基于酯型生物堿含量變化選擇蒸制附片

譚茂蘭， 黃勤挽，2*， 肖 芳， 范潤勇， 王智磊， 易佳佳

（1.成都中醫(yī)藥大學藥學院，中藥材標準化教育部重點實驗室，四川省中藥資源系統(tǒng)研究與開發(fā)利用重點實驗室—省部共建國家重點實驗室培育基地，四川成都611137；2.國家中醫(yī)藥管理局中藥炮制技術重點研究室，四川成都611731）

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基于酯型生物堿含量變化選擇蒸制附片

譚茂蘭1， 黃勤挽1，2*， 肖 芳1， 范潤勇1， 王智磊1， 易佳佳1

（1.成都中醫(yī)藥大學藥學院，中藥材標準化教育部重點實驗室，四川省中藥資源系統(tǒng)研究與開發(fā)利用重點實驗室—省部共建國家重點實驗室培育基地，四川成都611137；2.國家中醫(yī)藥管理局中藥炮制技術重點研究室，四川成都611731）

摘要:目的 基于6種酯型生物堿含有量的變化，選擇合適的蒸制附片。方法 采用HPLC法，測定鮮附片、生附片、浸附片中3種雙酯類生物堿（中烏頭堿、烏頭堿、次烏頭堿）和3種單酯類生物堿（苯甲酰中烏頭堿、苯甲酰烏頭原堿、苯甲酰次烏頭原堿）的含有量。結果 蒸制過程中雙酯型生物堿的含有量迅速減少，而單酯型生物堿的含有量迅速增加，然后穩(wěn)定在一定水平，但隨蒸制時間延長會逐漸降低。結論 鮮附片更適合進行蒸制，蒸制時間以4～10 h為宜。

關鍵詞:鮮附片；生附片；浸附片；蒸制；酯型生物堿；HPLC

dol:10.3969/j.issn.1001-1528.2016.02.029

KEY W 0RDS: fresh-cut FuPian；dried-cut FuPian；soaked-cut FuPian；steaming；ester-tyPe a1ka1oids；HPLC

附子為毛茛科植物烏頭Aconitum carmichaeli Debx.的子根加工品，具有回陽救逆、補火助陽、散寒止痛功效，作為中藥毒效鮮明的代表，被歷代醫(yī)家視為“回陽救逆第一要藥”［1］，因其含多種烏頭堿類成分，毒性較強，故臨床多用其炮制品，其加工過程主要為洗凈、泡膽巴、煮、剝皮、切片、漂、蒸、曬。文獻［2-6］表明，在傳統(tǒng)加工過程中，較多水溶性成分（如毒效兼有的生物堿類）大量流失，導致藥效藥性受到一定影響，而且加工時膽巴的使用也在存爭議。研究顯示［7-8］，附子的毒性成分主要為二萜雙酯類生物堿，因其性質不穩(wěn)定，在加熱條件下易水解為低毒或無毒的產(chǎn)物（如單酯型、醇胺型生物堿），也可發(fā)生酯交換反應生成難溶于水的物質，從而減少毒性。為避免較多有效成分在加工過程中隨水流失，故蒸制和炒制成為較受認同的附子炮制方法［9-10］。

目前，各類蒸附片并未對蒸制前附片的投料形式進行規(guī)定，也未見不同投料形式對蒸附片生物堿類成分含有量變化、成品性狀差異等方面的相關報道［11-12］。本實驗以不同狀態(tài)的3種附片，即鮮切附片、鮮切70℃下干燥附片、水浸12 h生附片（簡稱鮮附片、生附片、浸附片）為對象，進行常壓蒸制，根據(jù)《中國藥典》2010年版附子含有量測定相關規(guī)定，分別測定3種雙酯類毒性成分（中烏頭堿、烏頭堿、次烏頭堿）和3種單酯類成分（苯甲酰中烏頭堿、苯甲酰烏頭原堿、苯甲酰次烏頭原堿）在不同蒸制時間點的含有量，以研究不同狀態(tài)附片在常壓蒸制過程中6種酯型生物堿含有量的變化規(guī)律，初步探討其在減毒存效方面的差異，確定適合常壓蒸附片蒸制加工的投料形式和蒸制時間，完善相關炮制工藝。

1 儀器與試藥

島津LC-20A高效液相色譜儀，包括二元梯度泵、柱溫箱、PDA檢測器、自動進樣器、Labso1ution工作站（日本島津公司）；BSA224S、BP211D電子分析天平（十萬分之一，德國Sartorius公司）；SHZ-DⅢ型循環(huán)水式多用真空泵（鞏義市予華儀器有限責任公司）；雷磁PHS-3C型PH計（上海儀電科學儀器股份有限公司）；DHG-9240型電熱恒溫鼓風干燥箱（上海將任實驗設備有限公司）；FW135型中草藥粉碎機（上海隆拓儀器設備有限公司）；PS-80型超聲波清洗機（深圳市潔康洗凈電器有限公司）；UPH-I-10T型優(yōu)普超純水器（成都超純科技有限公司）；RJTGL-16C型高速離心機（無錫瑞江分析儀器有限公司）。

泥附子（四川江油中壩附子科技發(fā)展有限公司），經(jīng)成都中醫(yī)藥大學盧先明教授鑒定為毛茛科植物烏頭Aconitum carmichaeli Debx.的子根，貯存于-20℃冰箱中備用。苯甲酰中烏頭堿（批號120915）、苯甲酰烏頭原堿（批號121109）、苯甲酰次烏頭原堿（批號121209）、中烏頭堿（批號121124）、烏頭堿（批號121026）、次烏頭堿（批號121218）對照品（成都普菲德生物技術有限公司，純度均≥98％）。乙腈為色譜純（美國Sigma-A1drich公司）；氨水、異丙醇、乙酸乙酯、二氯甲烷、乙酸銨均為分析純。

2 方法與結果

2.1 藥材處理 取泥附子適量，解凍、洗凈泥沙后縱切成片，厚度5 mm左右，均分為3份。取一份作為鮮附片，置于蒸鍋上進行蒸制，圓氣計時，保持鍋內水沸騰和一定水量，分別于0、0.5、1、1.5、2、2.5、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12 h取出適量，室溫下放涼后于打粉機中混勻，冷藏備用。剩下兩份于70℃烘箱中恒溫干燥，干燥后取一份作為生附片，同法進行蒸制和樣品處理；另一份參考江油中壩附子科技發(fā)展有限公司的蒸附片工藝，加入一定量水（沒過藥材表面）浸潤12 h，瀝去多余水分作為浸附片，同法進行蒸制和樣品處理。

2.2 色譜條件 Phenomenex Gemini色譜柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；柱溫30℃；流動相A為0.04 mo1/L乙酸銨（氨水調PH至8.5），流動相B為乙腈，梯度洗脫（0～20 min，35％～40％B；20～25 min，40％～45％B；25～40 min，45％～50％ B；40～50 min，50％～60％ B）；體積流量0.8 mL/min；檢測波長235 nm；進樣10 μL。對照品色譜圖見圖1，不同蒸制時間鮮附片樣品色譜圖見圖2。

1.苯甲酰中烏頭堿 2.苯甲酰烏頭原堿 3.苯甲酰次烏頭原堿4.中烏頭堿 5.烏頭堿 6.次烏頭堿1.benzoy1mesaconitine 2.benzoy1aconine 3.benzoy1hyPaconine 4.mesaconitine 5.aconitine 6.hyPaconitine圖1　6種酯型生物堿混合對照品的HP L C色譜圖Flg.1 HPLC chromatograms of slx ester-type alkalold m lxed reference substances

2.3 對照品溶液的制備 分別精密稱取苯甲酰中烏頭堿、苯甲酰烏頭原堿、苯甲酰次烏頭原堿、中烏頭堿、烏頭堿、次烏頭堿對照品適量，0.05％鹽酸-甲醇溶解，配制成每1 mL含苯甲酰中烏頭堿0.484 mg、苯甲酰烏頭原堿0.443 mg、苯甲酰次烏頭原堿0.430 mg、中烏頭堿0.398 mg、烏頭堿0.345 mg、次烏頭堿0.435 mg的原液。分別取苯甲酰中烏頭堿1 mL、苯甲酰烏頭原堿1 mL、苯甲酰次烏頭原堿1 mL、中烏頭堿3 mL、烏頭堿1 mL、次烏頭堿3 mL，置于同一10 mL量瓶中，0.05％鹽酸-甲醇稀釋至刻度，搖勻，得混合對照品溶液Ⅰ。精密吸取1 mL，置于10 mL量瓶中，0.05％鹽酸-甲醇稀釋至刻度，搖勻，得混合對照品Ⅱ。

圖2　不同蒸制時間鮮附片樣品的H P L C色譜圖（1～6同圖1?。〧lg.2 HPLC chromatograms of fresh-cut sllced aconlte sam ples ln dlfferent steam lng tlme （1～6 were same to Flg.1）

2.4 供試品溶液的制備［13]精密稱取不同狀態(tài)蒸制附片樣品2 g，置于具塞錐形瓶中，加氨試液3 mL，精密加入異丙醇-乙酸乙酯（1∶1）混合溶液50 mL，稱定質量，超聲（300 W、40 kHz、25℃以下）30 min，放冷，再稱定質量，異丙醇-乙酸乙酯（1∶1）混合溶液補足減失的質量，搖勻，濾過。精密量取續(xù)濾液25 mL，40℃以下減壓回收溶劑至干，往殘渣中精密加入0.05％鹽酸-甲醇溶液3 mL溶解，16 000 r/min離心10 min，取適量上清液，即得。各樣品平行制備2份。

2.5 供試品水分測定 按《中國藥典》2010年版（一部）附錄ⅨH水分測定法第一法（烘干法），測定各樣品中的水分，平行測定2份。

2.6 方法學考察結果

2.6.1 線性關系考察 精密吸取混合對照品溶液Ⅱ1、5、10 μL和Ⅰ5、10、20、40 μL，分別注入液相色譜儀，在“2.2”項色譜條件下進行測定，以進樣量（μg）為橫坐標（X），峰面積（A）為縱坐標（Y）繪制標準曲線，結果見表1。

表1　標準曲線方程及線性關系Tab.1 Standard curve equatlons and llnear relatlonsh lps

2.6.2 精密度試驗 精密吸取混合對照品溶液Ⅰ10 μL，在“2.2”項色譜條件下重復進樣6次，測定6種酯型生物堿的峰面積。結果，苯甲酰中烏頭堿、苯甲酰烏頭原堿、苯甲酰次烏頭原堿、中烏頭堿、烏頭堿、次烏頭堿的峰面積RSD分別為0.83％、1.1％、1.2％、1.0％、0.86％、1.3％，表明儀器精密度良好。

2.6.3 穩(wěn)定性試驗 取鮮附片蒸制0.5 h后的樣品1份，按“2.4”項下方法制備供試品溶液，在“2.2”項色譜條件下，分別于0、4、8、12、24 h進樣測定，記錄6種酯型生物堿的峰面積。結果，苯甲酰中烏頭堿、苯甲酰烏頭原堿、苯甲酰次烏頭原堿、中烏頭堿、烏頭堿、次烏頭堿的峰面積RSD分別為1.0％、1.2％、1.1％、1.4％、 1.2％、1.8％，表明溶液在24 h內穩(wěn)定。

2.6.4 重復性試驗 取鮮附片蒸制0.5 h后的樣品6份，按“2.4”項下方法制備供試品溶液，在“2.2”項色譜條件下測定，計算6種酯型生物堿的含有量。結果，苯甲酰中烏頭堿、苯甲酰烏頭原堿、苯甲酰次烏頭原堿、中烏頭堿、烏頭堿、次烏頭堿含有量的RSD分別為2.7％、2.2％、2.6％、2.2％、2.6％、1.8％，表明該方法重復性良好。

2.6.5 加樣回收試驗 取含有量已知的鮮附片蒸制0.5 h后的樣品6份，分別精密加入一定量的對照品原液（苯甲酰中烏頭堿0.6 mL、苯甲酰烏頭原堿0.1 mL、苯甲酰次烏頭原堿0.15 mL、中烏頭堿0.05 mL、烏頭堿0.2 mL、次烏頭堿0.05 mL），按“2.4”項下方法制備供試品溶液，在“2.2”項色譜條件下進樣5 μL，測定6種酯型生物堿的含有量，計算平均回收率和RSD，結果見表2。

表2　加樣回收率試驗結果Tab.2 Results of recovery tests

2.7 供試品含有量測定 在“2.2”項色譜條件下，測定苯甲酰中烏頭堿、苯甲酰烏頭原堿、苯甲酰次烏頭原堿、中烏頭堿、烏頭堿、次烏頭堿的峰面積，以標準曲線法計算含有量。按干燥品計，3種狀態(tài)附片的含有量測定結果分別見表3～5（各表中數(shù)據(jù)均由標準曲線線性范圍內的原始數(shù)據(jù)計算得出）。

表3　不同蒸制時間鮮附片中6種酯型生物堿的含有量（m g/g，n=2）Tab.3 Contents of slx ester-type alkalolds ln fresh-cut sllced aconlte ln dlfferent steam lng tlme（mg/g，n=2）

續(xù)表3　

表4　不同蒸制時間生附片中6種酯型生物堿的含有量（m g/g，n=2）Tab.4 Contents of slx ester-type alkalolds ln drled sllced aconlte ln d lfferent steam lng tlme（mg/g，n=2）

表5　不同蒸制時間浸附片中6種酯型生物堿的含有量（m g/g，n=2）Tab.5 Contents of slx ester-type alkalolds ln soaked sllced aconlte ln d lfferent steam lng tlme（mg/g，n=2）

3種單酯、3種雙酯的含有量總和見圖3、圖4。樣品的提取方法參照現(xiàn)行版藥典，色譜條件根據(jù)文獻［14］進行部分調整，考察了流動相A在不調PH和PH分別為8.5、9、10條件下對6種酯型生物堿分離效果的影響。考慮到樣品數(shù)量和烏頭堿的毒性，將流動相A調PH至8.5，此時其分離度較佳，分析時間較短。

圖3　3種單酯含有量總和的柱狀圖Flg.3 H lstogram s of the total contents of three monoester alkalolds

圖4　3種雙酯含有量總和的柱狀圖Flg.4 H lstograms of the total contents of three dlester alkalolds

由圖4可知，各狀態(tài)附片在蒸制過程中，雙酯型生物堿含有量的變化相似，均在蒸制0.5 h內顯著降低，然后逐漸減少至無法檢出。由圖3可知，單酯型生物堿含有量的變化較復雜，不同狀態(tài)附片之間存在一定差異，結合總體變化趨勢及雙酯型生物堿含有量變化，可將各狀態(tài)附片中3種單酯型生物堿含有量總和的變化分為3個階段:（1）轉化上升階段。單酯型生物堿含有量隨雙酯型生物堿的降低而逐漸升高，總和呈增長趨勢。鮮附片蒸制轉化的上升期為0～1.5 h，生附片和浸附片為0～2.5 h；（2）疊加反應階段。各狀態(tài)附片單酯型生物堿的含有量均繼上升期降低，再經(jīng)一段波動達一最大值后，穩(wěn)定在一定范圍內。鮮附片蒸制的疊加反應期在1.5～10 h之間，蒸制5 h達到最高；生附片在2.5～9 h之間，蒸制4 h達到最高；浸附片在2.5～10 h之間，蒸制7 h達到最高。此階段單酯型生物堿含有量的波動參考文獻［15］，推斷可能與其水解、酯交換［7］、雙酯型生物堿的水解等反應相關，是多個反應疊加的結果；（3）溶脹波動階段。各狀態(tài)附片中單酯型生物堿的含有量均出現(xiàn)先升后降的變化，鮮附片和浸附片蒸制的溶脹波動期是10～12 h，10～11 h含有量總和升高，11～12 h降低至蒸制結束；生附片是9～12 h，9～10 h含有量升高，然后降低至蒸制結束。此階段的波動原因除與酯型生物堿之間的轉化有關外，還可能與此時附片的形態(tài)有關。經(jīng)長時間蒸制后，各附片含水量均達到70％左右，表面均有較多的淀粉溶脹，推斷此時附片組織、細胞間的連接已被破壞，細胞通透性的增加有利于生物堿的溶出，而且各成分隨水汽損失的量亦有所增加，導致出現(xiàn)上述波動。單個生物堿含有量的變化規(guī)律與其總和類似，在此不再贅述。

另外，本實驗選擇以蒸制后的樣品直接混勻制樣，未經(jīng)干燥，減少了其他因素對生物堿含有量的影響，更能真實反映蒸制過程中6種生物堿的含量變化。

3 討論與結論

3種不同狀態(tài)附片的主要差異為初始含水量和組織間的緊密度。其中，鮮附片是附子的原本狀態(tài)；生附片含水量低，組織間緊密度高；浸附片含水量和組間緊密度則介于鮮附片和生附片之間，是人為處理附片最常見的狀態(tài)。在相同的蒸制條件下，對濕熱敏感的雙酯型生物堿反應接近，不同狀態(tài)附片均在蒸制1 h后，雙酯型生物堿的含有量達到現(xiàn)行版藥典要求（總和不得超過0.02％），雖然其減毒程度相近，但存效程度存在差異，鮮附片和浸附片雙酯型生物堿在蒸制3 h后均低于檢測限，而生附片則在11 h內持續(xù)檢出，說明附片蒸制時其減毒程度與物料的初始含水量和質地相關，保持一定初始含水量可增加附子的減毒程度。

單酯型生物堿作為雙酯型生物堿轉化的產(chǎn)物，其含有量的高低可說明附子解毒的程度，因其對熱穩(wěn)定，故也可反映附片成分的保留情況。3種附片中單酯型生物堿的含有量均在蒸制0.5 h后達到藥典要求（總和不得少于0.01％），說明減毒程度相當。各附片蒸制12 h后的含有量仍合格，說明蒸制能較好地保留附子成分，保證附子藥效。在蒸制過程中，生附片單酯型生物堿的含有量高于鮮附片，說明初始含水量越低，質地越緊密，單酯含有量保存越好，成分損失越少。

實驗顯示，生附片直接蒸制時因其質地緊密，導致水蒸汽穿透、滲入緩慢，其成分損失較少，單酯含有量保存較好，但其減毒程度也較低。而且，蒸制時其干濕程度不均，導致淀粉類成分溶脹也不均，附片呈稀糊狀，顏色偏深，并難以保持片型，所以常壓蒸附時不宜用生附片直接蒸制；鮮附片雙酯轉化快，轉化程度高，加工工序簡單，單酯含有量高，變化較穩(wěn)定，樣品的顏色和片型均較理想。樣品蒸制6 h干燥后，呈透明黃棕色角質樣，與黑順片類似，故常壓蒸制附片時建議以鮮附片進行投料；考慮到附子的保存和大量加工的需要，大生產(chǎn)可以浸附片投料蒸制，因其蒸制后片型也較好，蒸制6 h干燥后呈半透明或不透明黑棕色角質樣，與黑順片差異較大，但各生物堿含有量仍滿足藥典規(guī)定，只是加工工序較多、時間較長。

另外，浸附片存在浸潤時成分隨水分流失的情況，其單酯含有量總體水平低于鮮附片和生附片，所以應嚴格控制浸潤水量和時間。查閱相關資料發(fā)現(xiàn)，對生附片浸潤水量并未有明確的規(guī)定和研究，故本實驗在參考文獻［16］的基礎上，對生附片吸水量作了簡單考察，發(fā)現(xiàn)浸潤12 h時生附片的吸水量為1∶1，故建議浸潤加水量在1∶1～1∶1.5之間。以單酯型生物堿的含有量為指標，初步確定常壓蒸附片蒸制時間以4～10 h為宜，但最佳蒸制時間點還需深入考察。另外，以鮮附片和浸附片投料制備的蒸附片性狀的差異，藥效、毒性、藥性等方面是否與黑順片相近等問題也需進行進一步研究。

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Selectlon of sultable herbs for steam lng Fuplan based on the change of contents of ester-type alkalolds

TAN Mao-1an1， HUANG Qin-wan1，2*， XIAO Fang1， FAN Run-yong1， WANG Zhi-1ei1， YI Jia-jia1
（1.Collegeof Pharmacy，Chengdu University of TraditionalChineseMedicine；Key Laboratory of Standardization of ChineseHerbalMedicine，Ministry of Education；Sichuan Provincial Key Laboratory of Systematic Research，DeveloPmentand Utilization of ChineseMedicine Resources—Key Laboratory Breeding Baseof Co-founded by Sichuan Province and MOST，Chengdu 611137，China；2.Key Laboratory of Technology of ChineseMedicine Processing，State Administration of Traditional ChineseMedicine，Chengdu 611731，China）

ABSTRACT:AIM To se1ect the suitab1e herbs for steaming FuPian（Radix Aconiti 1atera1is PreParata s1ice）based on the change of contents of six ester-tyPe a1ka1oids.METH0DS HPLC was used for determining the contents of three diester-tyPe a1ka1oids（mesaconitine，aconitine，hyPaconitine）and three monoester-tyPe a1ka1oids （benzoy1mesaconitine，benzoy1aconine，benzoy1hyPaconine）in fresh，dried and soaked-cut FuPian.RESULTS The contents of diester-tyPe a1ka1oidswere decreased significant1y，whi1e those ofmonoester-tyPe a1ka1oidswere increased raPid1y and then stabi1ized at a certain 1eve1.Butwith the extension of steaming time，the contents ofmonoester-tyPe a1ka1oids were a1so decreased gradua11y.C0NCLUSI0N Fresh-cut FuPian is more suitab1e for steaming，and the steaming time is 4 -10 hours.

*通信作者:黃勤挽（1979—），男，副教授，碩士生導師，研究方向為中藥炮制與制劑。Te1:（028）61801001，E-mai1: 36190587@ qq.com

作者簡介:譚茂蘭（1990—），女，碩士，研究方向為中藥炮制與制劑。Te1: 15281090450，E-mai1: tanmao1an2010@163.com

基金項目:國家自然科學基金（81274086）；四川省科技廳支撐計劃（2013SZ0140）；四川省中醫(yī)藥管理局青年基金（2010-12）

收稿日期:2015-08-03

中圖分類號:R283

文獻標志碼:A

文章編號:1001-1528（2016）02-0366-07