鐵包金在血清、血漿、尿液及糞便中的HPLC指紋圖譜

彭 梅， 嚴(yán)志孟， 楊 娟， 朱海燕*

（1.貴州省中國科學(xué)院天然產(chǎn)物化學(xué)重點實驗室，貴州貴陽550002；2.貴陽醫(yī)學(xué)院，貴州貴陽550004）

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鐵包金在血清、血漿、尿液及糞便中的HPLC指紋圖譜

彭 梅1， 嚴(yán)志孟2， 楊 娟1， 朱海燕1*

（1.貴州省中國科學(xué)院天然產(chǎn)物化學(xué)重點實驗室，貴州貴陽550002；2.貴陽醫(yī)學(xué)院，貴州貴陽550004）

摘要:目的 建立鐵包金B(yǎng)erchemia lineata在血清、血漿、尿液及糞便中的HPLC指紋圖譜，并進(jìn)行體內(nèi)定性分析。方法 大鼠灌胃鐵包金水提物后，建立血清、血漿、尿液、糞便中的HPLC指紋圖譜，并比較其相似度。結(jié)果 與給藥前的指紋圖譜相比，9個移行成分以原型入血，7個入尿，2個入糞便。結(jié)論 鐵包金中的大部分成分以原型入血，然后被腎臟代謝，進(jìn)入尿液。

關(guān)鍵詞:鐵包金；HPLC指紋圖譜；血清；血漿；尿液；糞便

dol:10.3969/j.issn.1001-1528.2016.02.027

KEY W 0RDS: Berchemia PolyPhylla；HPLC fingerPrints；serum，P1asma；urine；stoo1

鐵包金B(yǎng)erchemia lineata為鼠李科植物，別名老鼠耳、米拉藤、小葉黃鱔藤，具有祛風(fēng)利濕、止咳祛痰、活血止痛等作用［1］，用于跌打損傷、癰腫瘡毒［2］、腫瘤［3］、毒蛇咬傷等［4-5］。由于其作用成分較多，療效復(fù)雜，因此建立準(zhǔn)確簡單的定性分析方法是其體內(nèi)研究的基礎(chǔ)［6-8］。本實驗在前期鐵包金體外指紋圖譜的基礎(chǔ)上，進(jìn)一步建立其進(jìn)入血清、血漿、尿液、糞便的指紋圖譜，可對鐵包金藥材的體內(nèi)代謝進(jìn)行研究，并為其臨床給藥提供一定的指導(dǎo)依據(jù)。

1 儀器及材料

Agi1ent1100高效液相色譜儀（美國Agi1ent公司）；Mi11iPore-0026超純水機（美國Mi11iPore公司）；JA2003精密電子天平（上海恒平科技有限公司）；TGL-16B離心機（上海安亭科技有限公司）。乙腈為色譜純（德國Merck公司）；甲醇為色譜純（美國Tedia公司）。蘆丁、槲皮素（中國藥品檢驗所）；肝素鈉（北京鼎國昌盛生物技術(shù)有限責(zé)任公司，批號0BC10650）。

鐵包金藥材采自貴州貴陽，經(jīng)貴陽中醫(yī)學(xué)院孫慶文副教授鑒定。Wistar大鼠，雌雄各半，由重慶騰鑫實驗動物中心提供，合格證號SCXK（渝）2012-0006，體質(zhì)量180～240 g。

2 方法與結(jié)果

2.1 樣品的制備

2.1.1 標(biāo)準(zhǔn)品及鐵包金體外樣品的制備 精密稱取槲皮素標(biāo)準(zhǔn)品2.5 mg、蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品2.0 mg，甲醇溶解，定容至10 mL量瓶中，制成0.25 mg/mL、0.20 mg/mL的對照品溶液。

2.1.2 鐵包金供試品溶液的配制 稱取鐵包金藥材5.0 g，加入30倍量蒸餾水，猛火煮沸后文火煎煮45 min，過濾后濃縮濾液，濾渣再按上述方法煎煮2次，合并提取液，濃縮至干，加入甲醇∶乙腈∶水（8∶7∶15）的混合溶劑，定容至25 mL，0.45 μm微孔濾膜濾過，即得。

2.1.3 鐵包金樣品灌胃液配制及分組 將鐵包金藥材粉碎稱重后，加入30倍量水，按“2.1.2”項下方法煎煮制備成鐵包金浸膏，再用CMC-Na配制成含生藥125 mg/mL的混懸液，即得灌胃液。然后，將12只Wistar大鼠（雌雄各半）分為血清組和血漿組，置于代謝籠中適應(yīng)性飼養(yǎng)7 d，采集空白血清、血漿、尿液、糞便后開始給藥。每只大鼠給藥10 mL/kg，每天2次，連續(xù)7 d。

2.1.4 血樣供試品的制備［9-10］大鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)7 d后，血清組眼靜脈采血0.6 mL，4℃放置過夜，4 500 r/min離心15 min，分離血清，取250 μL，加入2倍量甲醇-乙腈（8∶7）混合溶劑，渦旋振蕩30 s后8 000 r/min離心30 min，分離上清液，即得空白血清供試品。然后，連續(xù)給藥7 d，末次給藥前12 h禁食不禁水，給藥后眼靜脈采血0.6 mL，按空白血清供試品制備方法得含藥血清供試品；血漿組眼靜脈采血0.6 mL，加入1％肝素抗凝管中，4 500 r/min離心15 min，分離上清液，取250 μL，加入2倍量甲醇-乙腈（8∶7）混合溶劑，渦旋振蕩30 s后8 000 r/min離心30 min，分離上清液，即得空白血漿供試品。然后，連續(xù)給藥7 d，末次給藥前12 h禁食不禁水，給藥后在設(shè)定時間眼靜脈采血0.6 mL，按空白血漿供試品制備方法得含藥血漿供試品。

2.1.5 空白尿液及糞便的制備［11-12］大鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)7 d后，收集空白尿液，每只1 mL，4 500 r/min離心15 min，取上清液500 μL，加入2倍量甲醇-乙腈（8∶7），渦旋振蕩30 s后8 000 r/min離心30 min，分離上清液，即得空白尿液供試品。另外，每只大鼠取糞便0.8 g，加入5倍量甲醇∶乙腈混合溶液，浸泡1 h后超聲提取20 min，過濾，濾液4 500 r/min離心10 min，靜置10 min后再4 500 r/min離心10 min，分離上清液，即得空白糞便供試品。大鼠連續(xù)給藥7 d，末次給藥前24 h禁食不禁水，給藥后在設(shè)定時間收集大鼠尿液及糞便，按空白尿液及糞便供試品制備方法得給藥尿液及糞便供試品。

2.2 色譜條件 Boston C18色譜柱（250 mm× 4.6 mm，5 μm）；流動相甲醇（A）-0.1％磷酸（B）-乙腈（C），梯度洗脫（0～17 min，10％～22％ A，90％～78％ B；17～35 min，35％ A，60％ B，5％ C；35～45 min，75％ B，25％ C；45～55 min，35％ C，65％ B；55～65 min，35％ C，65％ B；65～75 min，20％ A，60％ B，20％ C；75～80 min，10％ A，90％ B）；檢測波長260 nm；柱溫37℃；進(jìn)樣量20 μL；體積流量1 mL/min。

2.3 最佳收集時間考察 取Wistar大鼠（雌雄各半），連續(xù)給藥7 d，于末次給藥后0.5、1、2、3.5、5 h眼眶取血，收集尿液、糞便，按“2.1.3”項下方法制備含藥血清和血漿供試品，按“2.1.4”項下方法制備含藥尿液和糞便供試品，在“2.2”項色譜條件下進(jìn)行測定，結(jié)果見圖1～4。

圖1　血清HP L C色譜圖Flg.1 HPLC chromatogram s of serum

圖2　血漿HP L C色譜圖Flg.2 HPLC chromatograms of plasma

圖3　尿液HP L C色譜圖Flg.3 HPLC chromatogram s of urlne

圖4　糞便HP LC色譜圖Flg.4 HPLC chromatograms of stool

由圖可知，給藥1 h后，血清、血漿及尿液中鐵包金樣品的移行成分最多，響應(yīng)值最高，故以給藥后1 h為樣品采集時間。另外，糞便中由于鐵包金樣品的移行成分較少，而且內(nèi)源性成分復(fù)雜，代謝隨時間的變化不明顯，故也以給藥后1 h為采集時間。

2.4 精密度、重復(fù)性試驗 取同一份含藥血清、血漿、尿液、糞便樣品，在“2.2”項條件下連續(xù)進(jìn)樣6次，記錄80 min色譜圖，然后以血清中11號峰、血漿中13號峰、尿液中11號峰、糞便中9號峰為參比峰，計算各樣品中主要共有色譜峰的相對保留時間和相對峰面積。結(jié)果顯示，血清樣品各共有峰的相對保留時間RSD均小于0.06％，相對峰面積RSD均小于3.16％；血漿樣品各共有峰的相對保留時間RSD均小于0.04％，相對峰面積RSD均小于2.88％；尿液樣品各共有峰的相對保留時間RSD均小于0.1％，相對峰面積RSD均小于4.89％；糞便樣品各共有峰的相對保留時間RSD均小于0.97％，相對峰面積RSD均小于4.59％，說明儀器精密度良好。

取給藥后1 h每組大鼠的血清、血漿、尿液及糞便6份，在“2.2”項條件下連續(xù)進(jìn)樣，記錄80 min色譜圖，然后以血清中11號峰、血漿中13號峰、尿液中11號峰、糞便中9號峰為參比峰，進(jìn)行計算。結(jié)果，血清樣品中主要共有色譜峰的相對保留時間RSD均＜0.02％，相對峰面積RSD＜2.26％；血漿樣品各共有峰的相對保留時間RSD＜0.03％，相對峰面積RSD＜1.87％；尿液各共有峰的相對保留時間RSD＜0.15％，相對峰面積RSD＜3.73％；糞便樣品各共有峰的相對保留時間RSD＜0.77％，相對峰面積RSD＜4.45％，說明該方法重復(fù)性良好。

2.5 含藥血清指紋圖譜建立 圖5是空白血清、原藥材及含藥血清的指紋圖譜，原藥材中含有14個成分，其中11號峰鑒定為蘆丁，13號峰鑒定為槲皮素?？瞻籽逯杏?個成分，扣除血清中內(nèi)源性成分，初步判定原藥材中有1、2、3、4、7、11、13這6個成分以原型進(jìn)入血清，其余3個成分可能為原型成分的代謝物。

圖5　藥材、含藥血清、空白血清的H P L C色譜圖Flg.5 HPLC chromatograms of sam ples，medlcated serum and blank serum

圖6是6個批次的血清指紋圖譜，將其導(dǎo)入“中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統(tǒng)（2004年A版）”計算相似度，設(shè)置中位數(shù)法生成對照圖譜，時間窗0.4 min，系統(tǒng)自動匹配，以11號峰為內(nèi)參比峰。結(jié)果，各共有峰的相對保留時間RSD＜0.69％，各共有峰的相對峰面積RSD＜4.23％，6個批次鐵包金含藥血清指紋圖譜相似度均0.85以上。另外，各共有峰的相對保留時間相差不大，但各共有峰的相對峰面積存在差異，說明鐵包金樣品在大鼠體內(nèi)的吸收存在個體差異。

2.6 含藥血漿指紋圖譜的建立 圖7是空白血漿、藥材、含藥血漿的指紋圖譜。由圖可知，扣除空白血漿中的5個內(nèi)源性成分后，血漿中共含有15個成分，通過與原藥材中成分的保留時間及相似度比較，初步推斷其中9個移行成分以原型入血，其余5個成分可能為原藥材的代謝成分。

圖6　6批血清樣品中鐵包金的H P L C色譜圖Flg.6 HPLC chrom atogram s of Berchem ia polyphylla ln slx batches of serum samples

圖7　藥材、含藥血漿、空白血漿的H P L C色譜圖Flg.7 HPLC chromatograms of samples，medlcated plasma and blank plasma

圖8是6個批次大鼠血漿的指紋圖譜，將其導(dǎo)入“中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統(tǒng)（2004 年A版）”計算相似度，以13號峰為參比峰。結(jié)果，各共有峰的相對保留時間RSD＜0.91％，相對峰面積RSD＜3.45％，相似度在0.95以上。

2.7 尿液中指紋圖譜的建立 圖9是鐵包金藥材、含藥尿液、空白尿液的指紋圖譜，其尿液中內(nèi)源性成分有3個，扣除后共有19個峰。其中，有7個成分與原藥的保留時間及相似度初步判定，以原型進(jìn)入尿液；有11個峰初步判定為其原藥材的代謝成分。

圖8　6批血漿樣品中鐵包金的H P L C色譜圖Flg.8 HPLC chromatogram s of Berchem ia polyphylla ln slx batches of plasma samples

圖9　藥材、含藥尿液、空白尿液的H P L C色譜圖Flg.9 HPLC chromatogram s of sam p les，m ed lcated urlne and blank urlne

圖10是6個批次的尿液指紋圖譜，將其導(dǎo)入“中藥色譜指紋圖譜相似度評價統(tǒng)（2004年A版）”計算相似度，以11號峰為參比峰。結(jié)果，各共有峰的相對保留時間RSD＜0.89％，相對峰面積RSD＜4.47％，相似度在0.87以上。另外，各共有峰相對保留時間的差異不大，但相對峰面積有明顯的差異，說明鐵包金各成分在大鼠體內(nèi)代謝的時間基本一致，但吸收和被代謝有明顯差異。

2.8 糞便中指紋圖譜的建立 圖11是鐵包金樣品、含藥糞便、空白糞便指紋圖譜。由圖可知，糞便中的成分比較復(fù)雜，扣去內(nèi)源性成分，共有6個峰，其中9號和12號峰初步判定為原藥材中的原型成分，其余4個成分可能為原型成分的代謝產(chǎn)物。

圖1 0　6批尿液樣品中鐵包金的HP LC色譜圖Flg.10 HPLC chromatogram s of Berchem ia polyphylla ln slx batches of urlne samp les

圖1 1　藥材、含藥糞便、空白糞便的HP L C色譜圖Flg.11 HPLC chromatogram s of sam ples，medlcated stool and blank stool

圖12是6個批次的大鼠糞便指紋圖譜，將其導(dǎo)入“中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統(tǒng)（2004 年A版）”計算相似度，以9號峰為參照峰，其各共有峰的相對保留時間RSD＜0.16％，相對峰面積RSD＜5.17％，相似度在0.85以上。

圖1 2　6批糞便樣品中鐵包金的HP LC色譜圖Flg.12 HPLC chromatograms of Berchemia polyphylla ln slx batches of stool sam ples

3 討論

在處理血清、血漿中的蛋白質(zhì)時，曾采用甲醇或乙腈單獨處理，發(fā)現(xiàn)其中鐵包金樣品的移行成分減少，雜質(zhì)較多，處理效果較差，而甲醇和乙腈混合溶劑的效果較理想。另外，還比較了鐵包金樣品在血清、血漿、尿液及糞便中吸收及代謝的HPLC指紋圖譜，可初步判定其在血漿中被吸收的成分比在血清中多。而且，大部分成分在尿液中被檢測到，說明鐵包金樣品中的大部分成分以原型成分進(jìn)入血液，并被腎臟代謝，進(jìn)入尿液。

本實驗建立了血清、血漿、尿液及糞便樣品中鐵包金的HPLC指紋圖譜，其各共有峰的相對保留時間RSD＜0.90％，相對峰面積RSD＜5.0％，6批血清、血漿、尿液及糞便樣品指紋圖譜的相似度均在0.85以上，說明該圖譜相對穩(wěn)定、準(zhǔn)確，可以用于體內(nèi)成分的定性分析。

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［飲片炮制］

HPLC flngerprlnts of Berchem ia polyphylla ln serum，plasma，urlne and stool

PENG Mei1， YAN Zhi-meng2， YANG Juan1， ZHU Hai-yan1*
（1.The Key Laboratory of Chemistry for Natural Productsof Guizhou Provincial and Chinese Academy of Sciences，Guiyang 550002，China，2.Guiyang Medical College，Guiyang 550004，China）

ABSTRACT:AIM To estab1ish the HPLC fingerPrints of Berchemia PolyPhylla in serum，P1asma，urine and stoo1 for qua1itative ana1ysis in vivo.METH0DS After ratswere intragastrica11y administrated with B.PolyPhylla water extract，the HPLC fingerPrints in serum，P1asma，urine and stoo1were estab1ished，then their simi1arities were comPared.RESULTS ComPared with the fingerPrints before administration，nine PrototyPe constituents were absorbed into b1ood，seven constituents were absorbed into urine，and two constituents were absorbed into stoo1.C0NCLUSI0N Most constituents in B.PolyPhylla exist in b1ood in their origina1 forms，then they are metabo1ized by kidney and enter urine.

*通信作者:朱海燕（1978—），女，助理研究員，從事天然活性成分研究。Te1:（0851）83804370，E-mai1: 1itt1e_ zhy@163.com

作者簡介:彭 梅（1985—），女，碩士，助理研究員，從事天然產(chǎn)物分離純化及活性研究。Te1: 15086020961，E-mai1: Pengmei520@ 163.com

基金項目:貴州高層次人才科研條件特助經(jīng)費項目（TZJF-2011-55）

收稿日期:2015-04-23

中圖分類號:R284.1

文獻(xiàn)標(biāo)志碼:A

文章編號:1001-1528（2016）02-0356-05