華支睪吸蟲(chóng)感染FVB小鼠的試驗(yàn)研究

張蓓蓓，張　波，沈莉萍，李　波，顏　超，湯仁仙，鄭葵陽(yáng)

(徐州醫(yī)學(xué)院病原生物學(xué)與免疫學(xué)教研室/感染與免疫實(shí)驗(yàn)室，江蘇徐州　221004)

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華支睪吸蟲(chóng)感染FVB小鼠的試驗(yàn)研究

張蓓蓓，張波，沈莉萍，李波，顏超，湯仁仙，鄭葵陽(yáng)*

(徐州醫(yī)學(xué)院病原生物學(xué)與免疫學(xué)教研室/感染與免疫實(shí)驗(yàn)室，江蘇徐州221004)

摘要：為了觀察華支睪吸蟲(chóng)感染FVB小鼠肝臟組織病理變化，將12只健康雌性FVB小鼠隨機(jī)分成2組，分別為正常組與感染組，每組6只。感染組小鼠經(jīng)口灌飼45個(gè)華支睪吸蟲(chóng)囊蚴。于感染后25 d用NaOH消化法檢測(cè)糞便蟲(chóng)卵陽(yáng)性率，感染后第112天收集肝臟組織，進(jìn)行HE染色及Masson染色觀察肝臟病理變化情況；收集外周血，ELISA檢測(cè)血清中華支睪吸蟲(chóng)特異性IgG抗體。蟲(chóng)卵檢查結(jié)果顯示，感染組小鼠在感染后25 d檢查到蟲(chóng)卵，肉眼觀察小鼠肝小葉邊緣有白色結(jié)節(jié)樣病變，肝臟表面有白色透明水泡。感染組小鼠血清中華支睪吸蟲(chóng)特異性IgG水平顯著高于正常組(P<0.01)。HE染色觀察小鼠肝臟組織，見(jiàn)到蟲(chóng)體，炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)嚴(yán)重，纖維化明顯并伴有點(diǎn)狀壞死。肝細(xì)胞腫脹，肝竇狹窄，膽管擴(kuò)張?jiān)錾@著，膽管上皮細(xì)胞水腫、壞死，部分膽管上皮細(xì)胞胞漿均質(zhì)紅染。Masson染色顯示肝臟組織尤其是蟲(chóng)體周?chē)霈F(xiàn)大面積纖維化。試驗(yàn)結(jié)果表明,華支睪吸蟲(chóng)感染FVB小鼠肝臟病變嚴(yán)重，因此可利用該品系小鼠建立華支睪吸蟲(chóng)感染模型，為深入研究華支睪吸蟲(chóng)的致病機(jī)制奠定基礎(chǔ)。

關(guān)鍵詞：華支睪吸蟲(chóng)；FVB小鼠；肝臟；病理變化

華支睪吸蟲(chóng)(Clonorchissinensis)是一種重要的食源性寄生蟲(chóng)，人和犬貓等哺乳動(dòng)物因食入含有華支睪吸蟲(chóng)囊蚴的魚(yú)蝦而感染。成蟲(chóng)寄生于肝膽管，導(dǎo)致膽管的炎癥反應(yīng)，肝臟與膽囊的組織損傷及功能改變，出現(xiàn)膽囊炎、膽管肝炎、膽結(jié)石和肝硬化等，更值得注意的是華支睪吸蟲(chóng)感染與膽管細(xì)胞癌密切相關(guān)，2009年WHO將其列為明確的人類致癌物(1類)[1-2]。最新調(diào)查顯示,全球約有1 531 萬(wàn)華支睪吸蟲(chóng)感染者，主要分布于中國(guó)、韓國(guó)、越南和俄羅斯，每年可造成約5 000例死亡和27萬(wàn)傷殘調(diào)整生命年(disability adjusted life years,DALYs)[3]。因此，加強(qiáng)對(duì)華支睪吸蟲(chóng)病的研究及防控十分重要。本研究用華支睪吸蟲(chóng)感染FVB小鼠，觀察小鼠肝臟病理改變，為深入探討華支睪吸蟲(chóng)病的發(fā)病機(jī)制奠定基礎(chǔ)。

1材料與方法

1.1材料

1.1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物和囊蚴SPF級(jí)健康雌性FVB小鼠12只，8周齡，體重25 g～30 g，購(gòu)自上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司，飼養(yǎng)于徐州醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心SPF級(jí)屏障系統(tǒng)。感染華支睪吸蟲(chóng)囊蚴的麥穗魚(yú)購(gòu)自江蘇省邳州市某菜市場(chǎng)。

1.1.2主要試劑蘇木素-伊紅染色試劑盒，購(gòu)自江蘇碧云天公司；Masson染色試劑盒，購(gòu)自福州邁新生物技術(shù)開(kāi)發(fā)有限公司；HRP標(biāo)記的羊抗鼠IgG總抗體，美國(guó)Abcam公司產(chǎn)品；華支睪吸蟲(chóng)成蟲(chóng)抗原(CA)，由徐州醫(yī)學(xué)院感染與免疫實(shí)驗(yàn)室制備。

1.2方法

1.2.1動(dòng)物模型的建立

1.2.1.1華支睪吸蟲(chóng)囊蚴的分離參照文獻(xiàn)[4-5]，按照傳統(tǒng)方法將購(gòu)自疫區(qū)的麥穗魚(yú)消化后解剖鏡下分離囊蚴，計(jì)數(shù)后保存于Alsever's溶液中，保存于4℃?zhèn)溆谩?/p>

1.2.1.2實(shí)驗(yàn)動(dòng)物感染將12只FVB小鼠隨機(jī)分成正常組與感染組，每組6只，感染組小鼠每只經(jīng)口灌飼45個(gè)囊蚴，適量生理鹽水清洗數(shù)遍，保證囊蚴的灌入。

1.2.2糞便檢查感染后第25天，收集小鼠糞便，100 g/L NaOH消化糞便過(guò)夜，吸管吸取適量沉渣制作涂片3張，顯微鏡下查找蟲(chóng)卵。

1.2.3病理學(xué)觀察和組織學(xué)觀察在感染后第112天，頸椎脫臼法處死小鼠，低溫下無(wú)菌分離小鼠完整肝臟，肉眼觀察小鼠肝臟病變。從小鼠肝臟切取約5 mm×5 mm×2 mm大小組織，置40 g/L多聚甲醛固定24 h，石蠟包埋，2 μm厚度連續(xù)切片，HE染色、Masson染色后在顯微鏡下觀察肝臟病理學(xué)改變，Image-Pro Plus對(duì)纖維化病變進(jìn)行半定量分析。

1.2.4ELISA檢測(cè)血清中華支睪吸蟲(chóng)特異性IgG抗體于感染后第112天，摘眼球取血，分離血清。用10 μg/mL華支睪吸蟲(chóng)蟲(chóng)體抗原(CA)包板，4℃過(guò)夜；37℃復(fù)溫30 min；加入待檢血清，37℃反應(yīng)1 h；加入HRP標(biāo)記的IgG抗體37℃反應(yīng)30 min，底物反應(yīng)10 min～30 min后，顯色，酶標(biāo)儀測(cè)OD值。

2結(jié)果

2.1肝臟組織肉眼觀察

感染組小鼠被毛無(wú)光澤，腹部隆起，剖殺后觀察肝臟組織，感染組6只小鼠肝臟組織尤其是肝左葉腫大明顯，包膜緊張，多個(gè)白色透明樣大水泡突出肝組織表面，切開(kāi)后有白色清亮液體流出。肝臟色澤偏暗，局部有黑褐色點(diǎn)狀斑塊，其邊緣有白色結(jié)節(jié)，質(zhì)韌(圖1)。

→.肝臟組織表面白色透明水泡

→.Cystic dilatation on the surface of the liver

A.正常組小鼠肝臟；B.感染組小鼠肝臟

A.Liver of the normal mice;B.Liver of the infected mice

圖1正常與華支睪吸蟲(chóng)感染FVB小鼠肝臟組織比較

Fig.1Comparison of liver between normal and infected FVB mice

2.2蟲(chóng)卵檢查結(jié)果

感染后25 d，小鼠蟲(chóng)卵檢查結(jié)果顯示，5只小鼠蟲(chóng)卵檢查陽(yáng)性，陽(yáng)性率為83.3%，高于先前報(bào)道的C57/BL6小鼠、昆明小鼠、Balb/c小鼠[6]。

2.3HE染色結(jié)果

正常組小鼠肝細(xì)胞排列整齊，肝小葉結(jié)構(gòu)完整，匯管區(qū)無(wú)炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，膽管無(wú)擴(kuò)張?jiān)錾?。感染組小鼠增生的膽管中見(jiàn)及寄生的完整華支睪吸蟲(chóng)成蟲(chóng)蟲(chóng)體，結(jié)構(gòu)清晰可見(jiàn)，子宮內(nèi)有大量蟲(chóng)卵。膽管管腔主要表現(xiàn)兩種形態(tài)，一部分為均質(zhì)紅染似玻璃樣變，一種為白色透明樣的似空泡性變。外圍大量纖維組織增生伴炎性細(xì)胞浸潤(rùn)。肝細(xì)胞溶解壞死，肝小葉結(jié)構(gòu)破壞嚴(yán)重(圖2)。

A.正常組小鼠肝臟(100×)；B.正常組小鼠肝臟(400×)；

C.感染組小鼠肝臟(100×)；D.感染組小鼠肝臟(400×)

A.Liver of the normal mice(100×);B.Liver of the normal mice(400×)；

C.Liver of the infected mice(100×);D.Liver of the infected mice(400×)

圖2HE染色觀察華支睪吸蟲(chóng)感染

FVB小鼠肝臟組織病理變化

Fig.2Hepatic pathological lesions of FVB mice infected with

Clonorchissinensis(HE staining)

2.4Masson染色結(jié)果

與正常組相比，經(jīng)Image-Pro Plus軟件計(jì)算，感染組小鼠肝臟組織尤其是蟲(chóng)體周?chē)l(fā)生大面積纖維化病變，顯著高于正常組(P<0.05，圖3、圖4)。

2.5感染組小鼠外周血中IgG表達(dá)水平

ELISA檢測(cè)小鼠血清特異性抗體，與正常組相比，感染組小鼠血清特異性抗體顯著升高(P<0.01，圖5)。

3討論

華支睪吸蟲(chóng)是明確的膽管癌致癌物[6]，為深入研究和有效防控華支睪吸蟲(chóng)病，需要借助易感的動(dòng)物模型進(jìn)行試驗(yàn)研究。先前已用過(guò)的家兔、豚鼠、沙鼠、狗和貓等動(dòng)物[7-8]，均缺少相應(yīng)的商品化試劑，其應(yīng)用受到一定限制。小鼠具有形體小、經(jīng)濟(jì)、飼養(yǎng)容易等優(yōu)點(diǎn)，用于研究其免疫、病理生理功能等所用試

A.正常組小鼠肝臟(40×)；B.正常組小鼠肝臟(100×)；

C.感染組小鼠肝臟(40×)；D：感染組小鼠肝臟(100×)

A.Liver of the normal mice(40×);B.Liver of the normal mice(100×)；

C.Liver of the infected mice(40×);D.Liver of the infected mice(100×)

圖3Masson染色觀察華支睪吸蟲(chóng)感染

FVB小鼠肝臟纖維化病理變化

Fig.3Liver fibrosis in the infected FVB mice (Masson staining)

圖4　Masson染色觀察華支睪吸蟲(chóng)感染

圖5　ELISA法檢測(cè)華支睪吸蟲(chóng)感染

劑齊全，且多已商品化，是研究華支睪吸蟲(chóng)病的致病機(jī)制的理想模型。張榮光[9]報(bào)道與家兔、大鼠和沙鼠等動(dòng)物相比，小鼠感染華支睪吸蟲(chóng)后的成蟲(chóng)檢出率低。本實(shí)驗(yàn)室前期對(duì)Balb/c小鼠、昆明小鼠和C57/BL6小鼠對(duì)華支睪吸蟲(chóng)易感性進(jìn)行研究發(fā)現(xiàn)，不同品系小鼠存在很大差異，其中Balb/c小鼠較為易感，其次是昆明小鼠，再次是C57/BL6小鼠。為進(jìn)一步尋找對(duì)于華支睪吸蟲(chóng)更為易感的實(shí)驗(yàn)小鼠，本試驗(yàn)采用FVB小鼠作為感染的試驗(yàn)對(duì)象，經(jīng)觀察發(fā)現(xiàn)該品系小鼠感染華支睪吸蟲(chóng)后肉眼觀小鼠肝臟水泡樣病變嚴(yán)重，橫切面均可見(jiàn)及蟲(chóng)體，膽管增粗；特異性IgG抗體均為陽(yáng)性，且蟲(chóng)卵陽(yáng)性率為83.3%。王貴燕等[10]報(bào)道，華支睪吸蟲(chóng)感染豚鼠后肝組織鏡下可見(jiàn)蟲(chóng)卵，周?chē)装Y反應(yīng)嚴(yán)重，并有膽管擴(kuò)張管壁變厚。本試驗(yàn)中，F(xiàn)VB小鼠肝臟可見(jiàn)成蟲(chóng)，其子宮充滿蟲(chóng)卵，蟲(chóng)體周?chē)罅垦仔约?xì)胞浸潤(rùn)，并有纖維組織包繞。膽管管壁增厚，膽管不僅擴(kuò)張，增生更為顯著，增生的膽管部分管腔均質(zhì)紅染，很可能是因?yàn)槟懝芏氯麑?dǎo)致膽汁淤積管腔中所致。華支睪吸蟲(chóng)感染宿主肝臟中細(xì)胞外基質(zhì)的產(chǎn)生和降解紊亂，使其大量堆積，從而形成纖維化病變[11-12]。本試驗(yàn)結(jié)果顯示，感染組小鼠肝臟組織出現(xiàn)大面積纖維化病變，尤其是蟲(chóng)體寄生的膽管及增生的膽管周?chē)鯙閲?yán)重。FVB小鼠肝臟大面積纖維化，蟲(chóng)體寄生的膽管及增生的膽管周?chē)绕鋰?yán)重。肝纖維化是華支睪吸蟲(chóng)引起的急慢性肝炎的的最基本的病理特征，是多種肝病的前兆，如肝硬化甚至肝癌，膽管癌。由于肝纖維化是一個(gè)相對(duì)而言可以自我修復(fù)的病變，因此，可通過(guò)動(dòng)物模型研究治療肝纖維化以達(dá)到及時(shí)有效的阻止病變進(jìn)一步發(fā)展的目的[13]。

本試驗(yàn)所觀察到華支睪吸蟲(chóng)感染FVB小鼠，有感染率高、病變明顯、病情持續(xù)時(shí)間長(zhǎng)等特點(diǎn)，可更直觀觀察華支睪吸蟲(chóng)病的病理學(xué)特征，為華支睪吸蟲(chóng)致病機(jī)制研究,以及預(yù)防和治療藥物的開(kāi)發(fā)提供研究材料。

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Experimental Study onClonorchissinensisInfected FVB Mice

ZHANG Bei-bei,ZHANG Bo,SHEN Li-ping,LI Bo,YAN Chao,TANG Reng-xian,ZHENG Kui-yang

(DepartmentofPathogenicBiologyandImmunology,XuzhouMedicalCollege,Xuzhou,Jiangsu,221004,China)

Abstract:In order to investigate the histopathological lesions in liver of the Clonorchis sinensis infected FVB mice, twelve healthy female FVB mice were divided into two groups:normal and infected model groups randomly (n=6).Each mouse was infected with 45 metacercariae orally.The eggs in the feces which were digested by NaOH solution were found in 25 d post infection.Hematoxylin and eosin (H&E) and Masson's trichrome (MT) were used for analysis of liver pathology.ELISA was used to detect the level of C.sinensis specific IgG in peripheral blood sera which was collected on 112 d post infection (p.i.).There were white nodules and even cystic dilatation in the liver on 112 d p.i.The positive rate of eggs was 83.3% in the infected group, compared with the control.As showed by HE staining,C.sinensis adult worm could be observed,and there were seriously inflammatory cell infiltration and fibrosis tissues with scattered necrosis around biliary ducts.Moreover,the infection resulted in swollen hepatocytes,narrowed hepatic sinusoid and proliferated biliary epithelial cells severely.A large area of fibrosis was accompanied with the proliferated bile ducts around the worm.The level of IgG was significantly higher in the infected group (P<0.01).These data showed severe hitopathological lesions in liver of C. sinensis infected FVB mice.Therefore,the present study may provide experimental basis for further studying the mechanism of clonorchiasis.

Key words:Clonorchis sinensis;FVB mouse; liver;pathological lesion

文章編號(hào):1007-5038(2016)03-0006-04

中圖分類號(hào):S852.735

文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼:A

作者簡(jiǎn)介：張蓓蓓(1990-)，女，江蘇鹽城人，碩士研究生，主要從事寄生蟲(chóng)感染與免疫方面的研究。*通訊作者

基金項(xiàng)目：國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目(81171590,31302077)；家畜疫病病原生物學(xué)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室開(kāi)放課題(SKLVEB2013KFKT005)；江蘇高校優(yōu)勢(shì)學(xué)科建設(shè)工程資助項(xiàng)目(PAPD)

收稿日期：2015-08-11