影響駱駝蓬總生物堿殼聚糖納米粒粒徑的因素

岳佳琪， 馬桂芝， 付計瑞， 滕 亮， 王長虹

（1.新疆醫(yī)科大學藥學院，新疆烏魯木齊830011；2.新疆醫(yī)科大學第一附屬醫(yī)院藥學部，新疆烏魯木齊830011；3.上海中醫(yī)藥大學中藥研究所，中藥標準化教育部重點實驗室，上海201203）

?

影響駱駝蓬總生物堿殼聚糖納米粒粒徑的因素

岳佳琪1， 馬桂芝1， 付計瑞1， 滕 亮2*， 王長虹3*

（1.新疆醫(yī)科大學藥學院，新疆烏魯木齊830011；2.新疆醫(yī)科大學第一附屬醫(yī)院藥學部，新疆烏魯木齊830011；3.上海中醫(yī)藥大學中藥研究所，中藥標準化教育部重點實驗室，上海201203）

摘要:目的 考察影響駱駝蓬總生物堿殼聚糖納米粒粒徑的因素。方法 離子凝膠法制備駱駝蓬總生物堿殼聚糖納米粒，然后根據(jù)單因素與正交試驗，考察殼聚糖、三聚磷酸鈉、吐溫-80、PH及攪拌時間對其粒徑大小的影響。結(jié)果最優(yōu)條件為殼聚糖質(zhì)量濃度1 mg/mL、三聚磷酸鈉用量6 mg、吐溫-80用量15 mg、PH 4、攪拌時間0.5 h，所得納米粒平均粒徑為（95±1.5）nm，Zeta電位為+（26±1.5）mV。結(jié)論 該條件穩(wěn)定、合理、具有可行性。

關(guān)鍵詞:駱駝蓬總生物堿；殼聚糖納米粒；離子凝膠法；單因素試驗；正交試驗

dol:10.3969/j.issn.1001-1528.2016.02.013

KEY W 0RDS: P.harmala tota1a1ka1oid；chitosan nanoPartic1es；ionotroPic ge1ation method；sing1e factor ex-Periment；orthogona1exPeriment

駱駝蓬Peganum harmala L.為蒺藜科駱駝蓬屬多年生草本植物，含有生物堿、氨基酸、甾體、蒽醌、黃酮等成分［1］，其生物堿類主要成分為駱駝蓬堿和去氫駱駝蓬堿［2］。Moura及何丹丹等［3-4］研究發(fā)現(xiàn)，這些β-咔啉類生物堿能夠改善物體識別模型小鼠的記憶。另外，駱駝蓬總生物堿對A1C13和D-半乳糖誘導的老年癡呆模型小鼠也有一定的保護作用［5］，其作用機制與該成分對乙酰膽堿酯酶（Acety1cho1inesterase，AChE）和丁酰膽堿酯酶（Butyry1cho1inesterase，BChE）分別表現(xiàn)出不同的選擇性抑制作用有關(guān)［6-7］，說明駱駝蓬生物堿在改善學習記憶和防治老年癡呆方面具有較好的開發(fā)前景。

納米藥物與普通制劑相比，具有溶解速率快、藥效穩(wěn)定、體內(nèi)釋放可控、穿透能力強及靶向性好等特點［8］。藥物實現(xiàn)腦靶向時，必須通過結(jié)構(gòu)致密的血腦屏障，而殼聚糖的結(jié)構(gòu)與細胞外基質(zhì)中的多糖類似，而且具有良好的生物可降解性及相容性，提示其有望成為腦靶向載體材料［9］。前期研究結(jié)果表明，駱駝蓬總生物堿殼聚糖納米粒在小鼠體內(nèi)具有一定的腦靶向性［10］，但在制備過程中發(fā)現(xiàn)，納米粒粒徑受各因素影響較大。而且，粒徑又是影響納米粒腦靶向性的重要因素之一，通常認為實現(xiàn)腦靶向粒子的粒徑應小于100 nm［11］。因此，本實驗對影響離子凝膠法制備駱駝蓬總生物堿殼聚糖納米粒粒徑的因素進行考察，為控制納米粒粒徑大小提供依據(jù)。

1 儀器與材料

1.1 儀器 85 -1磁力攪拌器（金壇市醫(yī)療器械廠）；FA1004分析天平（上海舜宇恒平科學儀器有限公司）；A11egra64R臺式高速冷凍離心機（美國貝克曼庫爾特有限公司）；JEM-1230透射電鏡（日本JEM公司）；Zetasizer Nano S90高靈敏納米粒度分析儀（英國馬爾文儀器有限公司）。

1.2 試劑 駱駝蓬總生物堿（自制，批號20090303，駱駝蓬堿和去氫駱駝蓬堿的平均總含有量為87.3％）。氫氧化鈉（天津市南大化學試劑廠，批號020304）；冰醋酸（上海山浦化工有限公司，批號20100604）。殼聚糖（脫乙酰度90％，相對分子質(zhì)量50 000，濟南海得貝海洋生物工程有限公司，批號20090807）；吐溫-80（天津市天達凈化材料精細化工廠，批號070607）；三聚磷酸鈉（天津市致遠化學試劑有限公司，批號20080204）。

2 方法與結(jié)果

2.1 駱駝蓬總生物堿的制備 稱取過20目篩的駱駝蓬種子粉末適量，加4倍量30％乙醇，回流提取7 h，濾液用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀濃縮，濃縮液干燥，即得浸膏。稱取浸膏粉適量，加4倍量0.5％鹽酸超聲溶解10 min，用氨水調(diào)至PH 9，放置24 h，過濾，濾液干燥，即得駱駝蓬總堿粗粉。再稱取20 g，加3倍量95％乙醇，調(diào)節(jié)PH 13.5，回流提取15 min，過濾，濾液干燥，即得駱駝蓬總生物堿精制物。

2.2 考察指標 以納米粒粒徑大小為指標，對相關(guān)影響因素進行考察。量取納米?；鞈乙哼m量，應用Zetasizer Nano S90馬爾文高靈敏納米粒度分析儀進行粒徑的測量。

2.3 駱駝蓬總生物堿殼聚糖納米粒的制備

2.3.1 殼聚糖含藥貯備溶液的制備 稱取殼聚糖500 mg，用含有150 mg駱駝蓬總生物堿的2％冰醋酸溶解，定容至100 mL，放置溶脹24 h后，即得5 mg/mL的殼聚糖含藥儲備液。

2.3.2 駱駝蓬總生物堿殼聚糖納米粒的制備 量取含藥儲備溶液適量加NaOH調(diào)PH，即得（Ⅰ）液。再稱取適量，三聚磷酸鈉用水溶解，并緩慢加入（Ⅰ）液中，700 r/min攪拌一段時間，即得納米粒混懸液。

2.4 單因素試驗

2.4.1 殼聚糖濃度對納米粒粒徑的影響 分別量取含藥貯備液2、4、6、8、10 mL，用2％冰醋酸定容至20 mL，依次得到質(zhì)量濃度為0.5、1、1.5、2、2.5 mg/mL的殼聚糖溶液，分別用NaOH調(diào)至PH=5（Ⅰ）。取三聚磷酸鈉適量（殼聚糖-三聚磷酸鈉為10∶3），5 mL水溶解，并緩慢加入（Ⅰ）液，700 r/min攪拌1 h，再取納米?；鞈乙簻y定粒徑。結(jié)果當殼聚糖濃度為2.5、2、1.5、1、0.5 mg/mL時，納米粒粒徑分別為（300±0.58）、（189±1.53）、（185±2.52）、（177±1.00）、（198±1.15）nm，表明隨著殼聚糖濃度的減小，納米粒粒徑先減小，后增大。所以，本實驗選擇殼聚糖2、1.5、1 mg/mL 3個水平進行考察。

2.4.2 三聚磷酸鈉用量對納米粒粒徑的影響 量取含藥貯備液4 mL，2％冰醋酸定容至20 mL，得到質(zhì)量濃度為1 mg/mL的殼聚糖溶液，NaOH調(diào)至PH 5（Ⅰ）。分別稱取三聚磷酸鈉6、8、10、12 mg，溶解于5 mL水中，并緩慢加入（Ⅰ）液，700 r/min攪拌1 h，再取納米?；鞈乙簻y量粒徑。結(jié)果當三聚磷酸鈉用量分別為12、10、8、6 mg時，納米粒粒徑分別為（230±2.08）、（178± 1.00）、（168±0.58）、（198±1.73）nm，表明隨著三聚磷酸鈉用量的減少，粒徑先減小，后增大。所以，本實驗選擇三聚磷酸鈉10、8、6 mg 3個水平進行考察。

2.4.3 PH對納米粒粒徑的影響 量取含藥貯備液4 mL，2％冰醋酸定容至20 mL，得1 mg/mL的殼聚糖溶液，NaOH調(diào)至PH分別為5、4、3（Ⅰ）。稱取三聚磷酸鈉8 mg，溶解在5 mL水中，并緩慢加入（Ⅰ）液，700 r/min攪拌1 h，再取納米?；鞈乙簻y量粒徑。結(jié)果當PH值分別為5、4、3時，納米粒粒徑分別為（177±2.00）、（149± 1.53）、（155±1.00）nm。

2.4.4 攪拌時間對納米粒粒徑的影響 量取含藥儲備液4 mL，2％冰醋酸定容至20 mL，得1 mg/mL的殼聚糖溶液，NaOH調(diào)至PH 4（Ⅰ）。取三聚磷酸鈉8 mg，溶解于5 mL水中，并緩慢加入（Ⅰ）液，700 r/min分別攪拌1.5、1、0.5 h，再取納米?；鞈乙簻y量粒徑。結(jié)果當攪拌時間分別為1.5、1、0.5 h時，納米粒粒徑分別為（158± 1.73）、（151±2.08）、（146±1.00）nm。

2.5 納米粒的修飾 納米粒如要實現(xiàn)腦靶向性，粒徑須控制在100 nm以下。由于上述單因素考察發(fā)現(xiàn)，所得納米粒的粒徑大小與預想結(jié)果相差較大，故需對其進行修飾，修飾材料為吐溫-80。量取含藥貯備液4 mL，2％冰醋酸定容至20 mL，得1 mg/mL的殼聚糖溶液，NaOH調(diào)至PH 4（Ⅰ）。分別稱取吐溫-80 15、25、35 mg，與三聚磷酸鈉8 mg溶解于5 mL水中，緩慢加入（Ⅰ）液，700 r/min攪拌0.5 h，再取納米粒混懸液測量粒徑。結(jié)果當吐溫-80用量分別為15、25、35 mg時，納米粒粒徑分別為（111±2.08）、（119±2.65）、（141±1.15）nm，表明隨著吐溫-80用量的增加，粒徑也在增大。

2.6 正交試驗考察

2.6.1 正交試驗設(shè)計 量取含藥儲備液適量，2％冰醋酸定容至20 mL，NaOH調(diào)至PH 4（Ⅰ）。取三聚磷酸鈉和吐溫-80適量，溶解于5 mL水中，并緩慢加入（Ⅰ），700 r/min攪拌0.5 h，再取納米?；鞈乙簻y量粒徑。根據(jù)單因素試驗結(jié)果，以殼聚糖濃度及三聚磷酸鈉、吐溫-80的用量為考察因素，進行正交試驗，采用L9（34）正交試驗設(shè)計表安排試驗。因素水平見表1，結(jié)果及直觀分析見表2，方差分析見表3。

表1　因素水平Tab.1 Factors and levels

表2　L9（34）正交試驗設(shè)計（n=3）Tab.2 L9（34）orthogonal experlment deslgn（n=3）

表3　正交試驗方差分析Tab.3 AN0 VA of orthogonal experlment

直觀分析結(jié)果表明，各因素對粒徑的影響順序為B＜A＜C，優(yōu)選出的水平組合為A1B1C1。方差分析結(jié)果表明，三聚磷酸鈉用量對粒徑大小的影響有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。最終，確定三聚磷酸鈉的用量6 mg、殼聚糖的質(zhì)量濃度1 mg/mL、吐溫-80的用量15 mg。

2.6.2 驗證試驗 按照上述篩選的處方制備納米粒，量取含藥貯備液4 mL，2％冰醋酸定容至20 mL，得1 mg/mL的殼聚糖溶液，NaOH調(diào)PH 4（Ⅰ）。稱取三聚磷酸鈉6 mg和吐溫-80 15 mg，溶解于5 mL水中，并緩慢加入（Ⅰ），700 r/min攪拌0.5 h，再取納米?；鞈乙簻y量粒徑。結(jié)果，3次試驗的粒徑分別為93、95、96 nm，平均粒徑值為（95±1.5）nm，RSD=1.6％，說明該條件穩(wěn)定、合理、具有可行性。

2.7 駱駝蓬總生物堿殼聚糖納米粒的質(zhì)量表征

2.7.1 納米粒粒徑分布 按照正交試驗優(yōu)選條件，制備駱駝蓬總生物堿殼聚糖納米粒，用納米粒度分析儀測量粒徑的分布，結(jié)果見圖1A。由圖可知，納米粒的粒徑集中分布在100 nm左右，粒度分布范圍為63～231 nm，分散指數(shù)（PDI）＜0.5，說明納米粒成球形好、分布均勻［10］。

2.7.2 納米粒形態(tài)觀察 取駱駝蓬總生物堿殼聚糖納米?；鞈乙哼m量，滴加在銅網(wǎng)上，用2％磷鎢酸鈉進行負染，干燥5 min后置于樣品臺，用透射電鏡（TEM）對其進行形態(tài)觀察，結(jié)果見圖1B、圖1C。由圖可知，納米粒的形態(tài)為球形或類球形，分散性良好，無黏連現(xiàn)象［10］。

圖1　納米粒粒徑分布圖及透射電鏡照片F(xiàn)lg.1 Partlcle slze d lstrlbutlon of nanopartlcles and photos of transm lsslon electron m lcroscope

2.7.3 納米粒Zeta電位的考察 取駱駝蓬總生物堿殼聚糖納米粒混懸液適量，用粒徑儀測定3次Zeta電位。結(jié)果，Zeta電位分別為+28、+25、+ 26 mV，平均Zeta電位為+（26±1.5）mV。

3 討論

在凝膠化過程中，殼聚糖與三聚磷酸鈉分子間的交聯(lián)是實驗的關(guān)鍵，殼聚糖的質(zhì)量濃度及殼聚糖/三聚磷酸鈉的質(zhì)量比對納米粒粒徑的影響顯著［12］。本實驗發(fā)現(xiàn)，殼聚糖質(zhì)量濃度過高，則會凝聚過度而發(fā)生凝絮；質(zhì)量濃度過低，則形成的納米粒粒徑增大，這將使離心要求變高。只有殼聚糖的質(zhì)量濃度為1.0～5.0 mg/mL，殼聚糖/三聚磷酸鈉的質(zhì)量比為10∶3時，納米粒粒徑最小。而且，在納米粒制備過程中，兩者用量都不宜過高，否則會產(chǎn)生絮凝現(xiàn)象。

采用吐溫-80修飾后，可避免殼聚糖納米粒出現(xiàn)黏連、粒徑增大等現(xiàn)象［13］，并可增加其腦靶向行性［14］。但其修飾駱駝蓬總生物堿殼聚糖納米粒時，對粒徑的影響并不明顯，修飾后PDI仍稍偏大，其原因有待進一步考察。

若攪拌時間太短，三聚磷酸鈉分子間由于沒有分散均勻，則會出現(xiàn)局部凝聚現(xiàn)象，粒徑增大。隨著攪拌時間的延長，殼聚糖溶液的黏度隨之降低，致使殼聚糖與三聚磷酸鈉交聯(lián)不完全，剩余三聚磷酸鈉分子依然會部分凝聚，粒徑增大。結(jié)果表明，攪拌時間為0.5 h時粒徑最小，與文獻［15］報道一致，而且從粒徑的跨度來看，攪拌時間對粒徑大小的影響不大。

參考文獻:

［1］ 趙 婷，王長虹，王崢濤.駱駝蓬屬植物中生物堿類化學成分及其藥理活性研究進展［J］.國際藥學研究雜志，2010，37（5）: 333-339.

［2］ 田曉麗，孫殿甲，堵年生.新疆駱駝蓬種子抗腫瘤活性成分的研究［J］.新疆醫(yī)科大學學報，2006，26（2）: 113-116.

［3］ Moura D J，Rorig C，Vieira D L，etal.Effects ofβ-carbo1ine a1ka1oids on the object recognition task in mice［J］.Life Sci，2006，79（22）: 2099-2104.

［4］ 何丹丹，張磊，劉 力，等.駱駝蓬子總生物堿改善小鼠學習記憶能力［J］.中成藥，2015，37（3）: 478-482.

［5］ 付計瑞，滕 亮，戴秀勇，等.駱駝蓬總堿提取純化工藝及其對鋁致癡呆小鼠作用的研究［J］.中成藥，2011，33（6）: 975-979.

［6］ Zhao T，Ding K，Zhang L，et al.Acety1cho1inesterase and butyry1cho1inesterase in hibitory activities ofβ-carbo1ine and quino1ine a1ka1oids derivatives from the P1ants of genus Peganum ［J］.J Chem，2013，2013.httP: //dx.doi.org/10.1155/ 2013/717232.

［7］ Liu W，Yang Y，Cheng X，etal.RaPid and sensitive detection of the inhibitive activities of acety1-and butyry1-cho1inesterases inhibitors by UPLC-ESI-MS/MS［J］.J Pharm Biomed Anal，2014，94: 215-220.

［8］ 忻志鳴，葉根深.納米粒制劑研究進展［J］.中國藥業(yè)，2010，19（16）: 15-17.

［9］ Fazi1M，Md S，Haque S，etal.Deve1oPmentand eva1uation of rivastigmine 1oaded chitosan nanoPartic1es for brain targeting ［J］.Eur JPharm Sci，2012，47（1）: 6-15.

［10］ 李淑萍，馬桂芝，付計瑞，等.駱駝蓬生物堿殼聚糖納米粒在小鼠體內(nèi)的組織分布［J］.中國藥房，2014，25（39）: 3649-3652.

［11］ 包 強，蔡鑫君，李范珠.不同粒徑神經(jīng)毒素-Ⅰ納米粒大鼠鼻腔給藥腦藥動學研究［J］.中國藥理學通報，2010，26 （6）: 731-735.

［12］ 王 彥，賴克方，張 巧，等.離子凝膠法制備殼聚糖納米粒的影響因素分析［J］.山東醫(yī)藥，2011，51（27）: 13-15.

［13］ 邊俊杰，徐超群，袁志翔，等.表面修飾的鼻用聚乳酸載藥納米粒的制備及體外性質(zhì)研究［J］.華西藥學雜志，2013，28（2）: 114-116.

［14］ NagPa1K，Singh S K，Mishra D N.OPtimization of brain targeted chitosan nanoPartic1es of Rivastigmine for imProved efficacy and safety［J］.Int JBiol Macromol，2013，59 : 72-83.

［15］ 武 陶，丁 武.山梨酸納米防腐顆粒的制備、表征及其緩釋性能［J］.食品科學，2014，35（10）: 57-61.

Influenclal factors on the chltosan nanopartlcles slze of Peganum harmala total alkalold

YUE Jia-qi1， MA Gui-zhi1， FU Ji-rui1， TENG Liang2*， WANG Chang-hong3*
（1.College of Pharmacy，Xinjiang Medical University，Urumqi830011，China；2.DePartment of Pharmacy，The First HosPital Affiliated to Xinjiang Medical University，Urumqi830011，China；3.Institute of ChineseMateria Medica，Shanghai University of Traditional ChineseMedicine；The MOE Key Laboratory for Standardization of Chinese Medicines，Shanghai201203，China）

ABSTRACT:AIM To investigate the inf1uencia1 factors on the chitosan nanoPartic1e size of Peganum harmala tota1a1ka1oid.M ETH 0 DS IonotroPic ge1ation method was aPP1ied in the PreParation of P.harmala tota1a1ka-1oid chitosan nanoPartic1es.The sing1e factor and orthogona1design were invo1ved in determining the effects of chitosan，sodium triPo1yPhosPhate，Tween-80，PH and stirring time on their size.RESULTS Being（95±1.5）nm in mean diameter and（26±1.5）mV in Zeta Potentia1，the nanoPartic1es found their oPtimum Process conditions at 1 mg/mL chitosan，6 mg sodium triPo1yPhosPhate，15 mg Tween-80，PH 4，and 0.5 h stirring time.C0NCLUSI0N The aforementioned oPtima1conditions for the PreParation of P.harmala tota1a1ka1oid chitosan nanoPartic1es are stab1e，reasonab1e and feasib1e.

*通信作者:滕 亮（1975—），男，博士，教授，主任藥師，碩士生導師，研究方向為中藥民族藥新藥。Te1:（0991）4362893，E-mai1: t1750212@126.com王長虹（1964—），男，博士，研究員，博士生導師，研究方向為中藥新制劑與體內(nèi)過程。Te1:（021）51322511，E-mai1: wchcxm@hotmai1.com

作者簡介:岳佳琪（1990—），女，碩士，研究方向為中藥民族藥新藥。Te1: 18703002639，E-mai1: 792075097@qq.com

基金項目:國家自然科學基金—新疆聯(lián)合基金重點項目（U1130303）；烏魯木齊市科學技術(shù)計劃項目（G121320004）；上海市博士后科研資助計劃面上項目（13R21415800）

收稿日期:2015-08-17

中圖分類號:R944

文獻標志碼:A

文章編號:1001-1528（2016）02-0294-05