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    砂仁揮發(fā)油GC-MS指紋圖譜與其鎮(zhèn)痛作用的關(guān)系

    2016-04-08 08:37:06李生茂
    中成藥 2016年2期
    關(guān)鍵詞:灰色關(guān)聯(lián)度砂仁揮發(fā)油

    李生茂, 葉 強(qiáng), 敖 慧*

    (1.川北醫(yī)學(xué)院藥學(xué)院,四川南充637000;2.成都中醫(yī)藥大學(xué),四川成都611137)

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    砂仁揮發(fā)油GC-MS指紋圖譜與其鎮(zhèn)痛作用的關(guān)系

    李生茂1, 葉 強(qiáng)2, 敖 慧2*

    (1.川北醫(yī)學(xué)院藥學(xué)院,四川南充637000;2.成都中醫(yī)藥大學(xué),四川成都611137)

    摘要:目的 研究砂仁Amomi Fructus揮發(fā)油GC-MS指紋圖譜與其鎮(zhèn)痛作用的關(guān)系。方法 GC-MS法建立18批不同產(chǎn)地砂仁揮發(fā)油的指紋圖譜,醋酸致小鼠扭體實(shí)驗(yàn)研究其鎮(zhèn)痛作用,灰色關(guān)聯(lián)度法研究譜效關(guān)系。結(jié)果 GC-MS指紋圖譜中有7個(gè)共有峰,與揮發(fā)油的鎮(zhèn)痛作用有一定關(guān)聯(lián)(0.858~0.718),大小依次為樟腦>乙酸龍腦酯>龍腦>匙葉桉油烯>D-檸檬烯>莰烯>月桂烯。結(jié)論 砂仁揮發(fā)油的鎮(zhèn)痛作用為多組分聯(lián)合效應(yīng)的結(jié)果。

    關(guān)鍵詞:砂仁;揮發(fā)油;GC-MS指紋圖譜;鎮(zhèn)痛作用;灰色關(guān)聯(lián)度

    dol:10.3969/j.issn.1001-1528.2016.02.025

    KEY W 0RDS: Amomi Fructus;essentia1oi1;GC-MS fingerPrints;ana1gesia effect;grey corre1ation

    砂仁為姜科植物陽春砂Amomum villosum Lour.、綠殼砂Amomum villosum Lour.Var.xanthioides T.L.Wu et Senjen或海南砂Amomum longiligulare T.L.Wu的干燥成熟果實(shí)[1],其主要藥效部位是揮發(fā)油,具有抗?jié)?、抗炎、?zhèn)痛、止瀉、抗菌等廣泛的藥理作用[2]。其中,乙酸龍腦酯、樟腦、莰烯、檸檬烯和龍腦等為砂仁揮發(fā)油的主要組成部分[3-4],并以乙酸龍腦酯的含有量最高,抗炎鎮(zhèn)痛等活性較顯著[5-6],為砂仁藥材的質(zhì)控成分[1],而其它幾種主要成分是否也起到相關(guān)作用目前尚不清楚。同時(shí),目前對(duì)砂仁揮發(fā)油的研究大多為化學(xué)成分指紋圖譜分析或藥效學(xué)實(shí)驗(yàn),而對(duì)其藥效作用與化學(xué)物質(zhì)基礎(chǔ)的整體性、聯(lián)系性探索較少。本課題組前期對(duì)不同品種砂仁的抗炎活性進(jìn)行比較,并研究其物質(zhì)基礎(chǔ),發(fā)現(xiàn)該活性與龍腦、芳樟醇、乙酸龍腦酯等多種成分關(guān)系密切。本實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步對(duì)砂仁揮發(fā)油GC-MS指紋圖譜及其鎮(zhèn)痛作用進(jìn)行了研究,并采用灰色關(guān)聯(lián)度分析法考察其化學(xué)信息譜與鎮(zhèn)痛作用的關(guān)系,以期初步揭示砂仁揮發(fā)油的鎮(zhèn)痛物質(zhì)基礎(chǔ),并為進(jìn)一步控制該藥材的質(zhì)量提供一定依據(jù)。

    1 儀器與材料

    1.1 儀器 Agi1ent 7890A-5975C氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀,包括Agi1ent GC-MSD工作站(美國安捷倫公司);Sartorius BP211D AG電子天平(德國賽多利斯公司);輕油提取器(四川蜀牛玻璃儀器有限公司)。

    1.2 試藥 18批砂仁藥材經(jīng)成都中醫(yī)藥大學(xué)中藥資源與鑒定系陳璐講師鑒定,確認(rèn)為陽春砂Amomum villosum Lour.或綠殼砂Amomum villosum Lour.var.xauthioides T.L.Wu et Senjen的干燥成熟果實(shí),具體見表1。羧甲基纖維素鈉(西安惠安纖維素化工有限公司,批號(hào)20130416);正己烷(國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司,批號(hào)T20100928);無水硫酸鈉(國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司,批號(hào)20140114);冰醋酸(成都市科龍化工試劑廠,批號(hào)20100826)均為分析純;水為蒸餾水。

    表1 砂仁來源Tab.1 Sources of Amom i Fructus

    1.3 動(dòng)物 SPF級(jí)昆明種小鼠200只,雌雄各半,許可證號(hào)SCXK(川)2008-11,體質(zhì)量18~22 g,由成都中醫(yī)藥大學(xué)動(dòng)物中心提供。

    2 方法與結(jié)果

    2.1 砂仁揮發(fā)油鎮(zhèn)痛作用研究

    2.1.1 樣品制備 將各批次砂仁藥材粉碎,過20目篩,稱取10 g,置于1 000 mL圓底燒瓶中,加入30倍量(300 mL)水,按《中國藥典》2010年版一部揮發(fā)油測(cè)定法(附錄XD甲法)提取揮發(fā)油,水蒸汽蒸餾5 h,收集揮發(fā)油(均呈淡黃色、油狀),0.5%羧甲基纖維素鈉混懸,配制成相當(dāng)于生藥125 g/L的藥液,備用。

    2.1.2 實(shí)驗(yàn)方法 參考文獻(xiàn)[7],取小鼠200只,隨機(jī)分為20組,每組10只,分別為模型組、陽性藥組和18個(gè)給藥組。陽性藥組(62.5 mg/L鹽酸嗎啡水溶液)及各給藥組按0.4 mL/10 g劑量灌胃給予相應(yīng)藥液,模型組灌胃給予相應(yīng)體積的生理鹽水,每天1次,連續(xù)3 d。最后一次給藥0.5 h后,腹腔注射0.6%冰醋酸(0.2 mL/10 g,臨用前配制),記錄各組小鼠給藥后20 min內(nèi)扭體(腹部收縮內(nèi)凹、仲展后肢、臀部抬高、蠕行)的次數(shù),計(jì)算鎮(zhèn)痛率,公式為鎮(zhèn)痛率=(模型組扭體次數(shù)-給藥組扭體次數(shù))/模型組扭體次數(shù)×100%

    2.1.4 實(shí)驗(yàn)結(jié)果 與模型組比較,18批砂仁揮發(fā)油均有不同程度的鎮(zhèn)痛作用,其中S3、S4、S5、S7、S8、S9、S10、S11、S12、S13、S14、S16和S17比較明顯(P<0.01或0.05),見表2。

    2.2 砂仁揮發(fā)油GC-MS指紋圖譜

    2.2.1 樣品制備 按“2.1.1”項(xiàng)下方法制備砂仁揮發(fā)油,加正己烷1 mL稀釋,無水硫酸鈉除去水分,微孔濾膜過濾,GC-MS分析。

    2.2.2 氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用分析 GC條件:載氣為氦氣;體積流量1.0℃/min;程序升溫,初始溫度60℃,4℃/min速率升至124℃,8℃/min速率升至196℃,保持5 min,10℃/min速率上升至260℃,保持5 min;分流進(jìn)樣,分流比1∶60;進(jìn)樣量1 μL;進(jìn)樣口溫度250℃。MS條件: EI電離;電子能量70 eV;離子源溫度220℃;全掃描方式。

    2.3 方法學(xué)考察

    2.3.1 精密度試驗(yàn) 取S1樣品,按“2.2.1”項(xiàng)下方法制備供試品溶液,在“2.2.2”項(xiàng)色譜條件下連續(xù)進(jìn)樣6次,測(cè)定GC-MS色譜圖。結(jié)果,各共有峰相對(duì)保留時(shí)間和相對(duì)峰面積RSD均小于5%,表明儀器精密度良好。

    2.3.2 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取S1樣品,按“2.2.1”項(xiàng)下方法制備供試品溶液,分別在0、2、4、8、12、24 h進(jìn)樣,測(cè)定GC-MS色譜圖。結(jié)果,各共有峰相對(duì)保留時(shí)間和相對(duì)峰面積RSD均小于5%,表明溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定。

    表2 砂仁揮發(fā)油鎮(zhèn)痛實(shí)驗(yàn)結(jié)果(±s,n=1 0)Tab.2 Results of tests for the analgesla effect of essentlal oll from Amom i Fructus(±s,n=10)

    表2 砂仁揮發(fā)油鎮(zhèn)痛實(shí)驗(yàn)結(jié)果(±s,n=1 0)Tab.2 Results of tests for the analgesla effect of essentlal oll from Amom i Fructus(±s,n=10)

    注:與模型組比較,*P<0.05,**P<0.01

    組別  扭體次數(shù)  鎮(zhèn)痛率/%模型組32.6±5.42 -陽性藥組 0 100 S1 23.6±8.15* 27.61 S2 29.0±9.84 11.04 S3 27.0±5.08 17.18 S4 23.6±8.40* 27.61 S5 25.1±10.49* 23.01 S6 22.9±10.58** 29.75 S7 27.8±6.03 14.72 S8 24.5±9.28* 24.85 S9 19.9±5.63** 38.96 S10 20.4±8.81** 37.42 S11 18.6±9.77** 42.94 S12 17.7±9.06** 45.71 S13 22.7±9.77** 30.37 S14 21.6±10.74** 33.74 S15 27.5±8.40 15.64 S16 21.1±6.44** 35.27 S17 24.8±7.54* 23.93 S18 30.4±6.87 6.75

    2.3.3 重復(fù)性試驗(yàn) 取S1樣品,按“2.2.1”項(xiàng)下方法平行制備5份供試品溶液,測(cè)定GC-MS色譜圖。結(jié)果,各共有峰相對(duì)保留時(shí)間和相對(duì)峰面積RSD均小于5%,表明該方法重復(fù)性良好。

    2.4 指紋圖譜建立、分析及評(píng)價(jià)

    2.4.1 測(cè)定與結(jié)果 取“2.2.1”項(xiàng)下制備的樣品,在“2.2.2”項(xiàng)色譜條件下分別進(jìn)行GC-MS分析,測(cè)得18批砂仁揮發(fā)油的色譜圖,確定其中7個(gè)色譜峰為共有峰,其峰面積之和均占各樣品總峰面積的73.93%~97.00%,可較好地代表該樣品。進(jìn)一步通過NIST08質(zhì)譜數(shù)據(jù)系統(tǒng)檢索,并與標(biāo)準(zhǔn)圖譜比較分析,鑒定了共有色譜峰所代表的成分,結(jié)果見表3、圖1。

    2.4.2 相對(duì)度分析 以S1廣東蟠龍的陽春砂仁為參照,采用Agi1ent GC-MSD工作站自帶的相似度分析軟件處理,得到18批砂仁藥材GC-MS指紋圖譜間的相似度。結(jié)果顯示,與S1比較,砂仁各樣品之間的相似度差異較大(0.338~0.983),見圖2。

    表3 GC-MS指紋圖譜共有峰峰面積Tab.3 Peak areas of comm on peaks of GC-MS flngerprlnts

    2.5 灰色關(guān)聯(lián)度分析 對(duì)18批砂仁揮發(fā)油GC-MS指紋圖譜共有峰峰面積的數(shù)據(jù)與鎮(zhèn)痛活性進(jìn)行灰色關(guān)聯(lián)度分析,研究?jī)烧咧g的相關(guān)性。將不同批次砂仁揮發(fā)油的鎮(zhèn)痛藥效設(shè)為參考序列(母序列),7個(gè)共有峰設(shè)為比較序列(子序列),1~7個(gè)共有峰分別用x1~x7表示。參考文獻(xiàn)[8-10]的方法和步驟。

    2.5.1 絕對(duì)差序列 采用均值化變換,即分別求出各個(gè)序列數(shù)據(jù)的平均值,再用其去除對(duì)應(yīng)序列中各個(gè)原始數(shù)據(jù),所得到的商為新的數(shù)據(jù)列,即均值化數(shù)列。經(jīng)數(shù)據(jù)變換的母序列標(biāo)記為{Yo(m)},子序列記為{Yi(m)},絕對(duì)差序列Δoi(m)= ∣Yo(m)-Yi(m)∣(1≤i≤m)

    圖1 不同產(chǎn)地砂仁揮發(fā)油GC-MS指紋圖譜Flg.1 GC-M S flngerprlnts of essentlal oll from Amom i Fructus from dlfferent grow lng areas

    圖2 不同產(chǎn)地砂仁揮發(fā)油GC-MS指紋圖譜相似度Flg.2 Slm llarltles of GC-MS flngerprlnts of essentlal oll from Amomi Fructus from d lfferent grow lng areas

    2.5.2 關(guān)聯(lián)系數(shù) 關(guān)聯(lián)系數(shù)反映2個(gè)被比較序列的靠近程度。母序列與子序列的關(guān)聯(lián)系數(shù)記為L(zhǎng)oi(k),Δmin和Δmax分別表示所有比較序列絕對(duì)差中的最小值與最大值;ρ為分辨系數(shù),其意義是削弱最大絕對(duì)差數(shù)值太大所引起的失真現(xiàn)象,提高關(guān)聯(lián)系數(shù)之間的差異顯著性,取值在0~1之間,本實(shí)驗(yàn)選取0.5。另外,關(guān)聯(lián)系數(shù)反映2個(gè)被比較序列的靠近程度。計(jì)算公式如下。

    2.5.3 關(guān)聯(lián)度 關(guān)聯(lián)度按兩個(gè)比較序列的關(guān)聯(lián)系數(shù)均值計(jì)算。roi為子序列i與母序列o的關(guān)聯(lián)度,N為比較序列的數(shù)據(jù)個(gè)數(shù)。公式為roi=

    2.5.4 關(guān)聯(lián)序 將m個(gè)子序列對(duì)同一母序列的關(guān)聯(lián)度按大小順序排列,即為關(guān)聯(lián)序,記為(x),它直接反映各個(gè)子序列對(duì)母序列的“貢獻(xiàn)”大小。據(jù)此,可尋找指紋特征峰對(duì)應(yīng)的化學(xué)成分與藥效間的聯(lián)系。

    2.5.5 譜效相關(guān)性分析 對(duì)砂仁揮發(fā)油指紋圖譜中各共有峰峰面積的數(shù)據(jù)與鎮(zhèn)痛活性進(jìn)行灰色關(guān)聯(lián)度及關(guān)聯(lián)序分析。依據(jù)相對(duì)關(guān)聯(lián)度的大小,確定各成分對(duì)鎮(zhèn)痛作用的貢獻(xiàn)順序依次為x4>x6>x5>x7>x3>x1>x2,見表4。

    表4 砂仁揮發(fā)油GC-MS圖譜與鎮(zhèn)痛作用的關(guān)系Tab.4 Relatlshlp between the GC-MS flngerprlnts of essentlal oll from Amomi Fructus and lts analgesla effect

    3 討論

    中藥的藥效物質(zhì)基礎(chǔ)具有整體性、模糊性的特征,是有效物質(zhì)群綜合作用的結(jié)果[9],但因其所含成分復(fù)雜,故研究和表征難度很大,對(duì)其中部分指標(biāo)成分的控制也難以真正評(píng)價(jià)其藥效與質(zhì)量。中藥指紋圖譜可較全面地反映其所含化學(xué)成分的數(shù)量與含有量,但其表征的化學(xué)成分是否為藥效成分以及與藥效的相關(guān)程度不明確,難以體現(xiàn)兩者之間的關(guān)系[11-12]。近年來,通過將指紋圖譜與藥效評(píng)價(jià)相結(jié)合,研究?jī)烧咧g的相關(guān)性(即譜效關(guān)系)來尋找其藥效相關(guān)化學(xué)物質(zhì)基礎(chǔ),已逐漸成為探索中藥特定藥效物質(zhì)基礎(chǔ)的主要方法和解決中藥質(zhì)控指標(biāo)與藥效研究脫節(jié)問題的有效手段[13]?;疑P(guān)聯(lián)度分析法作為對(duì)模糊系統(tǒng)研究的有效手段,適用于系統(tǒng)的信息量較少,但涉及的因素較多,而且這些因素往往相互影響、相互作用[14],是構(gòu)建譜效關(guān)系的常用分析方法之一,在相關(guān)研究中被廣泛運(yùn)用[15-16]。

    砂仁為中醫(yī)臨床常用藥,以廣東陽春縣產(chǎn)陽春砂的質(zhì)量為最佳,尤以蟠龍山產(chǎn)者為第一,為道地產(chǎn)區(qū)[17],研究顯示,揮發(fā)油是其主要藥效部位之一。本實(shí)驗(yàn)采用GC-MS,對(duì)18批砂仁揮發(fā)油進(jìn)行了分析,建立了指紋圖譜,確定其中7個(gè)色譜峰為共有峰,并明確其所代表的化學(xué)成分,各共有峰峰面積之和占總峰面積的73.93%~97.00%之間,可較好地表達(dá)該樣品所含的化學(xué)成分信息。進(jìn)一步以蟠龍山產(chǎn)陽春砂樣品為基準(zhǔn),進(jìn)行相似度研究,發(fā)現(xiàn)18批砂仁GC-MS指紋圖譜之間相似度較差,表明以揮發(fā)油為指標(biāo)時(shí),各砂仁樣品間的質(zhì)量一致性較差,而且與品種、產(chǎn)地等因素?zé)o明顯相關(guān)性。

    然后,采用灰色關(guān)聯(lián)度分析法研究了共有色譜峰與鎮(zhèn)痛活性之間的關(guān)系,發(fā)現(xiàn)兩者均有不同程度的關(guān)聯(lián)度(0.858~0.718)。其中,樟腦、乙酸龍腦酯與砂仁的鎮(zhèn)痛藥效關(guān)聯(lián)度較強(qiáng),在0.800以上,為砂仁揮發(fā)油發(fā)揮鎮(zhèn)痛作用的重要物質(zhì)基礎(chǔ),另外龍腦、匙葉桉油烯醇和D-檸檬烯也有較高的關(guān)聯(lián)度,在0.750以上,這與文獻(xiàn)報(bào)道乙酸龍腦酯[18]、樟腦[19]、檸檬烯[20]和龍腦[21]具有鎮(zhèn)痛作用的研究結(jié)果一致。綜上所述,砂仁揮發(fā)油的鎮(zhèn)痛作用不僅是其中主要化學(xué)成分乙酸龍腦酯發(fā)揮功效,還受其它成分的影響,是多組分聯(lián)合效應(yīng)的結(jié)果,但這些成分在砂仁鎮(zhèn)痛的過程中究竟起到了何種作用(簡(jiǎn)單加和?相互協(xié)同?)還有待于作進(jìn)一步的考察。結(jié)合前期研究發(fā)現(xiàn),砂仁鎮(zhèn)痛活性的相關(guān)成分同時(shí)也具有抗炎活性,但與兩種藥理作用關(guān)系的密切程度有差異,故有必要在結(jié)合活性評(píng)價(jià)的結(jié)果,并明確其與砂仁主要功效關(guān)系密切程度的基礎(chǔ)上,引入多個(gè)指標(biāo),以更好地控制砂仁藥材的質(zhì)量。

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    Relatlonshlp between the GC-MS flngerprlnts of essentlal oll from Amom i Fructus and lts analgesla effect

    LISheng-mao1, YE Qiang2, AO Hui2 *
    (1.School of Pharmacy,North Sichuan Medical College,Nanchong 637000,China;2.Chengdu University of TCM,Chengdu 611137,China)

    ABSTRACT:AIM To study the re1ationshiP between the gas chromatograPhy-mass sPectrometry(GC-MS)fingerPrints of essentia1oi1 from Amomi Fructus and its ana1gesia effect.METH0DS The fingerPrints of eighteen batches of essentia1oi1 from Amomi Fructus from different growing areaswere estab1ished by GC-MS.The ana1gesia effectwas tested by frequency body torsion caused by acetic acid in mice.The re1ationshiP between fingerPrints and ana1gesia effectwas ana1yzed by grey corre1ation.RESULTS There were seven common Peaks in GC-MS finger-Prints.A11 the common Peaks had a certain corre1ation with the ana1gesia effect(0.858 -0.718)with the rank of camPhor>borny1acetate>borneo1>sPathu1eno1>D-1imonene>camPhene>myrcene.C0 NCLUSI0 N The ana1gesia effect of essentia1oi1 from Amomi Fructus is the resu1t ofmu1ticomPonent combined effect.

    *通信作者:敖 慧(1980—),女,博士,高級(jí)實(shí)驗(yàn)師,從事中藥藥理與中藥質(zhì)量控制研究。Te1:(028)61800192,E-mai1: aohui2005 @126.com

    作者簡(jiǎn)介:李生茂(1981—),男,博士,講師,從事中藥藥效物質(zhì)基礎(chǔ)及質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)化研究。Te1:(0817)3300337,E-mai1: 1sm9110 @163.com

    基金項(xiàng)目:成都中醫(yī)藥大學(xué)科技發(fā)展基金項(xiàng)目(ZRVI5201271);成都中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)技術(shù)項(xiàng)目(13117);四川省中醫(yī)藥管理局青年中醫(yī)藥課題(2014K090)

    收稿日期:2015-06-08

    中圖分類號(hào):R284.1

    文獻(xiàn)標(biāo)志碼:A

    文章編號(hào):1001-1528(2016)02-0346-05

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