百里醌調(diào)控M 2型巨噬細(xì)胞表型極化的機(jī)制研究

徐 元， 譚 希， 王原來(lái)， 謝思楠， 章丹丹

（上海中醫(yī)藥大學(xué)穆拉德中藥現(xiàn)代化研究中心，上海201203）

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百里醌調(diào)控M 2型巨噬細(xì)胞表型極化的機(jī)制研究

徐 元， 譚 希， 王原來(lái)， 謝思楠， 章丹丹*

（上海中醫(yī)藥大學(xué)穆拉德中藥現(xiàn)代化研究中心，上海201203）

摘要:目的 考察黑種草子中的活性成分百里醌（thymoquinone）對(duì)M2型巨噬細(xì)胞極化的調(diào)控機(jī)制。方法 利用白介素4（IL-4）誘導(dǎo)鼠源巨噬細(xì)胞為M2型巨噬細(xì)胞模型；MTT法觀察百里醌對(duì)細(xì)胞活力的影響；Trans-we11小室遷移實(shí)驗(yàn)考察巨噬細(xì)胞造模前后自身遷移力的變化、對(duì)乳腺癌4T1細(xì)胞的遷移能力變化及百里醌干預(yù)的影響；qRT-PCR法考察百里醌對(duì)M2型巨噬細(xì)胞內(nèi)精氨酸酶1（Arg1）、誘導(dǎo)型一氧化氮合酶（iNOS）mRNA的影響；Western b1ot法考察百里醌對(duì)細(xì)胞內(nèi)ARG1、iNOS蛋白及信號(hào)傳導(dǎo)與轉(zhuǎn)錄激活因子6（STAT6）信號(hào)通路的影響。結(jié)果 百里醌不僅抑制巨噬細(xì)胞向M2表型極化后自身遷移力的提高，也抑制M2型巨噬細(xì)胞促進(jìn)乳腺癌4T1細(xì)胞的體外遷移加劇。百里醌呈劑量依賴(lài)性抑制Arg1同時(shí)提高iNOS的表達(dá)，降低STAT6蛋白的磷酸化水平。結(jié)論 百里醌逆轉(zhuǎn)巨噬細(xì)胞M2表型極化，部分通過(guò)抑制IL-4/STAT6信號(hào)通路的活化，調(diào)控Arg1/iNOS的表達(dá)消長(zhǎng)而干預(yù)M2表型極化進(jìn)程中巨噬細(xì)胞自身及其促乳腺癌細(xì)胞的體外遷移加速。

關(guān)鍵詞:黑種草子；百里醌；巨噬細(xì)胞；表型極化；精氨酸酶1（Arg1）；誘導(dǎo)型一氧化氮合酶（iNOS）；信號(hào)傳導(dǎo)與轉(zhuǎn)錄激活因子6（STAT6）；作用機(jī)制

dol:10.3969/j.issn.1001-1528.2016.02.002

KEY W 0RDS: Semen Nigellae；thymoquinone；macroPhage；PhenotyPe Po1arization；arginase 1（Arg1）；inducib1e nitric oxide synthase（iNOS）；STAT6；mechanism

腫瘤相關(guān)性炎癥（cancer re1ated inf1ammation，CRI）是腫瘤的第7新特征［1］，腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞（tumor associated macroPhages，TAM）是聯(lián)系腫瘤和炎癥的關(guān)鍵細(xì)胞，也是CRI的主要效應(yīng)細(xì)胞［2］。在腫瘤微環(huán)境中，腫瘤細(xì)胞釋放趨化因子、細(xì)胞因子等信號(hào)，將巨噬細(xì)胞招募并誘導(dǎo)其向M2表型發(fā)生替代性活化，成為T(mén)AM，發(fā)揮其促進(jìn)腫瘤轉(zhuǎn)移、侵襲和免疫逃逸的作用，其數(shù)量高低與多種腫瘤預(yù)后呈負(fù)相關(guān)［3］。尋找中藥來(lái)源的巨噬細(xì)胞表型調(diào)控劑，逆轉(zhuǎn)M2表型以破除腫瘤微環(huán)境中的免疫抑制狀態(tài)，預(yù)防腫瘤免疫逃逸和轉(zhuǎn)移，并重啟巨噬細(xì)胞M1表型的抗腫瘤功能，是腫瘤免疫治療中的熱點(diǎn)領(lǐng)域［4］。

黑種草子（Semen Nige11ae）為毛茛科植物瘤果黑種草（Nigella glandulifera Freyn et Sint.）的干燥成熟種子，為維吾爾族藥食同源的習(xí)用藥。其性味甘、辛、溫，有補(bǔ)腎健腦、通經(jīng)、通乳、利尿之功效［5］。現(xiàn)代藥理研究發(fā)現(xiàn)其具有抗腫瘤、鎮(zhèn)咳、鎮(zhèn)痛、抗炎、抗氧化、抗血小板聚集、抗菌等功效。我們前期對(duì)黑種草子不同組分進(jìn)行初步研究［6］，發(fā)現(xiàn)總皂苷具有抗炎活性［7］，總黃酮可抑制乳腺癌4T1細(xì)胞增殖［8］。百里醌（thymoquinone，TQ）是黑種草子揮發(fā)油中的活性成分，具有抗腫瘤增殖和轉(zhuǎn)移等作用［9］，但對(duì)其調(diào)控M2型巨噬細(xì)胞極化的研究尚未見(jiàn)報(bào)道。本研究考察百里醌對(duì)M2型巨噬細(xì)胞表型極化的影響及其相關(guān)機(jī)制。

1 材料

1.1 藥物與試劑 百里醌購(gòu)自梯希愛(ài)（上海）化成工業(yè)發(fā)展有限公司，純度為99.6％；小鼠巨噬細(xì)胞株RAW264.7，乳腺癌4T1細(xì)胞購(gòu)自美國(guó)ATCC公司；鼠源IL-4購(gòu)自美國(guó)PeProtech公司；胎牛血清購(gòu)自美國(guó)HyC1one公司；RPMI-1640培養(yǎng)基干粉購(gòu)自美國(guó)Gibco公司；噻唑藍(lán)（MTT）、二甲基亞砜（DMSO）、Trizo1RNA提取試劑、High-CaPacity cDNA Reverse TranscriPtion Kits購(gòu)自美國(guó)Life Techno1ogies公司；Rea1MasterMix SYBR Green試劑盒購(gòu)自美國(guó)羅氏；硝酸纖維素（NC）膜購(gòu)自美國(guó)Whatman公司；預(yù)染蛋白Marker購(gòu)自美國(guó)Progema公司；iNOS、ARG 1抗體購(gòu)自美國(guó)Abcam公司；P-STAT6、T-STAT6、β-Actin購(gòu)自美國(guó)Ce11 Signa1ing Techno1ogy公司；相應(yīng)二抗購(gòu)自美國(guó)Santa Cruz公司；ECL檢測(cè)試劑購(gòu)自美國(guó)GE公司；RIPA裂解液、BCA蛋白濃度測(cè)定試劑盒購(gòu)自碧云天生物技術(shù)有限公司；引物由上海生物工程服務(wù)有限公司合成，其他試劑均為分析純。

1.2 儀器 CO2培養(yǎng)箱（HEPA CLASS100，美國(guó)Thermo公司）；生物安全柜（De1ta series，Labconco，美國(guó)）；低溫高速離心機(jī)（EPPendorf Centrifuge 5810R，德國(guó)）；倒置顯微鏡（IX 71，O1ymPus，日本）；SPectra MAX190酶標(biāo)儀（美國(guó)MD公司）；QB-9006恒溫微孔板快速振蕩器（海門(mén)市其林貝爾儀器有限公司）；細(xì)胞計(jì)數(shù)儀（XDS-500C，上海蔡康光學(xué)儀器有限公司）；熒光定量PCR儀（7500 Fast System，美國(guó)APP1ied biosystems公司）；電泳儀（PowerPacTMHC，美國(guó)BIO-RAD公司）；凝膠成像系統(tǒng)（Tanon NIM2045，上海天能科技有限公司）。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 細(xì)胞培養(yǎng) RAW264.7細(xì)胞株和乳腺癌4T1細(xì)胞株均培養(yǎng)于含10％的胎牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)基中，置于保持飽和濕度、5％ CO2培養(yǎng)箱中，在37℃恒溫的條件下培養(yǎng)。待細(xì)胞長(zhǎng)至7～8成密度進(jìn)行傳代，PBS清洗2次后，用0.25％的胰酶（含0.02％的EDTA）消化，加入含血清培養(yǎng)基終止消化，吹打并收集細(xì)胞懸液，800 r/min室溫離心3 min。加入含血清培養(yǎng)基吹打混勻細(xì)胞，按1∶3～1∶6的比例傳代培養(yǎng)。取10～15代的細(xì)胞用于實(shí)驗(yàn)。

2.2 MTT法考察百里醌對(duì)細(xì)胞活力的影響 巨噬細(xì)胞懸液以每孔1×104/100 μL接種于96孔板，培養(yǎng)過(guò)夜。百里醌采用12.5、25、50 μmo1/L劑量處理細(xì)胞。刺激維持24 h后，加入MTT（用PBS溶解為5 g/L）溶液20 μL，繼續(xù)37℃培養(yǎng)4 h，加入DMSO后置搖床上使其充分溶解搖勻后，用酶標(biāo)儀讀取490 nm光吸收值A(chǔ)，計(jì)算百里醌各劑量處理組對(duì)細(xì)胞活力的影響。各處理組設(shè)置3孔重復(fù)，獨(dú)立實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。各處理組的細(xì)胞活力以空白對(duì)照組為100％進(jìn)行換算。

2.3 Trans-we11小室遷移法考察M2型巨噬細(xì)胞造模前后的遷移能力變化及百里醌干預(yù)的影響 收集處于細(xì)胞對(duì)數(shù)期的巨噬細(xì)胞，用無(wú)血清培養(yǎng)基調(diào)整細(xì)胞密度為1×106/mL，取細(xì)胞懸液與百里醌混合液100 μL，終濃度為10、20 μmo1/L，加入Transwe11小室上室，模型組和給藥組的24孔板下室加入IL-4，終質(zhì)量濃度為60 ng/mL，遷移24 h。Trans-we11小室用多聚甲醛固定30 min，0.1％結(jié)晶紫染色30 min，用水小心沖洗，用棉簽輕輕擦掉上層未遷移細(xì)胞。400倍顯微鏡下隨機(jī)選取5個(gè)視野觀察細(xì)胞，記數(shù)。獨(dú)立實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

2.4 Trans-we11小室遷移實(shí)驗(yàn)考察M2型巨噬細(xì)胞對(duì)4T1遷移能力變化及百里醌干預(yù)的影響 收集處于細(xì)胞對(duì)數(shù)期的巨噬細(xì)胞，用10％ FBS培養(yǎng)基調(diào)整細(xì)胞密度為1×106/mL，24孔板下室加入細(xì)胞懸液500 μL，培養(yǎng)過(guò)夜，第2天換無(wú)血清培養(yǎng)基，百里醌（10、20 μmo1/L）預(yù)處理1 h后，加入終質(zhì)量濃度為60 ng/mL的IL-4造模6 h，隨后在Trans-we11小室上室加入無(wú)血清培養(yǎng)基調(diào)整的細(xì)胞密度為1×106/mL的4T1細(xì)胞，體積均為100 μL，遷移24 h。遷移24 h后取出Trans-we11小室，用多聚甲醛固定30 min，結(jié)晶紫染色30 min，用水沖洗，用棉簽小心擦除上層未遷移細(xì)胞。400倍顯微鏡下隨機(jī)5個(gè)視野觀察細(xì)胞并計(jì)數(shù)。獨(dú)立實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

2.5 qRT-PCR考察百里醌對(duì)M2型巨噬細(xì)胞中基因表達(dá)的影響 RAW264.7細(xì)胞培養(yǎng)于30 mm細(xì)胞培養(yǎng)皿中，待貼壁后無(wú)血清處理16 h，百里醌（10、20 μmo1/L）預(yù)處理1 h，與60 ng/mL終質(zhì)量濃度的IL-4共孵育6 h后，收集各組樣品提取RNA，根據(jù)260 nm吸收值計(jì)算出RNA水平，加水調(diào)整各組樣品RNA至0.5 μg/μL。所用RNA的A260/A280均在1.8～2.0之間。逆轉(zhuǎn)錄合成模板cDNA后，應(yīng)用7500 Fast Rea1-Time PCR擴(kuò)增儀進(jìn)行PCR聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)。PCR反應(yīng)條件: 95℃×10 min；50℃×2 min；95℃×15 s，60℃×60 s，40個(gè)循環(huán)。引物序列如下: Arg1正向?yàn)?'-CAGAAGAATGGAAGAGTCAG-3 '，反向?yàn)? '-CAG ATATGCAGGGAGTCACC-3'；iNOS正向?yàn)? '-GGAGCGAGTTGTGGATTGTC-3'，反向?yàn)? '-GTGAGGGCTTGGCTGAGTGAG-3'；GaPdh正向?yàn)?'-AGGTCGGTGTGAACGGATTTG-3'；反向?yàn)?'-TGTAGACCATGTAGTTGAGGTCA-3'。獨(dú)立實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

2.6 Western b1ot法考察百里醌對(duì)M2型巨噬細(xì)胞中蛋白表達(dá)的影響 RAW264.7細(xì)胞培養(yǎng)于30 mm細(xì)胞培養(yǎng)皿中，待貼壁后無(wú)血清處理16 h，百里醌兩個(gè)劑量預(yù)處理1 h后，用60 ng/mL的IL-4共同作用6 h或30 min后，用冰PBS洗滌，加入蛋白酶抑制劑和磷酸酶抑制劑后收集細(xì)胞，超聲破碎，離心（12 000 r/min，15 min，4℃），取蛋白上清液進(jìn)行蛋白含量測(cè)定。每孔加入35 μg的蛋白上樣，在SDS-PAGE凝膠中電泳，蛋白轉(zhuǎn)移到NC膜上，脫脂牛奶或牛血清白蛋白（BSA）封閉，分別用一抗iNOS、ARG1、P-STAT6、T-STAT和β-Actin孵育過(guò)夜，經(jīng)洗膜、二抗孵育、洗膜后，最后ECL顯影。獨(dú)立實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

3實(shí)驗(yàn)結(jié)果

3.1 MTT法考察百里醌對(duì)M0型巨噬細(xì)胞活力的影響 如圖1所示，百里醌在12.5～50 μmo1/L劑量對(duì)靜息態(tài)M0型巨噬細(xì)胞的細(xì)胞活力沒(méi)有影響，即不具有細(xì)胞毒性。

圖1　百里醌對(duì)靜息巨噬細(xì)胞活力的影響（n=3）Flg.1 Effects of TQ on restlng macrophage vlablllty （n=3）

3.2 Trans-we11小室遷移法考察M2型巨噬細(xì)胞造模前后的遷移能力變化及百里醌干預(yù)的影響 如圖2所示，利用IL-4造模后，巨噬細(xì)胞遷移能力顯著性提高（P＜0.01）。與模型組相比，百里醌呈劑量依賴(lài)性降低巨噬細(xì)胞誘導(dǎo)為M2表型后提高的體外遷移數(shù)量（P＜0.01）。

3.3 Trans-we11小室遷移法考察M2型巨噬細(xì)胞對(duì)乳腺癌4T1細(xì)胞的遷移力變化及百里醌干預(yù)的影響 如圖3所示，IL-4造模后的M2型巨噬細(xì)胞顯著性提高乳腺癌4T1細(xì)胞的體外遷移能力（P＜0.01）。百里醌呈劑量依賴(lài)性降低M2型巨噬細(xì)胞對(duì)乳腺癌4T1細(xì)胞的遷移能力的提升（P＜0.01）。

圖2　M 2型巨噬細(xì)胞造模前后的遷移能力變化及百里醌干預(yù)的影響（n=3）Flg.2 M lgratlon capablllty of M 2 macrophages and the lnterventlon of TQ（n=3）

圖3　M 2型巨噬細(xì)胞促乳腺癌4 T 1細(xì)胞的體外遷移及百里醌干預(yù)的影響（n=3）Flg.3 M lgratlon capablllty of 4T1 breast cancer cellsw lth M 2 macrophages and the lnterventlon of TQ（n=3）

3.4 百里醌對(duì)M2型巨噬細(xì)胞中Arg1和iNOS mRNA表達(dá)的影響 在M0型即靜息態(tài)巨噬細(xì)胞中，Arg1在基因水平低表達(dá)。經(jīng)IL-4（60 ng/mL）誘導(dǎo)6 h后，Arg1表達(dá)提高（P＜0.01），百里醌呈劑量依賴(lài)性下調(diào)Arg1的基因表達(dá)（P＜0.01）。見(jiàn)圖4。

圖4　百里醌對(duì)M2型巨噬細(xì)胞中A r g 1和i N 0 Sm RNA的影響（n=3）Flg.4 Effects of TQ on m RNA exp resslons of Arg1 and iN0S ln M 2 macrophages（n=3）

而巨噬細(xì)胞經(jīng)IL-4誘導(dǎo)后，iNOS的基因表達(dá)顯著下降（P＜0.05），百里醌呈劑量依賴(lài)性提高iNOS的基因表達(dá)（P＜0.01）。

3.5 Western b1ot法檢測(cè)百里醌對(duì)M2型巨噬細(xì)胞中ARG1、iNOS蛋白水平的影響 如圖5所示，在巨噬細(xì)胞向M2表型極化后，ARG1和iNOS的蛋白表達(dá)趨勢(shì)與基因表達(dá)一致（P＜0.01）。百里醌能抑制ARG1的蛋白表達(dá)，同時(shí)提升iNOS的蛋白表達(dá)（P＜0.01）。

注:與對(duì)照組比較，##P＜0.01，#P＜0.05；與模型組比較，**P＜0.01，*P＜0.05圖5　百里醌對(duì)M 2型巨噬細(xì)胞中ARG 1和l N 0 S蛋白水平的影響（n=3）Flg.5 Effects of TQ on proteln expresslons of ARG1 and lN0 S ln M 2 macrophages（n=3）

3.6 Western b1ot法檢測(cè)百里醌對(duì)STAT6蛋白磷酸化水平的影響 如圖6所示，在M0型巨噬細(xì)胞中，STAT6的蛋白磷酸化水平低，經(jīng)IL-4激活后，其磷酸化水平提高（P＜0.05）。百里醌呈劑量依賴(lài)性降低STAT6蛋白的磷酸化水平（P＜0.01）。

注:與對(duì)照組比較，##P＜0.01，#P＜0.05；與模型組比較，**P＜0.01，*P＜0.05圖6　百里醌對(duì)STAT 6蛋白磷酸化水平的影響（n=3）Flg.6 Effects of TQ on phosphorylatlon of STAT6（n=3）

4 討論

巨噬細(xì)胞具有異質(zhì)性和多樣性，來(lái)自微環(huán)境不同信號(hào)可誘導(dǎo)其分化為不同的表型。M1型經(jīng)典性激活和M2型替代性激活是巨噬細(xì)胞表型極端化后的兩個(gè)主要亞群，在不同的生理和病理?xiàng)l件下發(fā)揮不同的生物功能。

在巨噬細(xì)胞極化過(guò)程中，Arg1與iNOS為一對(duì)競(jìng)爭(zhēng)性酶，二者的表達(dá)和活性受到嚴(yán)格調(diào)控，兩者間的動(dòng)態(tài)平衡在維持巨噬細(xì)胞的功能穩(wěn)定中發(fā)揮重要作用。Arg1為M2型巨噬細(xì)胞標(biāo)志物，經(jīng)IL-4、IL-13等誘導(dǎo)后高表達(dá)，生成鳥(niǎo)氨酸和尿素，為腫瘤細(xì)胞提供營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)；而iNOS為M1型巨噬細(xì)胞標(biāo)志物，在受到脂多糖（LPS）、干擾素γ（IFN-γ）等刺激下高表達(dá)，產(chǎn)生大量的一氧化氮，起殺傷腫瘤細(xì)胞的作用［10］。百里醌在干預(yù)M2型巨噬細(xì)胞極化中，抑制Arg1在基因和蛋白水平的表達(dá)，同時(shí)提高iNOS的表達(dá)，暗示著百里醌可逆轉(zhuǎn)M2表型，使巨噬細(xì)胞表型向M1型極化。

在M2型替代性活化進(jìn)程中，IL-4與其受體結(jié)合，激活酪氨酸激酶（JAK）使酪氨酸殘基磷酸化，招募STAT6后從受體處分離，級(jí)聯(lián)活化后的復(fù)合物入核，與相應(yīng)的靶基因啟動(dòng)子結(jié)合，控制目的蛋白的表達(dá)［11］。百里醌可降低STAT6蛋白的磷酸化水平，使IL-4/STAT6介導(dǎo)M2表型極化的信號(hào)通路失活。

綜上所述，百里醌是黑種草子中逆轉(zhuǎn)巨噬細(xì)胞M2表型極化的活性成分，部分通過(guò)抑制IL-4/ STAT6信號(hào)通路的活化，調(diào)控Arg1/iNOS的表達(dá)消長(zhǎng)而干預(yù)M2表型極化進(jìn)程中巨噬細(xì)胞自身及其促乳腺癌細(xì)胞的體外遷移加劇。

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M echanlsm of thymoqulnone on regulatlon M 2 phenotype polarlzatlon ofmacrophages

XU Yuan， TAN Xi， WANG Yuan-1ai， XIE Si-nan， ZHANG Dan-dan*
（Murad Research Institute for Modernized Chinese Medicine，Shanghai University of Traditional Chinese Medicine，Shanghai201203，China）

ABSTRACT:AIM To study themechanism of thymoquinone from Semen Nigellae on its regu1ation ofM2 PhenotyPe Po1arization ofmacroPhages in vitro.METH0DS IL-4（60 ng/mL）induced RAW264.7 ce11s to estab1ish the M2 macroPhagemode1.MTT assay was used tomeasure the ce11cytotoxicity of thymoquinone.Trans-we11assay was used formeasurement ofmigration caPabi1ity；qRT-PCR was used to determinemRNA exPression of Arg1 and iNOS.Western b1otwas used for Protein exPressions of ARG1，iNOS and PhosPhory1ation of STAT6.RESULTS Thymoquinone not on1y inhibited the increased migratory caPabi1ity ofmacroPhage towards M2 PhenotyPe，but a1so rePressed breast cancer ce11smigration with the aid of M2 macroPhages in vitro.Thymoquinone down-regu1ated the gene and Protein exPression of Arg1 whi1e uP-regu1ated the gene and Protein exPression of iNOS，and suPPressed the PhosPhory1ation of STAT6 Protein.C0NCLUSI0N Thymoquinone can reversemacroPhage Po1arization from M2 to M1 PhenotyPe and inhibits the Promotion of M2 macroPhages to breast cancer ce11smigration in vitro.IL-4/ STAT6 signa1Pathway is Part1y invo1ved to regu1ate the exPression between Arg1 and iNOS under the interference of thymoquinone.

*通信作者:章丹丹（1980—），女，博士，副研究員，主要從事腫瘤相關(guān)性炎癥的機(jī)制及中藥干預(yù)研究。Te1:（021）51322534，E-mai1: izhangdd@126.com

作者簡(jiǎn)介:徐 元（1992—），女，碩士生，主要從事抗炎中藥篩選及相關(guān)機(jī)制的研究。Te1:（021）51322534，E-mai1: 2313390806@ qq.com

基金項(xiàng)目:上海市教育委員會(huì)科研創(chuàng)新項(xiàng)目（13YZ048）；國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目（81573673，81001666）；上海市衛(wèi)生和計(jì)劃生育委員會(huì)科研課題（20144Y0143）；上海高校選拔培養(yǎng)優(yōu)秀青年教師基金資助項(xiàng)目（SZY07029）

收稿日期:2015-06-15

中圖分類(lèi)號(hào):R966

文獻(xiàn)標(biāo)志碼:A

文章編號(hào):1001-1528（2016）02-0235-06