禽流感病毒研究進展

包小萌　范 磊?。ㄉ綎|省海陽市動物疫病預防與控制中心　265100）高延娜?。ㄉ綎|省海陽市二十里店鎮(zhèn)畜牧獸醫(yī)站）　宋麗霞　（山東省海陽市辛安鎮(zhèn)獸醫(yī)站）

禽流感病毒研究進展

包小萌范 磊（山東省海陽市動物疫病預防與控制中心265100）高延娜（山東省海陽市二十里店鎮(zhèn)畜牧獸醫(yī)站）宋麗霞（山東省海陽市辛安鎮(zhèn)獸醫(yī)站）

禽流感病毒(avian influenza virus, AIV)可引起禽類的呼吸器官或全身性感染。高致病性禽流感病毒可以直接感染禽類，偶爾也能直接或間接感染人類。禽流感的流行會嚴重影響畜牧業(yè)發(fā)展和國際進出口貿易。低致病性禽流感病毒可以經(jīng)基因突變或基因重配轉變成高致病性禽流感病毒。高致病性禽流感病毒是在人群中引發(fā)流感的一個潛在危險因素，并會嚴重地威脅人類健康。因此對禽流感病毒的檢測和監(jiān)測以及對其藥物的研發(fā)和疫苗的研制，已成為世界各國政府及衛(wèi)生防疫部門日益關注和積極著手解決的重大問題之一。本文將扼要介紹禽流感病毒的發(fā)展歷程、癥狀特征、發(fā)病機制及藥物研發(fā)和疫苗研制的現(xiàn)狀。

1　禽流感的基本情況

（1）禽流感(Avian Influenza, AI)是禽流行性感冒的簡稱，又名真性雞瘟或歐洲雞瘟，是由A型流感病毒引起的一種禽類急性高度致死性傳染病，以急性敗血性死亡到無癥狀帶毒等多種病征為特點[1]。該病也可傳染給人類。1878年，Porroncito首先在意大利報道該病。1955年Schafer首次證明禽流感病原是A型流感病毒[2]。該病先后傳入其他歐洲國家、南美、東南亞、美國及前蘇聯(lián)等國家和地區(qū)。禽流感的感染譜很廣，大多數(shù)的家禽、野禽及水禽都可感染[3]。由于AIV抗原性和致病力的易變性及不同血清型毒株間缺乏交叉保護性，100多年來禽流感在世界各地多次流行，近來又在東南亞一些國家和我國部分地區(qū)流行，對養(yǎng)禽業(yè)造成重大經(jīng)濟損失。隨著生物技術的飛速發(fā)展，國內外學者在禽流感病原學、流行病學、診斷技術和疫苗研制等方面的研究取得了較大的進展。（2）禽流感通常只感染鳥類，少見情況會感染豬。禽流感病毒高度針對特定物種，但在罕有情況下會跨越物種障礙感染人。自從1997年在香港發(fā)現(xiàn)人類也會感染禽流感之后，此病癥引起全世界衛(wèi)生組織的高度關注。目前國內外都沒有針對H7N9禽流感病毒的疫苗。

2　傳播歷程

（1）1900年代早期，禽流感在意大利被首次確認。1960年1000多只普通燕鷗在南非死亡，這是第一次發(fā)現(xiàn)禽流感引發(fā)的高死亡率案例，屬于H5N3型。（2）根據(jù)聯(lián)合國環(huán)境規(guī)劃署遷徙物種公約工作組公布的技術文件指出，H5N1亞型禽流感的源頭來自集中飼養(yǎng)的家禽，極端的飼養(yǎng)環(huán)境造成病毒的變異，鳥類貿易、濫用疫苗、運輸?shù)热祟惢顒右矊η萘鞲胁《镜淖儺愑兄苿拥淖饔肹4]。野外研究顯示，絕大多數(shù)罹患禽流感的野生鳥類，都是在遷徙、越冬和繁殖過程中與人類飼養(yǎng)的家禽有近距離接觸的物種，而那些自始至終遠離人類社會的野生鳥類，即便是水鳥，并且保持很高的種群密度，至今仍未有禽流感暴發(fā)的報告。（3）源自飼養(yǎng)場的病毒感染野生鳥類，尤其是水鳥，這使得病毒隨著鳥類遷徙而發(fā)生擴散。2003年末到2004年初在東亞暴發(fā)的禽流感被認為驗證了候鳥傳播病毒的假設：疫癥先在韓國南部，候鳥的中途站出現(xiàn)，然后途經(jīng)香港，最后到達越南。由于香港相對衛(wèi)生環(huán)境較好，以及先前已具有對付疫癥的經(jīng)驗，病癥并未有在當?shù)卦斐纱笠?guī)模暴發(fā)。但衛(wèi)生環(huán)境相對較差的越南，不單使禽鳥死亡，還對人類造成影響。至2004年1月底已有接近20人死亡。然而鳥類學者則指出，根據(jù)西伯利亞－東亞－澳大利亞鳥類遷徙通道的規(guī)律，早在每年的11月末到12月初候鳥就已經(jīng)基本完成從北向南的遷徙，此前在香港進行的無線電定位跟蹤研究也顯示，在仲冬季節(jié)幾乎沒有鳥類遷飛的活動[5]。另據(jù)觀測，絕大部分水鳥的越冬地位于北緯20度以北地區(qū)，只有白眉鴨和針尾鴨會遷至越南，然而其過境時間卻在12月初。鳥類學者普遍認為從時間和空間上，2003年底暴發(fā)的禽流感與候鳥遷徙并無重疊，故此大部分鳥類學者并不認同候鳥傳播病毒的說法。（4）被指傳播禽流感病毒的不僅僅是候鳥，據(jù)2005年10月27日第三屆非歐亞遷徙性水鳥保護協(xié)定締約國大會公報指出，攜帶和傳播禽流感病毒的途徑除了候鳥的遷徙外，還有牲畜的運輸、家禽和籠鳥運輸、與這行業(yè)相關的活動、合法或非法的鳥類貿易以及人類的交通[6]。（5）在家禽中鴨、鵝一旦受到感染，抗病能力比較高之余，病發(fā)后的生存機會也很高。然而，雞只對流感病毒非常敏感，一旦受到感染的話，不單止傳播得快，而且染病的雞很快就會死亡。農民過去一般稱這種現(xiàn)象為“發(fā)雞瘟”，并未有特別留意背后的原因或病發(fā)的機制，直到出現(xiàn)禽流感經(jīng)動物向人傳播并至死的病例后，人們才開始關注禽流感。目前人們應對禽流感的主要手段，是對染病以及可能染病的家禽集體屠殺后進行消毒深埋等無害化處理，以免病毒積累，并進而影響人類。（6）在2004年和2005年的禽流感疫情中，也有媒體指出禽流感病毒源自野生鳥類并傳播至飼養(yǎng)場，進而傳給人類。建議加強對候鳥遷徙的監(jiān)控，少數(shù)激進者甚至主張在撲殺家禽之外對遷徙的候鳥進行撲殺，但這種說法并未獲得鳥類學者的認可，撲殺候鳥的建議更招致環(huán)保團體的反對[7]。

3　癥狀體征

3.1潛伏期尚未有準確報道。目前估計在7d以內，一般為1～3d。

3.2臨床癥狀H5N1病毒感染者多呈急性起病，早期表現(xiàn)類似普通型流感，主要為發(fā)熱，體溫大多持續(xù)在39℃以上，熱程1～7d，一般為3～4d，可伴有流涕、鼻塞、咳嗽、咽痛、頭痛、肌肉酸痛和全身不適。部分患者可有惡心、腹痛、腹瀉、稀水樣便等消化道癥狀。多數(shù)輕癥病例預后良好[8]。重癥患者病情發(fā)展迅速，可出現(xiàn)肺炎、急性呼吸窘迫綜合征、肺出血、胸腔積液、全血細胞減少、腎衰竭、敗血癥、休克及Reye綜合征等多種并發(fā)癥，嚴重者可致死亡。治療中若體溫持續(xù)超過39℃，需警惕重癥傾向。H7N7感染者癥狀較輕，大多數(shù)患者可出現(xiàn)眼結膜炎，少數(shù)患者伴有溫和的流感樣癥狀[9]。H9N2感染者僅引起一過性的流感癥狀，尚無死亡病例報道。

3.3體征重癥患者可有肺部實變體征等。

3.4并發(fā)癥多數(shù)輕癥病例預后良好，且不留后遺癥。某些病例(特別是H5N1感染者)病情發(fā)展迅速，出現(xiàn)重癥肺炎、急性呼吸窘迫綜合征、肺出血、胸腔積液、全血細胞減少、多臟器功能衰竭、敗血癥、休克及Reye綜合征等多種并發(fā)癥，可導致死亡。1997年香港18例病人中有8例為輕度上呼吸道感染，4例出現(xiàn)重癥肺炎，給予呼吸支持后最終痊愈。6例病人監(jiān)護后仍死于各種并發(fā)癥[10]。

4　發(fā)病機制

禽流感病毒(A)Ⅳ具有較強的變異性。AⅣ有8個基因組片斷，當2個或2個以上的不同病毒粒子同時感染一個宿主細胞時，在病毒的增殖第12卷第2期過程中，不同病毒粒子的8個基因組片斷可以隨機互相交換從而發(fā)生核酸片斷水平上的重新組合，這種現(xiàn)象稱為基因重排。在抗原漂變和抗原轉變的共同作用下，流感病毒表面糖蛋白血凝素(HA)和神經(jīng)氨酸酶(NA)能夠不斷進化獲得更高的識別唾液酸、膜融合蛋白等活性，達到HA與NA活性新的平衡，從而具有更強的感染力、復制力。

4.1血凝素(HA)與致病性的關系（1）HA受體對致病性的影響HA受體是宿主細胞表面含唾液酸(sA，又稱N一乙酞神經(jīng)氨酸)結尾寡糖鏈的糖蛋白和糖脂，唾液酸是A型和B型流感病毒受體表面必須具備的基本成分，有a-2，3-半乳糖-N-乙酞神經(jīng)氨酸和a-2，6-半乳糖-N-乙酞神經(jīng)氨酸兩種。連有a-2，3-半乳糖-N-乙酞神經(jīng)氨酸的糖蛋白和糖脂是禽流感病毒受體，多存在于禽類的呼吸道和腸道黏膜上皮，以及人類下呼吸道的支氣管和其前端的肺泡細胞上。而連有a-2，6-半乳糖-N-乙酞神經(jīng)氨酸的糖蛋白和糖脂是人類普通感冒病毒(B型流感病毒)的受體，多存在于人類咽喉和鼻腔的細胞表面[11]。禽流感病毒感染的第-步就是其HA蛋白與宿主細胞上的受體結合，其宿主范圍與存在于宿主體內的a-2，3-半乳糖-N-乙酞神經(jīng)氨酸寡糖受體分布有關[12]。此外，許多動物血清中含有HA受體的競爭抑制劑，也是影響流感病毒宿主特異性和致病力的一個重要因素。（2）HA裂解位點結構對致病性的影響禽流感病毒HA蛋白前體裂解為HAl和HA2在病毒入侵細胞及決定病毒致病力方面起著關鍵作用。HA裂解位點上堿性氨基酸的多少和宿主體內蛋白裂解酶的分布是影響其裂解的主要原因[13]，也是影響病毒致病能力及其在機體內擴散能力的主要因素。低致病力禽流感病毒在HA裂解位點上只有1個或2個堿性氨基酸，均為精氨酸，這種結構只能被存在于呼吸道和消化道內的精氨酸特異蛋白酶識別并裂解。而高致病力禽流感病毒HA裂解位點具有多個堿性氨基酸，可被機體大多數(shù)組織細胞內的蛋白酶識別并裂解[14]，具有廣泛的嗜細胞性。因此，低致病力禽流感病毒感染一般只在呼吸道和消化道內局部繁殖。而高致病力禽流感病毒一旦進入機體就會迅速擴散，導致全身多個組織發(fā)病并死亡。

4.2神經(jīng)氨酸酶(NA)與致病性的關系NA是流感病毒包膜上重要的糖蛋白，是由4個亞基組成四聚體。主要結構包括胞漿尾部、跨膜區(qū)、桿部和球狀頭部4個部分。其中頭部具有水解酶活性，可水解感染細胞表面糖蛋白末端的神經(jīng)氨酸與相鄰糖基的а2糖苷鍵，切除病毒表面和感染細胞表面的唾液酸。NA的作用有三方面：（1）破壞細胞膜上的病毒特異性受體，使病毒從感染細胞膜上釋放；（2）可以防止新生病毒的自身凝集，允許病毒擴散并增強其感染能力；（3）NA還可促進病毒從呼吸道黏液向周圍組織擴散。NA可以影響宿主細胞對HA的裂解活性，NA與HA之間的平衡會影響到流感病毒對靶細胞的感染與釋放。流感病毒AZWSN/33對小鼠具有高致病性就是因為該病毒的NA可以和細胞的纖溶酶原結合并解離，這一過程激活了纖溶酶原使之水解為纖溶蛋白酶，這種蛋白酶可以裂解HA。NA與纖溶酶原結合需要在NA的C末端包含Lys。到目前為止還沒有發(fā)現(xiàn)其他流感病毒的NA可以與纖溶酶原結合。NA也可以通過其他途徑影響流感病毒的致病性，增加NA上糖基化位點可導致H5N1亞型流感病毒對雞的致病性增強[15]。

4.3聚合酶與致病性的關系流感病毒的RNA聚合酶分為PBl、PB2、PA3個亞基。其中，PBl亞基具有RNA聚合酶活性，既參與mRNA轉錄又參與vRNA復制，同時連接PB2與PA。PB2亞基具有識別宿主mRNA并切割其5’帽子結構內切酶活性，同時具有3’-5’核酸內切酶的活性，負責校對功能[16]。PA功能尚不清楚，可能參與vRNA復制。在流感病毒的3個聚合酶中，對PB2基因與該病毒致病性的關系研究最為深入。如從1997香港禽流感感染者分離到的兩株流感病毒HA均具有多個堿性氨基酸組成的裂解位點。但對小鼠的致病性卻完全不同，A/Hong Kong/483/97對小鼠是高致病性的，可造成小鼠的全身性感染并致小鼠死亡。而A/HongKong/486/97則只引起非致死性呼吸道感染。Hatta等[17]通過突變分析證實，這兩種病毒的致病性強弱與PB2上627位氨基酸有關。在627位上具有Lys的A/Vietnam/1203/04對雪貂具有高致病性，2004年從鵪鶉體內分離到的H5N1亞型流感病毒在627位上是Glu，其對雪貂也具有高致病性[18]。關于PB2基因627位氨基酸的作用與功能，有兩個假設：①該位置上的氨基酸決定了病毒聚合酶與宿主必需因子間的相互作用；②該位置上的氨基酸與病毒RNA聚合酶在不同溫度下的活性有關。病毒在禽類和哺乳動物中復制時是處于不同溫度下的，人流感病毒在上呼吸道復制時所處的溫度約為30cI=，禽流感病毒在禽類的腸道中復制時所處的溫度則約為41℃。在哺乳動物細胞內，來源于禽流感病毒的聚合酶復合物在30℃時的活性要低于在41℃條件下。

4.4細胞因子與致病性的關系Seo等[16]研究認為，細胞遭到流感病毒襲擊后，通常會釋放出被稱為“細胞因子”的免疫分子，激發(fā)免疫系統(tǒng)攻擊病毒，保護未受感染的細胞。但是，細胞因子對引起禽流感的H5N1病毒無任何反應。并認為1997年肆虐我國香港的H5N1 AIV能夠靠1個變異基因掩藏自己，躲避人體免疫系統(tǒng)的攻擊。這個特殊的基因即非結構基因，其分子的第92位為谷氨酸，它使該病毒具有躲避免疫系統(tǒng)攻擊的能力[19]。有人將此基因移植人另一種AIV(H1N1)，用來感染試驗，結果發(fā)現(xiàn)，被改造的病毒感染的動物發(fā)病癥狀比未改造的病毒感染的要嚴重得多，病情持續(xù)時間更長。

5　禽流感病毒的藥物研發(fā)及疫苗研制

使用抗病毒藥物是降低禽流感發(fā)病率及死亡率的重要手段之一。據(jù)文獻報道，M2離子通道抑制劑(adamantanes)和神經(jīng)氨酸酶抑制劑(oseltamivir和za-namivir)對流感病毒均有較好的抑制作用(Gubareva etal.，2000)。神經(jīng)氨酸酶抑制劑的作用主要是抑制病毒感染細胞，同時能干擾病毒從細胞內釋放的過程。使用抗病毒藥物的一般原則是越早越好。如果在病毒感染引起的臨床癥狀出現(xiàn)很長一段時間后再用藥，則抗病毒的效果往往不佳?？共《舅幬锎嬖诘囊粋€普遍問題是長期服用后會誘導產生耐藥的變異株。多年來的研究表明對易感人群進行大面積疫苗接種可以有效地預防流感病毒感染、減輕臨床癥狀及降低死亡率[20]。因此開發(fā)和研制有效的HPAIV疫苗亦是預防禽流感的重要一環(huán)。一般來講，如果AIV的疫苗株與流行變異株的免疫原性越接近時，則由疫苗接種所產生的對機體的保護作用也就會越強。目前世界上大多采用滅活AIV疫苗(Horimoto and Kawaoka，2006)。同時也有人嘗試DNA疫苗(Forde，2005)以及利用反向遺傳的手段來研制禽流感疫苗(Neumann etal.，1999; Hoffmann et al.，2000; Neumann et al.，2005)。禽流感病毒研究概述Current Research on Avian Influenza Viruses197基因組學與應用生物學Genomics and Applied Biology自2005年起，我國已開始對禽類實行強制性的疫苗接種以圖預防HPAIV(H5N1亞型)的感染。在墨西哥，LPAIV(H5N2亞型)疫苗已用于免疫雞群來預防AIV的感染(Swayne et al.， 1997; Capua and Marngoan，2003)。流感病毒基因的高度變異性常會使流感病毒疫苗生產株與流行株的抗原性不相吻合，使得疫苗對流感病毒流行株的免疫預防效果欠佳。目前世界上有些國家已開始致力于研制流感通用疫苗(deFilette et al.，2005)。這種疫苗從理論上來講可以使接種的人群抵御多種流感病毒亞型變異株的感染，它代表著今后新型禽流感疫苗研發(fā)的趨勢之一。

6　結語

自從1997年在香港首次發(fā)現(xiàn)高致病性禽流感病毒(HPAIV)可以直接感染人后，世界上的其它國家也陸續(xù)出現(xiàn)了一些HPAIV感染人的病例。HPAIV感染人能引起呼吸系統(tǒng)受損，嚴重的甚至可以造成患者死亡。AIV在被感染的禽類體內不斷發(fā)生基因突變或基因重配，為禽流感在人群中的流行創(chuàng)造了必要的條件。從分子生物學的角度對HPAIV的毒力、細胞嗜性、宿主范圍、致病機制以及流行規(guī)律進行深入探究，將會使我們對HPAIV的生活周期及繁殖特性有更為清晰的了解，為抗HPAIV藥物及疫苗的研制提供堅實的科學依據(jù)。相信經(jīng)過世界各國科學家們長期不懈的共同努力，人們將會在未來研制出快速鑒別HPAIV亞型的診斷試劑同時生產出高效的抗HPAIV藥物及疫苗，為防止禽流感在世界范圍內的大流行做好充分的理論、物質和技術儲備。

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