HPLC法同時(shí)測定當(dāng)歸四逆湯中3種有效成分

陳 瑛， 付正豐， 方應(yīng)權(quán)， 岳秀永

（重慶三峽醫(yī)藥高等?？茖W(xué)校藥學(xué)系，重慶404120）

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HPLC法同時(shí)測定當(dāng)歸四逆湯中3種有效成分

陳 瑛， 付正豐*， 方應(yīng)權(quán)， 岳秀永

（重慶三峽醫(yī)藥高等?？茖W(xué)校藥學(xué)系，重慶404120）

摘要:目的 建立同時(shí)測定當(dāng)歸四逆湯（當(dāng)歸、桂枝、芍藥、通草等）中甘草苷、細(xì)辛脂素和桂皮醛含有量的高效液相色譜（HPLC）法。方法 分析采用Symmetry?Shie1d C18色譜柱（250 mm×4.6 mm，5.0 μm）；0.05％磷酸溶液-乙腈為流動相，梯度洗脫；體積流量1.0 mL/min；檢測波長分別為甘草苷237 nm、細(xì)辛脂素和桂皮醛287 nm；柱溫35℃。結(jié)果 甘草苷、細(xì)辛脂素和桂皮醛分別在4.042～40.42 μg/mL、0.196 0～19.60 μg/mL和10.08～100.8 μg/mL范圍內(nèi)線性關(guān)系良好（r≥0.999 8），平均回收率在96.7％～97.0％之間。結(jié)論 該方法專屬性強(qiáng)，準(zhǔn)確可靠，可用于完善當(dāng)歸四逆湯的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)。

關(guān)鍵詞:當(dāng)歸四逆湯；甘草苷；細(xì)辛脂素；桂皮醛；高效液相色譜（HPLC）

KEY W 0RDS: Danggui Sini Decoction；1iquiritin；asarinin；cinnama1dehyde；high Performance 1iquid chromatograPhy（HPLC）

當(dāng)歸四逆湯出自《傷寒論》，由當(dāng)歸12 g，桂枝9 g，芍藥9 g，通草6 g，細(xì)辛3 g，炙甘草6 g，大棗8枚組成［1］，具有溫經(jīng)散寒、養(yǎng)血通脈的作用，被公認(rèn)為治療血虛寒厥證的代表方［2-3］?，F(xiàn)代藥理研究顯示，其具有擴(kuò)血管、抗凝、抗血栓等作用。目前，關(guān)于當(dāng)歸四逆湯中有效成分的測定主要集中于阿魏酸、肉桂酸、芍藥苷、甘草酸等［4-5］，本實(shí)驗(yàn)采用高效液相色譜（HPLC）法，同時(shí)測定當(dāng)歸四逆湯中甘草苷、細(xì)辛脂素和桂皮醛的含有量，可為完善其質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)提供參考。

1 儀器與試藥

島津LC-20AT高效液相色譜儀，配有二元泵、自動進(jìn)樣器、可變波長紫外檢測器、島津LC-So1ution色譜工作站（日本島津公司）；FW177中藥粉碎機(jī)（天津市泰斯特儀器有限公司）；Mi11iPore-Q超純水儀（美國Mi11iPore公司）；KQ-400KDB超聲波清洗器（昆山超聲儀器有限公司）；賽多利斯R200D電子天平（德國賽多利斯公司）。

當(dāng)歸四逆湯各味藥材均購自重慶市綦江縣藥材公司，經(jīng)三峽中藥研究所付紹智教授鑒定，符合中國藥典（2010版）的規(guī)定。對照品均購自中國食品藥品檢定研究院，分別為甘草苷（批號140857-200411）、細(xì)辛脂素（批號141023-200516）、桂皮醛（批號141221-200405）。乙腈為色譜純；其他試劑均為分析純；水為超純水。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件 Symmetry?Shie1d C18色譜柱（250 mm×4.6 mm，5 μm），采用波長切換方式，即237 nm（0～15 min）、287 nm（15～45 min）；柱溫35℃；流動相0.05％磷酸溶液（A）-乙腈（B），梯度洗脫（0～15 min，20％B；15～45 min，20～48％ B）；體積流量1.0 mL/min；進(jìn)樣量20 μL。理論塔板數(shù)按甘草苷、細(xì)辛脂素和桂皮醛計(jì)，均不低于4 000。

2.2 溶液的配制

2.2.1 對照品溶液 分別精密稱取甘草苷、細(xì)辛脂素和桂皮醛對照品適量，加甲醇配制成對照品貯備液，分別含甘草苷2.021 mg/mL、細(xì)辛脂素0.392 mg/mL和桂皮醛2.016 mg/mL。精密吸取上述對照品溶液適量，置于同一量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，搖勻，即得混合對照品貯備溶液，含甘草苷404.2 μg/mL、細(xì)辛脂素19.60 μg/mL和桂皮醛1 008 μg/mL。然后，精密吸取混合對照品貯備液適量，加甲醇稀釋20倍，即得。

2.2.2 供試品溶液 除大棗外，按處方比例稱取當(dāng)歸等6味藥材，粉碎，過3號篩，按處方1/8的的量精密稱取粉末，加粉碎過的大棗1枚，最終平均質(zhì)量約為11.6 g。置于具塞錐形瓶中，精密加入甲醇200 mL，密塞，稱定質(zhì)量，超聲處理（250 W、40 kHz）30 min，放冷，再稱定質(zhì)量，甲醇補(bǔ)足減失的質(zhì)量，搖勻，濾過，取續(xù)濾液，即得。

2.2.3 陰性供試品溶液 按“2.2.2”項(xiàng)下方法，分別制備缺炙甘草、細(xì)辛、桂枝的陰性供試品溶液。

2.3 方法專屬性 精密吸取上述混合對照品、供試品以及陰性供試品溶液適量，在“2.1”項(xiàng)條件下進(jìn)行分析，記錄色譜圖，結(jié)果見圖1。由圖可知，甘草苷、細(xì)辛脂素和桂皮醛在各自對應(yīng)的位置無干擾，表明該方法專屬性良好。

1.甘草苷 2.細(xì)辛脂素 3.桂皮醛1.1iquiritin 2.asarinin 3.cinnama1dehyde圖1　高效液相色譜圖Flg.1 HPLC chrom atogram s

2.4 線性關(guān)系考察 分別精密吸取混合對照品貯備液0.1、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mL，置于10 mL量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，搖勻，進(jìn)樣分析。以峰面積Y對進(jìn)樣濃度X（μg/mL）進(jìn)行線性回歸，得甘草苷、細(xì)辛脂素和桂皮醛的回歸方程、相關(guān)系數(shù)（r）和線性范圍，結(jié)果見表1。

表1　3種成分的線性關(guān)系Tab.1 L lnear relatlonshlps of three constltuents

2.5 精密度試驗(yàn) 分別取“2.2.1”項(xiàng)下混合對照品溶液，連續(xù)進(jìn)樣6次，按上述色譜條件測定甘草苷、細(xì)辛脂素、桂皮醛的峰面積。結(jié)果顯示，其RSD值分別為1.7％、1.3％和0.95％，表明儀器精密度良好。

2.6 穩(wěn)定性試驗(yàn) 根據(jù)處方比例精密稱取各藥材，制備供試品溶液，室溫下放置，按上述色譜條件分別于0、2、4、6、8、10 h進(jìn)樣，測定甘草苷、細(xì)辛脂素和桂皮醛峰的峰面積。結(jié)果顯示，其RSD值分別為1.7％、1.8％和1.2％，表明溶液在室溫下10 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.7 重復(fù)性試驗(yàn) 根據(jù)處方比例精密稱取各藥材，共6份，制備供試品溶液，按上述色譜條件測定甘草苷、細(xì)辛脂素和桂皮醛的峰面積。結(jié)果顯示，其RSD分別為1.3％、1.6％、1.1％，表明該方法重復(fù)性良好。

2.8 加樣回收試驗(yàn) 精密稱取含有量已知（甘草苷0.322 mg/g、細(xì)辛脂素0.016 2 mg/g、桂皮醛1.01 mg/g）的供試品6份，每份5.8 g，加混合對照品溶液5 mL，按“2.3”項(xiàng)下方法制備，代入標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算各組分的含有量，結(jié)果見表2。

2.9 樣品測定 取3批供試品，按上述方法制備供試品溶液，測定并計(jì)算含有量，結(jié)果見表3。

表2　加樣回收試驗(yàn)結(jié)果Tab.2 Results of recovery tests

表3　樣品測定結(jié)果（n=3）Tab.3 Determ lnatlon results of sam ples（n=3）

3 討論

3.1 供試品提取方法 根據(jù)文獻(xiàn)［6-8］，本實(shí)驗(yàn)考察了提取溶劑的種類和提取方法，分別比較了甲醇、100％乙醇和70％乙醇，發(fā)現(xiàn)以甲醇為溶劑的提取效果最好。同時(shí)，比較了回流和超聲提取方法，發(fā)現(xiàn)兩者無顯著性差異，但后者簡便、節(jié)能，因此選擇超聲提取。另外，還比較了不同超聲功率和提取時(shí)間，最終確定功率250 W，頻率40 kHz，超聲處理30 min。

3.2 色譜條件的優(yōu)化 為保證被測組分有良好的分離度和適當(dāng)?shù)谋Ａ魰r(shí)間，參照文獻(xiàn)［4，9-10］方法，考察了不同的流動相的組成、比例及洗脫方案，發(fā)現(xiàn)乙腈的分離效果好于甲醇，而且甘草苷等3種被測物質(zhì)在偏酸性條件下的分離理論板數(shù)較好，最終確定以0.05％磷酸-乙腈為流動相。由于中藥復(fù)方所含成分較多，故本實(shí)驗(yàn)采用梯度洗脫，可使被測物質(zhì)和雜質(zhì)得到良好的分離。另外，根據(jù)3種化合物紫外吸收波長的差別，甘草苷在237 nm波長處均有明顯吸收［11］，而細(xì)辛脂素和桂皮醛在287 nm附近有較強(qiáng)的紫外吸收［12-13］，并且雜質(zhì)干擾少。因此，參考文獻(xiàn)［14-15］報(bào)道的方法，結(jié)合檢測組分的保留時(shí)間，采用波長切換法相應(yīng)地設(shè)置檢測波長。

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dol:10.3969/j.issn.1001-1528.2016.02.020

Slmultaneous determ lnatlon of three effectlve com ponents ln Danggul Slnl Decoctlon

CHEN Ying， FU Zheng-feng*， FANG Ying-quan， YUE Xiu-yong
（DePartment of Pharmacy，Chongqing Three-Gorge Medical College，Chongqing 404120，China）

ABSTRACT:AIM To deve1oP an HPLC method for the simu1taneous determination of 1iquiritin，asarinin and cinnama1dehyde in Danggui Sini Decoction（Angelicae sinensis Radix，Cinnamomi Cassiae Ramulus，Paeoniae Lactilorae Radix and TetraPanacis PaPyriferi Medulla，etc.）. M ETH 0 DS Symmetry?Shie1d C18co1umn （250 mm×4.6 mm，5.0 μm）maintained at 35℃was used with 0.05％PhosPhoric acid-acetonitri1e asmobi1e Phase at a f1ow rate of1.0 mL/min in a gradiente1ution manner.The detection wave1engthswere setat223 nm for 1iquiritin，and 287 nm for asarinin and cinnama1dehyde.RESULTS Liquiritin，asarinin and cinnama1dehyde dis-P1ayed good 1inear re1ationshiPswithin the ranges of4.042 -40.42 μg/mL，0.196 0 -19.60 μg/mL and 10.08 -100.8 μg/mL（r≥0.999 8），resPective1y，with the average recoveries of 96.7％ -97.0％.C0NCLUSI0 N With good sPecificity，accuracy and re1iabi1ity，thismethod can he1P to imProve the qua1ity standard for Danggui Sini Decoction.

中圖分類號:book=326,ebook=104 R927.2

文獻(xiàn)標(biāo)志碼:A

文章編號:1001-1528（2016）02-0325-04

*通信作者:付正豐（1978—），男，碩士，講師，主要從事中草藥資源開發(fā)與應(yīng)用研究。Te1: 13996539870，E-mai1: 862120258@ qq.com

作者簡介:陳 瑛（1964—），女，副教授，主要從事有機(jī)化學(xué)的研究。Te1: 13594468289

基金項(xiàng)目:重慶市衛(wèi)生計(jì)劃委中醫(yī)藥科技項(xiàng)目（2011-2-15）

收稿日期:2015-05-13

網(wǎng)絡(luò)出版日期: 2015-06-15

網(wǎng)絡(luò)出版地址: httP://www.cnki.net/kcms/detai1/31.1368.R.20150615.1344.001.htm1