TRAIL對(duì)人胃癌耐藥細(xì)胞株SGC-7901/VCR多藥耐藥基因GST-π表達(dá)的影響

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TRAIL對(duì)人胃癌耐藥細(xì)胞株SGC-7901/VCR多藥耐藥基因GST-π表達(dá)的影響

王慧群*張開光#王俊先王巧民

安徽省立醫(yī)院消化內(nèi)科(230001)

背景：腫瘤細(xì)胞的多藥耐藥現(xiàn)象是導(dǎo)致進(jìn)展期胃癌化療失敗的重要因素之一。腫瘤壞死因子相關(guān)凋亡誘導(dǎo)配體(TRAIL)能增強(qiáng)化療藥物對(duì)腫瘤細(xì)胞的殺傷作用，并逆轉(zhuǎn)耐藥細(xì)胞株為敏感細(xì)胞株，但其確切機(jī)制尚不清楚。目的：研究TRAIL對(duì)人胃癌耐藥細(xì)胞株SGC-7901/VCR多藥耐藥基因谷胱甘肽硫轉(zhuǎn)移酶-π(GST-π)表達(dá)的影響，探討其逆轉(zhuǎn)胃癌細(xì)胞多藥耐藥的可能機(jī)制。方法：以不同濃度TRAIL(50、100、200、400 μg/L)干預(yù)SGC-7901/VCR細(xì)胞48 h，采用RT-PCR和ELISA法檢測(cè)各組SGC-7901/VCR細(xì)胞中的GST-π mRNA表達(dá)和細(xì)胞培養(yǎng)上清液中的GST-π含量。結(jié)果：TRAIL干預(yù)能抑制SGC7901/VCR細(xì)胞的GST-π mRNA表達(dá)及其蛋白分泌，抑制作用在一定劑量范圍內(nèi)(≤200 μg/L)具有量效關(guān)系。50、100、200、400 μg/L TRAIL組GST-π mRNA相對(duì)表達(dá)量分別為0.89±0.04、0.77±0.08、0.65±0.06和0.61±0.03，細(xì)胞培養(yǎng)上清液中的GST-π含量分別為(57.56±1.19) ng/mL、(56.30±0.80) ng/mL、(31.41±1.65) ng/mL和(30.80±1.34) ng/mL，均低于對(duì)照組的1.01±0.13和(58.62±1.38) ng/mL，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。結(jié)論：TRAIL可能通過下調(diào)GST-π表達(dá)參與了胃癌細(xì)胞多藥耐藥的逆轉(zhuǎn)。

關(guān)鍵詞胃腫瘤；TNF相關(guān)凋亡誘導(dǎo)配體；谷胱甘肽轉(zhuǎn)移酶；多藥耐藥

Effect of TRAIL on Expression of Multidrug Resistance Gene GST-π in Drug-resistant Human Gastric Cancer Cell Line SGC7901/VCRWANGHuiqun,ZHANGKaiguang,WANGJunxian,WANGQiaomin.DepartmentofGastroenterology,AnhuiProvincialHospital,Hefei(230001)

Correspondence to: ZHANG Kaiguang, Email: zhangkaiguang@medmail.com.cn

Background: Multidrug resistance of tumor cells is one of the important factors that cause failure of chemotherapy in advanced gastric cancer. Tumor necrosis factor-related apoptosis-inducing ligand (TRAIL) may enhance the killing effect of chemotherapeutics on tumor cells, and reverse drug-resistant cell lines to sensitive cell lines, but its mechanism is not yet clear. Aims: To study the effect of TRAIL on expression of multidrug resistance gene glutathione S-transferase-π (GST-π) in drug-resistant human gastric cancer cell line SGC-7901/VCR and the potential mechanism of TRAIL in reversing multidrug resistance of gastric cancer cells. Methods: SGC-7901/VCR cells were treated with TRAIL in different doses (50, 100, 200 and 400 μg/L) for 48 hours. After treatment, expression of GST-π mRNA in SGC-7901/VCR cells and concentration of GST-π in culture supernatant were detected by RT-PCR and ELISA, respectively. Results: TRAIL could inhibit mRNA expression and protein secretion of GST-π in SGC-7901/VCR cells in a dose-dependent manner within a certain range (≤200 μg/L). The relative expression levels of GST-π mRNA in 50, 100, 200 and 400 μg/L TRAIL groups were 0.89±0.04, 0.77±0.08, 0.65±0.06 and 0.61±0.03, respectively, and the concentrations of GST-π in culture supernatant in these groups were (57.56±1.19) ng/mL, (56.30±0.80) ng/mL, (31.41±1.65) ng/mL and (30.80±1.34) ng/mL, respectively, all were significantly lower than those in control group [1.01±0.13 and (58.62±1.38) ng/mL,Pall <0.05]. Conclusions: TRAIL may play a potential role in reversing multidrug resistance of gastric cancer cells through down-regulating GST-π expression.

Key wordsStomach Neoplasms;TNF-Related Apoptosis-Inducing Ligand;Glutathione Transferase;Multidrug Resistance

胃癌是消化系統(tǒng)最常見的惡性腫瘤[1]，化療是胃癌尤其是進(jìn)展期胃癌的重要治療手段，而腫瘤細(xì)胞的多藥耐藥(multidrug resistance)現(xiàn)象是導(dǎo)致胃癌化療失敗的重要因素之一。因此，研究多藥耐藥的發(fā)生機(jī)制及其影響因素對(duì)尋求逆轉(zhuǎn)多藥耐藥的對(duì)策具有重要意義。腫瘤壞死因子相關(guān)凋亡誘導(dǎo)配體(tumor necrosis factor-related apoptosis-inducing ligand, TRAIL)能增強(qiáng)化療藥物對(duì)腫瘤細(xì)胞的殺傷作用，并逆轉(zhuǎn)耐藥細(xì)胞株為敏感細(xì)胞株[2-3]，但其確切機(jī)制尚不清楚。有研究[4-6]發(fā)現(xiàn)抑制腫瘤細(xì)胞多藥耐藥基因表達(dá)可有效逆轉(zhuǎn)多藥耐藥，增加對(duì)化療藥物的敏感性，由此推測(cè)TRAIL亦可能通過影響多藥耐藥基因表達(dá)而發(fā)揮化療增敏作用。谷胱甘肽硫轉(zhuǎn)移酶(glutathione S-transferase, GST)是一組具有解毒和代謝功能的酶類，在各類GST中，以GST-π占比最高，與腫瘤細(xì)胞多藥耐藥的關(guān)系最為密切，在耐藥腫瘤細(xì)胞中呈高表達(dá)[7]。本實(shí)驗(yàn)以TRAIL為干預(yù)因素，觀察其對(duì)人胃癌耐藥細(xì)胞株SGC-7901/VCR多藥耐藥基因GST-π表達(dá)的影響，探討TRAIL逆轉(zhuǎn)胃癌細(xì)胞多藥耐藥的可能機(jī)制，以期為胃癌化療提供新的思路。

材料與方法

一、細(xì)胞株和主要試劑

人胃癌耐藥細(xì)胞株SGC-7901/VCR由第四軍醫(yī)大學(xué)西京醫(yī)院全軍消化病研究所樊代明教授惠贈(zèng)。長(zhǎng)春新堿(VCR，深圳萬樂藥業(yè)有限公司)，TRAIL(PeproTech)，TRIzol?RNA分離試劑、第一鏈cDNA合成試劑盒、PCR試劑盒(Thermo Fisher Scientific)，GST-π和β-actin引物設(shè)計(jì)、合成[生工生物工程(上海)股份有限公司]，GST-π ELISA試劑盒(R&D Systems, Inc.)。

二、方法

1. 細(xì)胞培養(yǎng)：SGC-7901/VCR細(xì)胞置于37 ℃、50 mL/L CO2、飽和濕度條件恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)，培養(yǎng)液為RPMI-1640完全培養(yǎng)基(含100 mL/L FBS、青霉素100 U/mL、鏈霉素100 μg/mL)，并常規(guī)加入1.0 μg/mL VCR以維持細(xì)胞耐藥性，實(shí)驗(yàn)前2周撤藥。

2. TRAIL配制：按試劑說明書將TRAIL溶于100 μL ddH2O中，配制成100 mg/L溶液，-20 ℃保存，實(shí)驗(yàn)當(dāng)天以培養(yǎng)基稀釋至所需濃度。

3. 細(xì)胞處理：取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期SGC-7901/VCR細(xì)胞，以每孔1×108/L接種于25 cm×25 cm培養(yǎng)瓶中，待細(xì)胞生長(zhǎng)至70%~80%，更換新鮮培養(yǎng)基，分別加入終濃度為50、100、200、400 μg/L的TRAIL，另設(shè)不予TRAIL干預(yù)、僅加入培養(yǎng)基的對(duì)照組。每24 h換液一次以維持藥物濃度，培養(yǎng)48 h后分別收集各組細(xì)胞，用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。每一組別設(shè)3個(gè)復(fù)孔，實(shí)驗(yàn)結(jié)果取均值。

4. RT-PCR：分別收集各組細(xì)胞1×109，以TRIzol?RNA分離試劑提取總RNA，經(jīng)鑒定所提取的總RNA樣本純度和完整性符合實(shí)驗(yàn)要求。取總RNA 2 μg，以第一鏈cDNA合成試劑盒合成cDNA。逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)體系：總RNA 2 μg，Oligo(dT) 1 μL，5×緩沖液4 μL，RNase抑制劑1 μL，10 mmol/L dNTP 2 μL，M-MuLV逆轉(zhuǎn)錄酶1 μL，以去離子水補(bǔ)足至20 μL。反應(yīng)條件：42 ℃ 1 h，70 ℃ 5 min，4 ℃ 10 min。取逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)產(chǎn)物2 μL，以β-actin為內(nèi)參行PCR擴(kuò)增。GST-π引物序列：F 5’-CCC AAG TTC CAG GAC GGA GAC-3’，R 5’-TCA GCA GCA AGT CCA GCA GGT-3’，擴(kuò)增片段長(zhǎng)度325 bp[8]；β-actin引物序列：F 5’-TCC TGT GGC ATC CAC GAA ACT-3’，R 5’-GAA GCA TTT GCG GTG GAC GAT-3’，擴(kuò)增片段長(zhǎng)度314 bp[9]。PCR反應(yīng)體系：PCR master mix 12.5 μL，上游、下游引物各1 μL，cDNA 2 μL，以去離子 水補(bǔ)足至25 μL。在Applied Biosystems?GeneAmp?9700 PCR系統(tǒng)中行PCR擴(kuò)增。反應(yīng)條件：GST-π 94 ℃ 5 min；94 ℃ 45 s，55 ℃ 45 s，72 ℃ 60 s，35個(gè)循環(huán)；72 ℃ 10 min。擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)0.2%瓊脂糖凝膠電泳，以天能GIS-2010數(shù)碼凝膠圖像分析系統(tǒng)對(duì)GST-π mRNA表達(dá)行半定量分析(GST-π mRNA/β-actin mRNA)。

5. ELISA：各組細(xì)胞培養(yǎng)48 h后，分別吸取培養(yǎng)上清液500 μL，3 000 r/min離心5~10 min，去除細(xì)胞碎片。將上清液加入已包被抗體的96孔板中，按ELISA試劑盒說明書進(jìn)行操作。最后于酶標(biāo)儀450 nm處讀取各樣本A值，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)蛋白濃度和相應(yīng)A值繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算GST-π含量。

三、統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

結(jié)果

一、各組SGC7901/VCR細(xì)胞GST-π mRNA表達(dá)

RT-PCR檢測(cè)結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比，經(jīng)不同濃度TRAIL干預(yù)48 h的SGC7901/VCR細(xì)胞，GST-π mRNA表達(dá)受到不同程度的抑制，50、100、200、400 μg/L TRAIL組相對(duì)表達(dá)量分別為0.89±0.04、0.77±0.08、0.65±0.06和0.61±0.03，均低于對(duì)照組的1.01±0.13，除200 μg/L與400 μg/L組間，各組間兩兩比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，表明TRAIL對(duì)SGC7901/VCR細(xì)胞GST-π mRNA表達(dá)的抑制作用在一定劑量范圍內(nèi)(≤200 μg/L)具有量效關(guān)系(圖1)。

M：DNA Marker；泳道1~5：對(duì)照組和50、100、200、400 μg/L TRAIL組；泳道a~e：與泳道1~5對(duì)應(yīng)的β-actin

圖1不同濃度TRAIL干預(yù)對(duì)SGC7901/VCR細(xì)胞GST-π mRNA表達(dá)的影響

二、各組SGC7901/VCR細(xì)胞培養(yǎng)上清液GST-π含量

ELISA檢測(cè)結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比，經(jīng)不同濃度TRAIL干預(yù)48 h的SGC7901/VCR細(xì)胞，細(xì)胞培養(yǎng)上清液中的GST-π含量有不同程度的降低，50、100、200、400 μg/L TRAIL組GST-π含量分別為(57.56±1.19) ng/mL、(56.30±0.80) ng/mL、(31.41±1.65) ng/mL和(30.80±1.34) ng/mL，均低于對(duì)照組的(58.62±1.38) ng/mL，除200 μg/L與400 μg/L組間，各組間兩兩比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，表明TRAIL對(duì)SGC7901/VCR細(xì)胞GST-π蛋白分泌的抑制作用在一定劑量范圍內(nèi)(≤200 μg/L)具有量效關(guān)系。

討論

腫瘤細(xì)胞耐藥性的產(chǎn)生是一個(gè)多因素參與的復(fù)雜過程，現(xiàn)已確認(rèn)耐藥基因的激活和表達(dá)上調(diào)與腫瘤耐藥有密切聯(lián)系[10]。GST-π是一種分布于細(xì)胞質(zhì)中的重要Ⅱ相解毒酶類，其解毒功能與腫瘤細(xì)胞多藥耐藥關(guān)系密切，可催化還原型谷胱甘肽(GSH)與親電子物質(zhì)結(jié)合，使細(xì)胞毒性藥物代謝成無毒性物質(zhì)，并可直接與親脂性藥物結(jié)合，通過增加藥物的水溶性而促使其排出細(xì)胞外，同時(shí)可將化療藥物產(chǎn)生的過氧化物還原為無毒性物質(zhì)，從而降低藥物療效[11]，可作為腫瘤耐藥的獨(dú)立影響因素。研究發(fā)現(xiàn)GST-π在胃癌組織中呈高表達(dá)[8-9]，而抑制GST-π表達(dá)可提高腫瘤細(xì)胞對(duì)化療藥物的敏感性，從而延長(zhǎng)患者生存期[6]。

TRAIL是腫瘤壞死因子(TNF)家族成員，能通過與死亡受體結(jié)合誘導(dǎo)多種腫瘤細(xì)胞凋亡，對(duì)正常細(xì)胞則無明顯毒性作用，這一特性使其在腫瘤靶向治療方面顯現(xiàn)出良好的應(yīng)用前景[2-3,12-13]。TRAIL與細(xì)胞膜上的相應(yīng)死亡受體TRAIL-R1、TRAIL-R2結(jié)合后激活caspases通路，傳遞和放大凋亡信號(hào)，誘導(dǎo)靶細(xì)胞發(fā)生快速、大量、高效的凋亡反應(yīng)。此外，研究[14]還發(fā)現(xiàn)TRAIL如與化療藥物聯(lián)合使用，對(duì)腫瘤細(xì)胞的殺傷效應(yīng)較兩者單用顯著增強(qiáng)，但其增加腫瘤細(xì)胞化療敏感性的作用機(jī)制尚不明確。據(jù)相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道，TNF逆轉(zhuǎn)腫瘤細(xì)胞多藥耐藥的可能機(jī)制主要有[15-16]：①下調(diào)P-糖蛋白(P-gp)編碼基因多藥耐藥基因1(MDR1)表達(dá)，減少細(xì)胞內(nèi)化療藥物蓄積，從而逆轉(zhuǎn)由P-gp引起的經(jīng)典多藥耐藥；②下調(diào)GST-π表達(dá)，通過降低細(xì)胞內(nèi)解毒功能逆轉(zhuǎn)多藥耐藥。TRAIL作為TNF家族成員之一，其逆轉(zhuǎn)腫瘤細(xì)胞多藥耐藥的機(jī)制是否與TNF類似，目前國(guó)內(nèi)外相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道尚少。本課題組前期研究[17]已發(fā)現(xiàn)TRAIL可抑制人胃癌耐藥細(xì)胞株SGC-7901/VCR中的MDR1/P-gp表達(dá)，且抑制作用在一定劑量范圍內(nèi)具有量效關(guān)系。本研究進(jìn)一步探討了TRAIL逆轉(zhuǎn)胃癌細(xì)胞多藥耐藥的作用與GST-π的關(guān)系。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，在SGC-7901/VCR細(xì)胞中，TRAIL可在轉(zhuǎn)錄和翻譯水平抑制多藥耐藥基因GST-π表達(dá)，抑制作用具有良好的量效關(guān)系，但此種量效關(guān)系并不呈線性關(guān)系，TRAIL濃度>200 μg/L 后，GST-π表達(dá)不再進(jìn)一步降低，分析其原因可能為該胃癌細(xì)胞株本身對(duì)TRAIL有一定耐藥性。劉玲等[18]關(guān)于TRAIL對(duì)SGC-7901細(xì)胞生長(zhǎng)抑制和凋亡誘導(dǎo)作用的實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)，TRAIL濃度>200 μg/L后，細(xì)胞生長(zhǎng)抑制率即不再明顯增加，TRAIL濃度>500 μg/L時(shí)，細(xì)胞生長(zhǎng)抑制率和凋亡率均不超過30%，提示SGC-7901細(xì)胞為TRAIL耐藥細(xì)胞株，與本實(shí)驗(yàn)結(jié)果相符。

綜上所述，根據(jù)本實(shí)驗(yàn)結(jié)果可初步推測(cè) TRAIL與胃癌細(xì)胞多藥耐藥之間存在負(fù)相關(guān)關(guān)系，其可能通過下調(diào)多藥耐藥基因GST-π表達(dá)參與了胃癌細(xì)胞多藥耐藥的逆轉(zhuǎn)。為了更深入地研究TRAIL對(duì)胃癌細(xì)胞多藥耐藥的逆轉(zhuǎn)作用，后續(xù)擬聯(lián)合應(yīng)用TRAIL與化療藥物，觀察TRAIL 對(duì)胃癌細(xì)胞多藥耐藥基因表達(dá)和化療藥物療效的影響，探討TRAIL下調(diào)多藥耐藥基因表達(dá)具體機(jī)制的相關(guān)研究亦已在進(jìn)行中。

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(2015-05-26收稿；2015-06-05修回)

DOI:10.3969/j.issn.1008-7125.2016.01.003

*Email: wanghuiqun1986@126.com

#本文通信作者， Email: zhangkaiguang@medmail.com.cn