家蠅鈉離子通道的同源模建及分子對(duì)接和構(gòu)效關(guān)系

顏琦松，舒啟超，巨修練*

1.武漢工程大學(xué)化工與制藥學(xué)院，湖北武漢430074；2.綠色化工過(guò)程教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室（武漢工程大學(xué)），湖北武漢430074

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家蠅鈉離子通道的同源模建及分子對(duì)接和構(gòu)效關(guān)系

顏琦松1，2，舒啟超1，2，巨修練1，2*

1.武漢工程大學(xué)化工與制藥學(xué)院，湖北武漢430074；
2.綠色化工過(guò)程教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室（武漢工程大學(xué)），湖北武漢430074

摘要：利用大鼠腦電壓門(mén)控鉀離子通道DII區(qū)的S4-S5片段的結(jié)構(gòu)和古細(xì)菌Aeropyrum pernix的鉀離子電壓門(mén)控通道S6區(qū)的結(jié)構(gòu)為模板，通過(guò)同源模建的方法構(gòu)建家蠅的鈉離子通道受體開(kāi)啟狀態(tài)的模型，并利用拉氏圖和分子動(dòng)力學(xué)分析驗(yàn)證其模型的合理性.將31個(gè)擬除蟲(chóng)菊酯類(lèi)化合物與模建的家蠅鈉離子通道受體進(jìn)行對(duì)接研究，并研究其作用機(jī)理.結(jié)果表明，對(duì)接打分與實(shí)測(cè)活性值相一致，說(shuō)明了該模型的合理性.通過(guò)對(duì)接分析和三維定量構(gòu)效關(guān)系實(shí)驗(yàn)可以看出，家蠅電壓門(mén)控鈉離子通道上929位蘇氨酸與擬除蟲(chóng)菊酯類(lèi)化合物的羧基形成氫鍵，且化合物上的氯原子與918位甲硫氨酸具有范德華作用力，同時(shí)苯環(huán)上增加取代會(huì)增加位阻降低化合物活性，鄰位和間位取代對(duì)化合物活性相對(duì)影響較小，而苯環(huán)對(duì)位取代對(duì)活性影響最大，且對(duì)位取代基的吸電子能力越強(qiáng)，化合物活性越低.另外，結(jié)構(gòu)與活性關(guān)系研究的CoMFA模型與上述對(duì)接結(jié)果一致.

關(guān)鍵詞：擬除蟲(chóng)菊酯類(lèi)化合物；鈉離子通道受體；分子對(duì)接；3D-QSAR

1　引　言

電壓門(mén)控離子通道（Voltage-gated Ion Chan?nel，VGICs）屬于跨膜蛋白，它在細(xì)胞內(nèi)電信號(hào)傳導(dǎo)中扮演著重要角色. VGICs的狀態(tài)由細(xì)胞膜電勢(shì)調(diào)節(jié)，通道打開(kāi)讓離子可以沿著電勢(shì)差通過(guò)細(xì)胞膜.電壓門(mén)控鈉離子（NaV）通道有三個(gè)主要狀態(tài)：關(guān)閉狀態(tài)，開(kāi)啟狀態(tài)和失活狀態(tài)，其中擬除蟲(chóng)菊酯類(lèi)殺蟲(chóng)劑結(jié)合于Nav通道開(kāi)啟狀態(tài)，并且將通道穩(wěn)定在開(kāi)啟狀態(tài)［1］，因此抑制了通道向其他狀態(tài)的過(guò)渡［2-3］，導(dǎo)致向內(nèi)的鈉電流延續(xù)，引起反復(fù)的神經(jīng)沖動(dòng)和超興奮，使得昆蟲(chóng)麻痹和死亡.這類(lèi)通道調(diào)節(jié)劑與昆蟲(chóng)鈉離子通道的親和力明顯大于與哺乳動(dòng)物鈉離子通道的親和力，使其具有選擇性.不幸的是，同類(lèi)殺蟲(chóng)劑DDT早期的廣泛使用導(dǎo)致了昆蟲(chóng)對(duì)擬除蟲(chóng)菊酯類(lèi)殺蟲(chóng)劑產(chǎn)生了交叉抗性，減弱了這類(lèi)殺蟲(chóng)劑的作用.昆蟲(chóng)對(duì)DDT和擬除蟲(chóng)菊酯產(chǎn)生抗藥性的重要機(jī)制是擊倒抗性（kdr），它會(huì)導(dǎo)致昆蟲(chóng)的電壓門(mén)控鈉離子通道對(duì)擬除蟲(chóng)菊酯類(lèi)殺蟲(chóng)劑敏感性減弱.構(gòu)成離子通道氨基酸殘基突變導(dǎo)致抗性已被實(shí)驗(yàn)證實(shí)，目前研究已揭示了擬除蟲(chóng)菊酯可能的作用位點(diǎn)（圖1）：IIS4-IIS5linker中的Met918，IIS5區(qū)中的Leu925、Leu929和Leu932，IIS6區(qū)Leu1014［4］.當(dāng)然也有一些突變并不在DII區(qū)，但是也主要集中在DI-DIII的S6片段，包括IS6中的V410M和IIIS6區(qū)中F1538I［5-6］.目前并沒(méi)有完整開(kāi)啟狀態(tài)鈉離子通道晶體結(jié)構(gòu)的報(bào)道，但是由于鉀離子通道與鈉離子通道屬于同一家族且具有高度的同源性，因此我們利用電壓門(mén)控鉀離子通道作為模板模建家蠅鈉離子通道，包括D1-D4的S6區(qū)和DII的S4-S5區(qū).此外，將兩類(lèi)含有苯環(huán)的擬除蟲(chóng)菊酯類(lèi)化合物（圖2）與構(gòu)建的家蠅鈉離子通道模型進(jìn)行對(duì)接，并進(jìn)行擬除蟲(chóng)菊酯類(lèi)化合物的3D-QSAR研究，研究其作用機(jī)理，為更好設(shè)計(jì)擬除蟲(chóng)菊酯類(lèi)殺蟲(chóng)劑提供理論依據(jù).

圖1　擬除蟲(chóng)菊酯類(lèi)化合物可能的結(jié)合位點(diǎn)Fig. 1　Possible binding sites for the pyrethroids

圖2　兩類(lèi)擬除蟲(chóng)菊酯的結(jié)構(gòu)Fig. 2　Structures of two kinds of pyrethroids

2　實(shí)驗(yàn)部分

所有計(jì)算通過(guò)SYBYL-X1.2軟件完成，若無(wú)特別說(shuō)明，參數(shù)均為默認(rèn)值.

2.1模板準(zhǔn)備

由于目前并沒(méi)有完整的開(kāi)啟狀態(tài)時(shí)鈉離子通道的晶體結(jié)構(gòu)，所以利用X-射線解析出來(lái)大鼠腦中同一家族的電壓門(mén)控鉀離子（Kv1.2）（蛋白質(zhì)序列號(hào)2A79）通道為模板，其在Kv1.2中S6區(qū)域包含PXP（Pro Xaa Pro）結(jié)構(gòu)（圖3），這種結(jié)構(gòu)能改變蛋白質(zhì)內(nèi)部作用的氫鍵，使細(xì)胞末端S6片段張開(kāi)并形成一個(gè)孔道，大約1.2 nm，使通道持續(xù)開(kāi)放激活狀態(tài)，然而這在電壓門(mén)控鈉離子通道和真核生物的鉀離子通道中并不存在，因此利用Kv1.2來(lái)模建家蠅的S6區(qū)是不適的.由于Kv1.2和KvAP是同一個(gè)家族的，且主要結(jié)構(gòu)區(qū)別是在Kv1.2的S6區(qū)后半部分包含PXP結(jié)構(gòu)，在Kv1.2中的PXP結(jié)構(gòu)的C端的關(guān)鍵連接位置為甘氨酸［7］，其在古細(xì)菌Acro?pyrum pernix中的電壓門(mén)控鉀離子通道（KvAP）同樣位置發(fā)現(xiàn)了甘氨酸，同時(shí)將KvAP的S6螺旋與家蠅的D1-III的S6區(qū)域比對(duì)（圖4）使我們相信KvAP能夠添加在Kv1.2上從而提供一個(gè)更加合理的模板.

圖3　Kv1.2通道跨膜段結(jié)構(gòu)Fig. 3 Structure of channel Kv1.2 transmembrane segment

圖4　KvAP通道與家蠅電壓門(mén)控鈉離子通道D1-D4區(qū)域S6螺旋序列比對(duì)Fig. 4 Comparion of sequence alignments of the KvAP channel and the housefly voltage-gated sodium channel S6 helices from domains I-IV

其中S4-S5區(qū)（殘基312-347）和P-LOOP區(qū)螺旋（殘基362-372）來(lái)自大鼠腦Kv1.2通道X-射線單晶結(jié)構(gòu)（蛋白質(zhì)序列號(hào)2A79），S6螺旋（殘基210-240）來(lái)自于KvAP（蛋白質(zhì)序列號(hào)為1ORQ），模型利用軟件CCP4中的SUPERIMPOSE，將KvAP中的S6螺旋疊加到Kv1.2晶體結(jié)構(gòu)上，KvAP骨架原子殘基序列中219～221和231～233分別疊加到Kv1.2的殘基序列397～399和410～412上，以保證覆蓋保守的關(guān)鍵連接位點(diǎn).

2.2構(gòu)建步驟

首先通過(guò)SYBYL-X1.2的Biopolymer版塊中compare sequence功能將家蠅DI，DIII，DIV的S6區(qū)和DII區(qū)的S4LOOP-S6相互對(duì)照（sequence align?ment）產(chǎn)生MSF（multiple sequence format）的對(duì)比文件［8］，然后利用Medel Proteins將MSF文件導(dǎo)入并以模板的晶體結(jié)構(gòu)為基準(zhǔn)構(gòu)筑靶肽鏈結(jié)構(gòu)，并構(gòu)建保守區(qū)，P-loop區(qū)以及添加側(cè)鏈.

2.3模型組合

利用Biopolymer模塊中Compare Structure里align Structure By Homology，將模建的序列坐標(biāo)疊加到模板上相應(yīng)的部分.

2.4模型的分子動(dòng)力學(xué)優(yōu)化

通過(guò)分子動(dòng)力學(xué)的方法對(duì)模型進(jìn)行修正和能量?jī)?yōu)化，證明模型的可靠性.此實(shí)驗(yàn)選擇了立體場(chǎng)AMBER7FF99［9］，運(yùn)用共軛梯度法優(yōu)化體系能量梯度的RMS小于5 kcal/mol/nm，并通過(guò)分子動(dòng)力學(xué)（molecular dynamics，MD）優(yōu)化模型，確定模型的穩(wěn)定度.模擬條件設(shè)定在溫度300 K，大氣壓為1 T，其中2.5 ps間隔采集一次軌跡數(shù)據(jù)，單位步長(zhǎng)1 fs，總步長(zhǎng)500 ps.

2.5配體分子的準(zhǔn)備

兩類(lèi)配體分子由SYBYL里畫(huà)出，并利用軟件中的Compute模塊中Minimize將分子進(jìn)行能量?jī)?yōu)化，其中Gradient中Termination為0.005 kcal/mol，立場(chǎng)（Force Field）為T(mén)ripos，電荷：Gasteiger-Huck?el，選擇方法為Powell法.

2.6分子對(duì)接

利用分子對(duì)接的方法將前面兩類(lèi)擬除蟲(chóng)菊酯類(lèi)化合物與模建出的家蠅電壓門(mén)控鈉離子通道結(jié)合位點(diǎn)部位進(jìn)行對(duì)接，通過(guò)定義重要結(jié)合殘基Met918，Thr929，Val410，Leu1014，Phe1538，利用SYBYL-1.2中Surflex-docking模塊進(jìn)行，并結(jié)合打分函數(shù)，分析打分函數(shù)與實(shí)測(cè)活性的關(guān)系，驗(yàn)證模型的可靠性，進(jìn)而研究化合物與受體蛋白之間的相互作用機(jī)理.分子對(duì)接結(jié)構(gòu)通過(guò)Cscore面板顯示，打分函數(shù)根據(jù)熵，極性作用，疏水作用，排斥作用，溶劑化作用綜合得到總得分，該得分與結(jié)合自由能具有相關(guān)關(guān)系［10-11］.

2.7分子疊合

分子疊合是CoMFA中最關(guān)鍵的一步，疊合好壞的直觀表現(xiàn)為交叉驗(yàn)證系數(shù)q2值.一般來(lái)說(shuō)，當(dāng)q2大于0.3時(shí)，所建模有較好的統(tǒng)計(jì)意義，而當(dāng)q2大于0.5時(shí)，模型的統(tǒng)計(jì)意義十分顯著［12-13］. r2（非交叉驗(yàn)證相關(guān)系數(shù)）大于0.9時(shí)，說(shuō)明模型的預(yù)測(cè)能力很好.本文考慮到影響化合物活性主要官能團(tuán)集中在苯環(huán)上且與氯原子有關(guān)，因此可選擇苯環(huán)上6個(gè)C和Cl原子及雙鍵上兩個(gè)C共9個(gè)骨架位點(diǎn)，利用SYBYL中Align database將31個(gè)化合物的基本骨架疊合，每個(gè)分子立場(chǎng)的取向具有一致性.

3　結(jié)果與討論

3.1同源模建結(jié)果分析

將家蠅DI，DII，DIII的S6區(qū)和DII區(qū)的S4 LOOP-S5與模板分別進(jìn)行比對(duì)（sequence align?ment），得到同源性（identity）分別是22.6%，13.3%，16.7%，28%，其中關(guān)鍵區(qū)域S4 LOOP-S5比對(duì)的同源性為28%，Kv1.2通道與家蠅的S4-S5 linker、S5區(qū)域序列比，如圖5所示.

圖5　Kv1.2通道與家蠅電壓門(mén)控鈉離子通道的S4-S5linker和S5螺旋序列對(duì)比圖Fig. 5 Comparion of sequence alignments of the Kv1.2 channel with the housefly voltage?gated sodium channel S4-S5 linker and S5 helix

利用SYBYL軟件中Protable分析家蠅受體模型的立體化學(xué)性質(zhì)，得到該模型的Ramachandran構(gòu)象圖，如圖6所示.

圖6　家蠅電壓門(mén)控鈉離子通道受體中央孔道區(qū)域氨基酸Ramachandran圖Fig. 6　Ramachandran graph of the central pore domain of houseflyvoltage?gated sodium channel receptor

在家蠅的NaV通道受體中央孔道區(qū)的拉氏構(gòu)象，觀察到大量的氨基酸集中在-120度與-45度處，這與模型中具有大量的螺旋結(jié)構(gòu)相吻合，此外經(jīng)過(guò)統(tǒng)計(jì)表明，在家蠅NaV通道受體模型中，其中99.1%的氨基酸殘基位于允許區(qū)或最大允許區(qū)，在此說(shuō)明了該模型是合理的.因此本試驗(yàn)利用同源模建構(gòu)建的家蠅NaV通道受體中央孔道區(qū)可用在此后分子對(duì)接試驗(yàn)中.見(jiàn)圖7.

同時(shí)，最終模型還將利用SYBYL-X1.2軟件中Dynamics模塊進(jìn)行分子動(dòng)力學(xué)優(yōu)化，其中勢(shì)能-時(shí)間圖，見(jiàn)圖8.由勢(shì)能-時(shí)間圖可知，NaV受體模型在前80 ps能量下降比較快，而之后能量保持平穩(wěn)狀態(tài)，通過(guò)分子動(dòng)力學(xué)實(shí)驗(yàn)，證明了該模型是可靠的［12-13］.

圖7　家蠅電壓門(mén)控鈉離子通道中央孔道區(qū)域的三維結(jié)構(gòu)Fig. 7　Three?dimensional structure of the central pore domain of housefly voltage?gated sodium channel

圖8　家蠅的NaV通道受體模型分子動(dòng)力學(xué)勢(shì)能-時(shí)間圖Fig. 8 Molecular dynamics graph of potential energy?time for the housefly Navchannel receptor

3.2分子對(duì)接結(jié)果分析

該實(shí)驗(yàn)利用分子對(duì)接的方法將兩類(lèi)共31種擬除蟲(chóng)菊酯類(lèi)化合物與家蠅NaV通道受體進(jìn)行對(duì)接，并通過(guò)SYBYL1.2軟件打分函數(shù)評(píng)價(jià)對(duì)接結(jié)果.

利用軟件中對(duì)接模塊為Surflex-docking Geom （SFXC），考慮分子氫鍵，通過(guò)分子對(duì)接和打分函數(shù)，并選擇最優(yōu)構(gòu)象打分，如表1所示.

表1　兩類(lèi)擬除蟲(chóng)菊酯化合物的對(duì)接結(jié)果Tab. 1　Docking results of two kinds of pyrethroids

通過(guò)圖9可以看出實(shí)測(cè)活性與對(duì)接打分具有相關(guān)性，其中R2＝0.614 2，說(shuō)明了所建模型具有一定的實(shí)際意義.由于1號(hào)分子對(duì)接結(jié)果打分最高，且兩類(lèi)化合物的結(jié)構(gòu)相似性比較高，故對(duì)1號(hào)分子與家蠅的NaV受體進(jìn)行對(duì)接分析，如圖10.

圖9　實(shí)測(cè)LogEC50與對(duì)接打分線性圖Fig. 9　Linear graph of actual LogEC50with docking score

由圖10可知，1號(hào)分子中形成酯鍵的氧作為氫鍵的受體，與Thr929（蘇氨酸）支鏈中的氫原子構(gòu)成氫鍵，提供了配體分子與受體結(jié)合的條件，并且可以觀察的到1號(hào)分子中的氯原子與關(guān)鍵氨基酸925亮氨酸距離0.332 nm，且分子包裹在關(guān)鍵氨基酸DIIS4-S5LOOP內(nèi)的Met918，DIIS5區(qū)Leu925，Thr929，DIIIS6區(qū)Phe1534內(nèi)也說(shuō)明擬除蟲(chóng)菊酯類(lèi)化合物通過(guò)同時(shí)連接結(jié)合家蠅NaV通道開(kāi)啟時(shí)DII區(qū)與DIII區(qū)氨基酸導(dǎo)致通道無(wú)法關(guān)閉而產(chǎn)生殺蟲(chóng)活性的分子機(jī)制.通過(guò)表1我們還可以發(fā)現(xiàn)在苯環(huán)上添加取代基會(huì)減弱其殺蟲(chóng)活性，這是由于苯環(huán)上取代基會(huì)影響分子中氯與Leu925的相互作用，形成位阻.比較28，29，30分子發(fā)現(xiàn)，在苯環(huán)的鄰位和間位引入取代基對(duì)活性影響小，進(jìn)一步比較13，14，15號(hào)分子我們可以得出當(dāng)苯環(huán)4位引入吸電子基，活性明顯下降，且吸電子能力越強(qiáng)，活性越弱.綜上所述，此類(lèi)的擬除蟲(chóng)菊酯化合物中，苯環(huán)上取代會(huì)降低化合物的活性.

圖10　家蠅NaV受體與1號(hào)分子對(duì)接Fig. 10　Housefly Navreceptor docking with molecular one

3.3CoMFA結(jié)果與分析

CoMFA模型中參數(shù)為：交叉驗(yàn)證系數(shù)q2＝0.494（抽一法），其中最佳主成分?jǐn)?shù)為10；非交叉驗(yàn)證相關(guān)系數(shù)（r2）＝0.990，標(biāo)準(zhǔn)方差（SEE）＝0.054，立體場(chǎng)和靜電場(chǎng)的貢獻(xiàn)值分別為36.1%和63.9%，表明此模型統(tǒng)計(jì)意義較好且模型有較好的預(yù)測(cè)能力，靜電場(chǎng)在配體與受體中相互作用更加重要.圖11為CoMFA模型實(shí)測(cè)活性與預(yù)測(cè)活性的線性關(guān)系.

圖11所示的化合物實(shí)測(cè)活性與預(yù)測(cè)活性線性關(guān)系較好，證明所建CoMFA模型可靠，預(yù)測(cè)能力較強(qiáng).選擇化合物1的三維靜電場(chǎng)場(chǎng)等勢(shì)圖（圖11）進(jìn)行分析，在靜電場(chǎng)的三維等勢(shì)圖中藍(lán)色區(qū)域說(shuō)明增加正電荷基團(tuán)對(duì)提高化合物的活性是有利的，而紅色區(qū)域說(shuō)明添加帶負(fù)電基團(tuán)對(duì)化合物活性是有利的.觀察圖12可以看出在苯環(huán)的對(duì)位有大塊的藍(lán)色區(qū)域，說(shuō)明在苯環(huán)的對(duì)位增加正電性取代基有利用提高活性. 4位的F原子及Me、OM取代與物取代的化合物相比較均降低了活性，如化合物10、13.

圖11　CoMFA模型預(yù)測(cè)值與實(shí)測(cè)值的線性圖Fig. 11　Linear graph of predicted values by CoMFA model versus actual values

圖12　CoMFA模型靜電場(chǎng)等等勢(shì)圖Fig. 12　Electrostatic field graph of CoMFA model

圖13中化合物綠色區(qū)域說(shuō)明在該區(qū)域添加大體積基團(tuán)，有利于增加化合物生物活性，而黃色區(qū)域說(shuō)明添加大體積基團(tuán)不利于化合物生物活性.由圖13可以得知，在苯環(huán)的3位及4位有大塊綠色區(qū)域，這表明增大該區(qū)域取代基體積有利于提高化合物活性，但表1中的化合物在苯環(huán)3、4位取代主要為Me及OMe取代基體積較小，如改變?yōu)楫惐?、正丁基或異丁基等較大體積基團(tuán)，將更能證明模型的合理性.

圖13　CoMFA模型力場(chǎng)等勢(shì)圖Fig. 13 Steric field graph of CoMFA model

4　結(jié)　語(yǔ)

本研究模建了家蠅NaV受體跨膜區(qū)的三維結(jié)構(gòu)，并通過(guò)分子動(dòng)力學(xué)和拉氏圖驗(yàn)證了該模型的可靠性.將兩類(lèi)共31個(gè)擬除蟲(chóng)菊酯化合物與該模型進(jìn)行了對(duì)接研究，結(jié)果表明，家蠅NaV通道上929位蘇氨酸與擬除蟲(chóng)菊酯類(lèi)化合物形成氫鍵，且化合物上的氯原子與918號(hào)甲硫氨酸有范德華作用力.另外苯環(huán)上添加取代基會(huì)降低化合物活性，其中對(duì)位的取代對(duì)化合物活性影響最大，且對(duì)位取代基的吸電子能力越強(qiáng)，活性越低，此結(jié)論與CoM?FA模型所得出的結(jié)果相一致.以上結(jié)果為設(shè)計(jì)擬除蟲(chóng)菊酯類(lèi)殺蟲(chóng)劑提供了理論依據(jù).

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本文編輯：張瑞

Homology Modeling of Housefly Voltage?Gated Sodium Ion Channel Receptor and Docking and Three Dimensional Quantitative Structure Activity Relationship

YAN Qisong1，2，SHU Qichao1，2，JU Xiulian1，2

1.School of Chemical Engineering＆Pharmacy，Wuhan Institute of Technology，Wuhan 430074，China；
2.Key Laboratory for Green Chemical Process（Wuhan Institute of Technology），Ministry of Education，Wuhan 430074，China

Abstract：The housefly in an open state sodium channel was homology modeled by using S4?S5 fragment in DII section of rat?brain and S6 section of Aeropyrumpernix in voltage?gated potassium channel as structure tem?plates. The model was confirmed by Ramachandran graph and molecular dynamics. Furthermore，two categories of 31 pyrethroids were docked with housefly Voltage?gated sodium channel receptor and the docking score fitted well with the tested activities. The mechanism of insecticide was studied.The results of docking experiment and the three?dimensional quantitative structure?activity relationship reveal that the 929Thr of housefly Voltage?gated sodium channel receptor forms a hydrogen bond with pyrethroid and the chlorine atom on the side chain forms van der Waals force with Leu925. The effect of substituents on benzene ring may increase the steric hindrance and reduce insecticidal activity. The ortho and meta substitutes of benzene ring have weak effect on activity while the para substitute of benzene ring with strong impact on the activity. The COMFA model of the three dimensional quantitative structure activity relationship is in coincidence with docking results.

Keywords：pyrethroid；voltage?gated sodium channel receptor；molecular docking；3D?QSAR

*通訊作者：巨修練，博士，教授. E-mail：xiulianju2008@aliyun.com

作者簡(jiǎn)介：顏琦松，碩士研究生. E-mail：215850790@qq.com

收稿日期：2015-11-13

文章編號(hào)：1674 - 2869（2016）01 - 0010 - 07

中圖分類(lèi)號(hào)：R914.2

文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A

doi：10. 3969/j. issn. 1674?2869. 2016. 01. 002