方法制備心肌缺血再灌注模型，缺血30 min，再灌注90 min。假手術組只穿線不結(jié)扎左冠狀動脈。并觀察大鼠心電圖的變化。再灌注末腹主動脈取血，檢測血清中肌酸激酶（CK）和乳酸脫氫酶（LDH）活性，肌鈣蛋白1（cTn1）的量，丙二醛（MDA）的量，超氧化物歧化酶（SOD）和谷胱甘肽過氧化物酶（GSH-Px）活力，透射電鏡觀察左心室形態(tài)。結(jié)果與模型組比較，四味辣根菜湯散給藥組能降低大鼠血CK、LDH的釋放（P＜0.05），降低cTn1水平（P＜0.05），可升高SOD（P＜0.05），降低MDA的量（P＜0.05），藏藥四味辣根菜湯散高、中劑量組能明顯減輕缺血再灌注損傷區(qū)域心肌超微結(jié)構(gòu)線粒體的形態(tài)。結(jié)論 四味辣根菜湯散對大鼠缺血再灌注損傷的心肌具有保護作用。

關鍵詞:四味辣根菜湯散；心肌缺血再灌注；清除自由基；線粒體

dol:10.3969/j.issn.1001-1528.2016.02.039

由于高寒缺氧，血液黏稠度高，加之飲食結(jié)構(gòu)不合理，心肌缺血疾病在青藏高原地區(qū)多發(fā)。因此冠脈內(nèi)溶栓術、冠脈內(nèi)球囊擴張血管成形術及體外循環(huán)心內(nèi)直視手術等手術成為首選。但冠狀動脈再通后易造成缺血再灌注損傷，所以心肌缺血再灌注損傷日益受到重視，藏藥四味辣根菜湯散在改善心肌缺血，預防治療再灌注損傷顯示出重要的作用［1］。藏藥四味辣根菜湯散系傳統(tǒng)藏成藥，藏藥名為索洛西湯，由高山辣根菜、紫草茸、狹葉紅景天、甘草組成。藏醫(yī)經(jīng)典著作中對其功效的記載為:清熱滋陰、涼血止血。主要用于治療發(fā)燒、氣短、目赤、唇舌及腮頰均發(fā)紫紺、喉堵聲不揚、上體腔脹滿、呼吸喘急、咯吐血痰為主的胸腔內(nèi)惡血泛、心肺腫脹等癥狀［2-4］。本研究主要通過現(xiàn)代藥理實驗方法進一步證實并探討其可能的作用機制，為藏藥四味辣根菜湯散的臨床應用提供理論依據(jù)。

1 材料

1.1 藥品 四味辣根菜湯散由青海省藏醫(yī)院制劑科提供，批號20130607；丹參由毫州市遠光中藥飲片廠生產(chǎn)，批號20140701。

1.2 試劑 檢測所用的試劑盒全部購自于南京建成生物工程研究所，包括CK（肌酸激酶），批號20141217；LDH（乳酸脫氫酶），批號20141218；SOD（超氧化物歧化酶），批號20141204；MDA（丙二醛），批號20141207；GSH-Px（谷胱甘肽過氧化物酶），批號20141205；cTn1（肌鈣蛋白1），批號20141203。

1.3 儀器 BL-420S生物機能實驗系統(tǒng)（成都泰盟科技有限公司）；HX-300S動物呼吸機（成都泰盟科技有限公司）；DNW-9602酶標分析儀（北京普朗新技術有限公司）；UV-2550紫外分光光度計（日本島津公司）；H-600IV型透射電鏡，（日本日立公司）；80-2離心機（上海光學儀器廠）；自制氣管玻璃插管；自制0.8 mm硅膠管。

1.4 動物 Wistar雄性大鼠，SPF級，8周齡，體質(zhì)量（240±20）g，購于蘭州大學實驗動物中心，合格證號: SCXK（甘）2013-0002；在青海大學醫(yī)學院實驗動物中心分籠飼養(yǎng)，每籠8只；自由飲水，自由食大鼠維持飼料；室溫（23±2）℃，光照明暗12 h交替；適應性喂養(yǎng)3 d。

2 方法

2.1 藥物提取 將四味辣根菜湯散加水浸泡2 h，煎煮2 h，過濾，加水重復上述過程3次，合并3次煎煮液、過濾、濃縮至50％（相當于生藥0.5 g/mL）；丹參水提液制備方法同四味辣根菜湯散水提液；4℃避光保存?zhèn)溆谩?/p>

2.2 動物分組 48只大鼠隨機分為6組:四味辣根菜湯散高、中、低劑量組，陽性丹參對照組，缺血再灌注模型組及假手術組。

2.3 動物給藥 四味辣根菜湯散成人（60 kg）的劑量為每次4 g［即0.13 g/（kg·d）］，2次/d。低、中、高劑量組分別于成人劑量的5、10、15倍［大概為0.7、1.4和2.1 g/（kg·d）］，陽性對照組給予丹參1.75 g/（kg·d）。假手術組和模型組灌胃等容積生理鹽水，劑量為2 mm×2 mm），并用3％戊二醛預固定，1％四氧化鋨再固定，丙酮逐級脫水，EPon812包埋，半薄切片光學定位，超薄切片，醋酸鈾及櫞酸鉛雙重染色，日立H-600IV型透射電鏡觀察并拍照。

2.6 統(tǒng)計學分析 對數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計處理選用SPASS 17.0軟件，檢測數(shù)據(jù)都以均數(shù)±標準差（±s）的格式表示，多組之間的比較，用單因素ANOVA方差分析，兩兩組間的比較，用LSD方法，檢驗水準α=0.05。 1.4 g/（kg·d）。各組灌胃1次/d，連續(xù)10 d。

2.4 缺血再灌注模型制備 （1）Wistar大鼠術前禁食6 h［5］，20％烏拉坦按5 mL/kg對大鼠實施腹腔注射麻醉，仰臥位固定，打開電腦及BL-420S生物機能實驗信號采集系統(tǒng)，連接心電圖，記錄Ⅱ?qū)?lián)心電圖［6］。（2）自制玻璃氣管插管連接小動物呼吸機，進行機械通氣。（3）在胸骨左緣0.5 cm處剪開胸部皮膚，于2～4肋間剪斷第3、4肋并分離肋間肌，剪開胸膜，使心臟充分暴露，分離開心包膜。于左心耳與肺動脈圓錐交界處下約3～4 cm處進針深度為1.0～1.5 mm，寬度為2～3 mm，穿5-0非吸收性縫合線結(jié)扎左冠狀動脈左前降支，適應5 min，然后在結(jié)扎線與冠狀動脈之間放置一根直徑約0.8 mm，長約1 cm的聚乙烯管，通過拉緊結(jié)扎線，迫使聚乙烯管壓迫于冠狀動脈之上，從而引起冠脈閉塞，造成急性心肌缺血模型。（4）以同步心電圖QRS波群增高、增寬、ST段抬高為結(jié)扎成功標志［7］。（5）缺血30 min后用眼科剪剪斷聚乙烯管及結(jié)扎線進行再灌注，以心臟表面顏色轉(zhuǎn)紅、抬高的S-T段下降在1/2以上為再灌注成功標志，再灌注90 min［8-9］。假手術組的動物手術過程與模型組相同，但只穿線不結(jié)扎左冠狀動脈。

2.5 指標檢測

2.5.1 血清指標測定 再灌注末立即行腹主動脈取血5 mL以上，4 000 r/min離心10 min，取上清液-80℃冰箱冷藏備用。CK、LDH用微量酶標法，MDA用TBA法，SOD用WST-1法，GSH-Px和1cTn1用酶標法。嚴格規(guī)范各檢測程序。

2.5.2 組織觀察 隨機摘取各組4只大鼠心臟，迅速切取左心室與心尖部中點左心室前壁小塊心?。w積為2 mm×

3 結(jié)果

3.1 對大鼠血清中CK和LDH活性的影響 結(jié)果見表1，模型組大鼠血清CK和LDH釋放明顯多于假手術組（P＜0.01）。四味辣根菜湯散各劑量組與模型組比較，血清中CK和LDH的釋放明顯減少（P＜0.05）。

表1　各組大鼠血清CK和LDH活力比較（±s）

表1　各組大鼠血清CK和LDH活力比較（±s）

注:與模型組比較，▲P＜0.01，△P＜0.05

組別　n CK/（U·L-1）LDH/（U·L-1）假手術組　8 1.110±0.107▲862.33±30.56▲模型組　8 1.645±0.187 1 441.93±49.98陽性丹參組　8 0.705±0.195▲1 137.78±23.05▲四味辣根菜湯散高劑量組　8 1.234±0.127▲1 048.98±23.56▲四味辣根菜湯散中劑量組　8 1.351±0.199△1 236.46±41.38△四味辣根菜湯散低劑量組　8 1.383±0.101△1 340.42±42.62△

表2　各組大鼠血清中S 0 D、GSH-Px活力和MDA含有量比較（±s）

表2　各組大鼠血清中S 0 D、GSH-Px活力和MDA含有量比較（±s）

注:與模型組比較，▲P＜0.01，△P＜0.05

組別　n　SOD/（U·mL-1）　GSH-Px/（μmo1·L-1）　MDA/（μmo1·L-1）假手術組　8　449.03±22.69▲　3 291.93±51.40　1.92±0.72▲模型組　8　160.24±29.96　3 450.12±26.10　10.56±1.10陽性丹參組　8　332.05±23.87▲　3 022.61±52.89　5.21±0.95▲四味辣根菜湯散高劑量組　8　385.91±14.41▲　3 348.86±53.98　6.10±1.56▲四味辣根菜湯散中劑量組　8　371.79±13.00▲　3 039.26±51.89　7.25±1.86▲四味辣根菜湯散低劑量組　8　243.75±23.01▲　3 112.18±36.88　9.08±1.84△

3.2 對大鼠血清SOD、GSH-Px活性和MDA的量的影響結(jié)果見表2，模型組大鼠血清SOD的活性低于假手術組，MDA含有量增高（P＜0.01）。四味辣根菜湯散高、中、低劑量組與模型組比較，各組均能增加血清中超氧化物歧化酶SOD的活性，降低MDA的量（P＜0.05）。各組GSH-Px的活性無統(tǒng)計學意義。

3.3 對大鼠血清cTn1含有量的影響 結(jié)果見表3，大鼠血清cTn1的量明顯高于假手術組（P＜0.01）。四味辣根菜湯散高、中、低劑量組與模型組比較，均能減少血清中cTn1的量（P＜0.05）。

表3　各組大鼠血清c T n 1含有量比較（±s）

表3　各組大鼠血清c T n 1含有量比較（±s）

注:與模型組比較，▲P＜0.01，△P＜0.05

組別　n　cTn1/（Pg·mL-1）假手術組　8　158.53±10.06▲模型組　8　223.91±12.48陽性丹參組　8　127.06±9.60▲四味辣根菜湯散高劑量組　8　183.57±10.64▲四味辣根菜湯散中劑量組　8　183.59±11.30▲四味辣根菜湯散低劑量組　8　176.64±9.69▲

3.4 對大鼠心臟左心室組織進行超微結(jié)構(gòu)形態(tài)學觀察 如圖1所示，陽性丹參藥物組與藏藥四味辣根菜湯散高、中藥物組效果佳。圖1A假手術組:平滑肌纖維整齊，細胞核染色質(zhì)散布均勻，線粒體結(jié)構(gòu)清晰，個別線粒體有輕度腫脹TEM（透射電鏡）（10×103倍）。圖1B缺血再灌注模型組:可見平滑肌纖維排列紊亂，細胞核染色質(zhì)有固縮，細胞中大量線粒體腫脹，線粒體嵴變短、消失或變空（TEM，5×103倍）。圖1C丹參陽性對照組:平滑肌纖維整齊，細胞核染色質(zhì)分布均勻，線粒體結(jié)構(gòu)清晰（TEM，8×103倍）。圖1D藏藥四味辣根菜湯散高劑量組:平滑肌纖維排列整齊，細胞核染色質(zhì)分布均稱，線粒體結(jié)構(gòu)清晰（TEM，10×103倍）。圖1E藏藥四味辣根菜湯散中劑量組:心臟平滑肌纖維排列整齊，胞核染色質(zhì)分布均勻，線粒體結(jié)構(gòu)清晰（TEM，10×103倍）。圖1F藏藥四味辣根菜湯散低劑量組:平滑肌纖維排列整齊，胞核染色質(zhì)分布均勻，線粒體結(jié)構(gòu)清晰，個別心肌細胞核染色質(zhì)有固縮（TEM，10×103倍）。

圖1　各組大鼠心肌組織透射電鏡觀察圖

4 討論

手術治療心肌缺血疾病的過程中心肌缺血再灌注損傷（ischemia rePerfusion injury，IRI）的危害表現(xiàn)尤為突出。而藏藥四味辣根菜湯散在藏醫(yī)臨床上，廣泛應用于心肌缺血的疾病中。鑒于此，本實驗首先比較了模型組、假手術組和藏藥四味辣根菜湯散各組之間CK、LDH和cTn1的變化。因為CK與細胞內(nèi)的能量運轉(zhuǎn)、再生以及平滑肌收縮都有著直接關系，其可逆地催化肌酸與ATP之間的轉(zhuǎn)磷?；磻?，對診斷急性心肌梗死有較高價值［10］，LDH是一種糖酵解酶，可催化丙酮酸生成乳酸［11］。實驗組即藏藥四味辣根菜湯散高、中、低劑量組與模型組比較，血清中CK和LDH酶的漏出明顯減少，說明四味辣根菜湯散能夠明顯抑制肌酸與ATP之間的轉(zhuǎn)磷?；磻?，減緩LDH催化丙酮酸生成乳酸，從而改善心臟平滑肌的收縮功能。cTn1在體內(nèi)的表現(xiàn)形式有兩種，一是約有3％的cTn1游離于細胞質(zhì)漿中，二是大部分cTn1與心肌結(jié)構(gòu)蛋白結(jié)合，固定于肌原纖維上，當心肌細胞膜未遭破壞時，cTn1是不能透過細胞膜進入到血循環(huán)當中的［12-13］，這也正是在假手術組大鼠血清檢測過程中cTn1的量是很少的原因。但是，若因缺血、缺氧造成心肌細胞出現(xiàn)損傷時，游離狀態(tài)的cTn1首先釋放入血，隨著心肌細胞的不斷壞死、崩解和細胞結(jié)構(gòu)的破壞，結(jié)合狀態(tài)的cTn1會持續(xù)釋放入血，而實驗中藏藥四味辣根菜湯散組血清中cTn1的水平明顯低于模型組，說明藏藥四味辣根菜湯散可以抑制缺血再灌注對心肌細胞的損傷，減輕細胞結(jié)構(gòu)的的破壞及壞死程度，從而使cTn1釋放入血的量明顯降低。

心肌細胞中的線粒體（mitochondrion）是給心肌制造能量的結(jié)構(gòu)，被稱為“Power house”。缺血再灌注引起的損傷與線粒體結(jié)構(gòu)的完整性關系密切，所以心肌線粒體結(jié)構(gòu)的好壞是評價藥物是否有效的最有力、直接證據(jù)［14］。本實驗通過超微結(jié)構(gòu)顯示心肌缺血再灌注后線粒體發(fā)生的改變，并與模型組對比，看出藏藥四味辣根菜湯散高、中劑量組大鼠心臟平滑肌肌纖維排列較整齊，細胞核染色質(zhì)分布亦均勻，線粒體結(jié)構(gòu)大體完整，與假手術組大鼠心臟平滑肌纖維和線粒體結(jié)構(gòu)基本一致，說明藏藥四味辣根菜湯散可以保護心肌肌纖維和線粒體的完整性。各組大鼠心肌超微結(jié)構(gòu)的相互比較證明本次心肌缺血再灌注損傷模型的成功和藏藥四味辣根菜湯散對心肌缺血再灌注損傷大鼠有效。

藏藥四味辣根菜湯散高、中、低劑量灌胃給藥后，大鼠血清中SOD的活性與模型組比較均明顯提高，而MDA的量與模型組比較則顯著降低。這一結(jié)果充分說明藏藥四味辣根菜湯散可以抑制心肌因缺血再灌注損傷引起自由基的大量產(chǎn)生，增強自由基清除劑SOD的活性，從而使機體氧化與抗氧化系統(tǒng)保持相對的平衡［15］；另外，藏藥四味辣根菜湯散換可抑制生物膜上的不飽和脂肪酸發(fā)生脂質(zhì)過氧化、降低氧化產(chǎn)物MDA對細胞膜的攻擊、減輕其受損程度［16］，達到對心肌細胞的保護作用。

GSH-Px通過催化還原型谷胱甘肽對過氧化氫的還原反應，起保護心臟平滑肌細胞膜結(jié)構(gòu)完整及功能正常的作用［17-18］。通過對給藥組GSH-Px的活力檢測與模型組相比有降低，但無統(tǒng)計學意義，說明藏藥四味辣根菜湯散通過催化過氧化氫分解酶這一途徑干預心肌缺血再灌注損傷的作用是比較微弱的。

以上幾個心肌酶指標，抗缺氧和抗氧化指標及心肌肌纖維和線粒體超微結(jié)構(gòu)表明，藏藥四味辣根菜湯散對缺血再灌注損傷心肌的保護作用可能是通過促進抑制自由基的產(chǎn)生、增強自由基清除劑的功能、維持心肌細胞氧化和抗氧化的動態(tài)平衡、保護心肌線粒體結(jié)構(gòu)的完整性，在損傷時增強其氧化磷酸化能力，從而達到對大鼠心肌缺血再灌注損傷的保護作用。但藏藥四味辣根菜湯散干預的具體有效過程及信號傳導通路有待進一步研究。

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*通信作者:王津慧（1959-），女，教授，從事中藏藥藥理研究。Te1:（0971）6105910，E-mai1: qywjh59@163.com

作者簡介:保善錄（1989-）男，碩士生，從事中藏藥藥理研究。Te1: 15500545421，E-mai1: 305912664@qq.com

基金項目:青海省自然科學基金資助項目（2011-N-F19）

收稿日期:2015-05-23

中圖分類號:R285.5

文獻標志碼:B

文章編號:1001-1528（2016）02-0415-04