山東省某養(yǎng)雞場(chǎng)禽流感發(fā)病情況的調(diào)查

孫麗麗

（山東省榮成市蔭子畜牧獸醫(yī)站，山東榮成 264300）

山東省某養(yǎng)雞場(chǎng)禽流感發(fā)病情況的調(diào)查

孫麗麗

（山東省榮成市蔭子畜牧獸醫(yī)站，山東榮成 264300）

禽流感（avinaninuenza，AI）是由A型流感病毒引起的一種禽類（家禽和野鳥(niǎo)）的傳染性疾病。在各種禽類中的流行有多種表現(xiàn)形式，可見(jiàn)亞臨診癥狀、輕度上呼吸道感染以及急性致死性等。本實(shí)驗(yàn)調(diào)查了實(shí)習(xí)養(yǎng)雞場(chǎng)中雞群禽流感免疫效果和發(fā)病狀況，為禽流感的預(yù)防和治療提供一定的指導(dǎo)作用。

A型流感病毒；預(yù)防；治療

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

禽流感H5標(biāo)準(zhǔn)毒株、陰性血清和陽(yáng)性血清均有哈爾濱獸醫(yī)研究所生產(chǎn)；禽流感診斷試劑盒由武漢科前動(dòng)物生物制品有限公司生產(chǎn)；棉拭子，96孔微量反應(yīng)板，瓊脂糖均有實(shí)習(xí)公司提供。

1.2 試劑的制備

1%雞紅細(xì)胞懸浮液制備：采集至少3只SPF公雞或無(wú)禽流感和新城疫等抗體的健康公雞的血清與等體積的阿氏液混合，用PH7.2 0.01mol/LPBS洗滌3～5次，每次均以1000轉(zhuǎn)/min離心10min，將最后一次離心得到的紅細(xì)胞，用PBS配成體積分?jǐn)?shù)為1%紅細(xì)胞懸浮液，4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

pH7.2 0.01mol/LPBS的制備：（1）配置25×PB：稱取2.71g磷酸氫二鈉和0.79g磷酸二氫鈉加蒸餾水至1000ml；（2）配置1×PBS：量取40mol25×PB，加入加入8.5g氯化鈉，加蒸餾水至1000ml，用氫氧化鈉調(diào)至PH7.2，滅菌或過(guò)濾。PBS一經(jīng)使用，于4℃保存不超過(guò)3周。

阿氏液：（Alsevers）制備：葡萄糖2.05g，檸檬酸0.055g，氯化鈉0.12g，加蒸餾水至100ml，散熱溶解后調(diào)至PH6.1，69KPa高壓滅菌15min，4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

瓊脂板的制備：稱取進(jìn)口瓊脂1.0g加入100mlPH7.2、0.01mol/ LPBS中，在水浴鍋加熱充分融化，加入8.0g氯化鈉，充分溶解后加入1%硫柳汞溶液1ml，冷卻至45℃～50℃時(shí)，倒入平皿制成3mm厚的瓊脂板。

1.3 樣品采集與處理

分別從2個(gè)養(yǎng)殖場(chǎng)采取20只40日齡雞的血樣和泄殖腔拭子及喉頭拭子，同一場(chǎng)分為一組，記為組一、組二，分別為每組中各只雞編號(hào)，記為1、2、3至20。血液離心取血清備用；喉頭拭子和泄殖腔拭子用無(wú)菌棉拭子于禽類喉頭或泄殖腔中蘸取滲出液，然后浸泡于1ml樣品處理液中，劇烈震蕩1min后，擠出棉拭子中的液體，棄棉拭子，液體凍融3次后于36～38℃作用15min，在2～8℃下以12000r/min離心5min，取上清待檢。

1.4 微量血凝試驗(yàn)（HA）

取干凈的96孔微量反應(yīng)板一塊，操作如下：（1）用微量移液管向微量反應(yīng)板第1行每孔加入PBS25μl；（2）微量移液器吸取禽流標(biāo)準(zhǔn)H5抗原25μl加入孔1，用移液器反復(fù)吹打8～10次混勻，吸取25μl于孔2，再次吹打混勻后吸取25μL于孔3，如此依次稀釋到孔11，孔11混勻后吸出25μl棄掉，換吸頭?？?2不加抗原，只加PBS做紅細(xì)胞對(duì)照；（3）每孔再加PBS25μl；（4）每孔各家體積分?jǐn)?shù)為1%雞紅細(xì)胞懸浮液（充分搖勻）加入25μl立即置微量振蕩器上混勻1～2min。置20～25℃條件下靜置20min后觀察結(jié)果。紅細(xì)胞對(duì)照孔將成明顯的紐扣狀沉到孔底。

結(jié)果判定：將微量反應(yīng)板傾斜45度觀察紅細(xì)胞有無(wú)呈淚滴狀流淌，完全血凝（不流淌）的抗原最高稀釋倍數(shù)代表一個(gè)血凝單位（HAU）。

1.5 微量血凝抑制試驗(yàn)（HI）

取干凈的96孔微量反應(yīng)板一塊，操作如下：（1）根據(jù)血凝試驗(yàn)的測(cè)定結(jié)果配置4HAU的病毒抗原。以完全凝集的病毒最高稀釋倍數(shù)作為終點(diǎn)，重點(diǎn)稀釋倍數(shù)除以4即為含4HAU的抗原稀釋倍數(shù)。（2）用微量移液器自第1列孔至第11列孔加入25μlPBS，第12列孔加入25μlPBS。（3）用微量移液器吸取被檢血清25μl加入第1列孔，用移液器反復(fù)吹打8～10次混勻，吸取25μl于第2孔，再次吹打混勻后吸取25μl于孔3，如此依次稀釋到第10孔，混勻后吸出25μL棄掉。（4）1～11列孔均再加入含4個(gè)血凝單位抗原液25μl，第12列孔為紅細(xì)胞對(duì)照，不加抗原。（5）立即置振蕩器上振蕩混勻1～2min，于22～25℃條件下靜置感作20min。（6）每孔再加入1%雞紅細(xì)胞懸浮液25μl（混勻后加入），置振蕩器上振蕩1～2min，于22～ 25℃條件下靜置感作20分鐘后判定結(jié)果。紅細(xì)胞對(duì)照將成明顯的扣狀沉淀到孔底。（7）每次試驗(yàn)應(yīng)設(shè)已知滴度的陽(yáng)性血清、陰性血清、紅細(xì)胞對(duì)照和抗原對(duì)照。

結(jié)果判定：

將反映板傾斜45°，沉于孔底得紅細(xì)胞沿著傾斜面向下呈線狀流動(dòng)者為沉淀，表明紅細(xì)胞未被或者不被抗原凝集；如果孔底得紅細(xì)胞鋪平孔底，凝成均勻薄層，傾斜后紅細(xì)胞不流動(dòng)，說(shuō)明紅細(xì)胞被抗原凝集。

檢查各種對(duì)照：陰性對(duì)照孔血清滴度不大于22，陽(yáng)性對(duì)照孔血清誤差不超過(guò)一個(gè)滴度，紅細(xì)胞對(duì)照無(wú)血凝現(xiàn)象檢查結(jié)果才有效。HI效價(jià)小于或等于23判定HI試驗(yàn)陰性；HI效價(jià)等于24可疑，需重復(fù)試驗(yàn)；HI效價(jià)大于或等于24為陽(yáng)性。

在對(duì)照出現(xiàn)正確的情況下，以完全抑制紅細(xì)胞凝集的最大稀釋倍數(shù)為該血清的血清抑制滴度。能將4單位抗原凝集紅細(xì)胞的作用完全抑制的血清最高稀釋倍數(shù)，稱為該血清的紅細(xì)胞凝集抑制效價(jià)，用被檢血清稀釋倍數(shù)表示。

1.6 瓊脂糖凝膠免疫擴(kuò)散試驗(yàn)（AGID）

（1）打孔：用打孔器在瓊脂板上按6角圖案打孔，孔徑、孔距為3mm，瓊脂面朝上，玻片在酒精燈上過(guò)兩遍，燙手即可，以防瓊脂凝膠與玻片間有空隙，使樣品漏出。（2）加樣：用微量移液器吸取瓊脂抗原滴加入中間孔，陽(yáng)性血清加入周圍1，4空中，被檢血清按編號(hào)順序分別加入另外4個(gè)外周孔（2，3，5，6）每孔均以加滿不溢出為度，每加一個(gè)樣品換一個(gè)吸頭。（3）作用：加樣完畢后，靜置5～10分鐘待孔中液體吸干后，將培養(yǎng)皿輕輕放入加蓋濕盒內(nèi)于37℃恒溫培養(yǎng)箱中作用24～72h分別在24h、48h、72h對(duì)光觀察結(jié)果，并記錄。

結(jié)果判定：

陽(yáng)性：陽(yáng)性血清與抗原孔之間有明顯致密的沉淀線時(shí)，被檢血清與抗原之間也形成沉淀線，或者陽(yáng)性血清的沉淀線末端向毗鄰的被檢血清孔內(nèi)側(cè)彎者，此被檢血清判定為陽(yáng)性（+）

弱陽(yáng)性：被檢血清與抗原孔之間沒(méi)有沉淀線，但陽(yáng)性血清的沉淀線末端被檢血清孔偏移。此被檢血清判定為弱陽(yáng)性（需重復(fù)試驗(yàn)）如重復(fù)試驗(yàn)還是弱陽(yáng)性，則判為陰性（-）。

陰性：被檢血清與抗原孔之間不形成沉淀線，或者陽(yáng)性血清的沉淀線向毗鄰的被檢血清孔直伸或向外側(cè)偏彎者，此被檢血清判定為陰性（—）。

1.7 酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（ELISA）

（1）取酶標(biāo)板（根據(jù)樣品多少可拆開(kāi)分次使用），將20倍濃縮洗滌液用蒸餾水稀釋20倍后，洗板1次（200μl/孔）后拍干；（2）加入待檢樣品，每孔100μl，同時(shí)設(shè)陰、陽(yáng)性對(duì)照孔，每孔100μl，各1孔，置36～38℃作用30min；（3）洗滌5次，每次200μl/孔，每次約3min；（4）加入一抗（兔抗AIV-NP），100μl/孔，置36～38℃作用30min；（5）洗滌5次，每次200μl/孔，每次約3min；（6）加入羊抗兔IgG酶標(biāo)抗體，100μl/孔，置36～38℃作用30min；（6）洗滌5次，每次200μl/孔，每次約3min；（7）每孔加底物液A、底物液B各一滴（約50μl），混勻，室溫（20～25℃）避光顯色10min；（7）每孔加入終止液一滴（約50μl），混勻后測(cè)定結(jié)果。

結(jié)果判定：在酶標(biāo)儀上測(cè)各孔的OD630nm值。試驗(yàn)成立的條件是：陽(yáng)性對(duì)照孔的OD630nm值≥0.8，且≤2.0；陰性對(duì)照孔的OD630nm值＜0.2。樣品OD630nm值＞0.3時(shí)判為陽(yáng)性；樣品OD630nm值≤0.3時(shí)判為陰性。

2 結(jié)果與分析

2.1 微量血凝抑制試驗(yàn)（HA）結(jié)果

兩組各20只40日齡雞實(shí)驗(yàn)結(jié)果批次差異不大，最小6，最大9，說(shuō)明2個(gè)種雞場(chǎng)之間的免疫水平相差不大，該公司對(duì)種雞禽流感的預(yù)防工作觀念和認(rèn)識(shí)存較高，2個(gè)種雞場(chǎng)的免疫程序做的也較好。

2.2 瓊脂糖凝膠免疫擴(kuò)散試驗(yàn)（AGID）結(jié)果

AGID檢測(cè)結(jié)果：用標(biāo)準(zhǔn)AI高免血清與40份待檢樣品做AGID試驗(yàn)，所檢測(cè)的樣本均含有流感病毒抗體。

2.3 酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（ELISA）結(jié)果

ELISA檢測(cè)結(jié)果：兩組各20只40日齡雞ELSA血清OD630值，試驗(yàn)結(jié)果都為陽(yáng)性，OD值大多都超過(guò)0.7。

3 討論

禽流感，特別是高致病性禽流感，自從被發(fā)現(xiàn)以來(lái)，給養(yǎng)禽業(yè)造成了巨大的損失，由于禽流感病毒自身這些毒株已經(jīng)發(fā)生了變異，其基因序列氨基酸已經(jīng)發(fā)生了兩重甚至是三重的重組，有傳染給人的潛在威脅，而且各亞型在陸禽和水禽之間的相互傳播更加快了病毒基因的重組，這種重組給目前禽流感亞型的防制帶來(lái)了困難，可能會(huì)在下次的流感大流行中扮演重要角色，所以加強(qiáng)亞型毒株的變異株的監(jiān)測(cè)意義。

本次試驗(yàn)通過(guò)對(duì)山山東省聊城市的兩家種雞場(chǎng)進(jìn)行HI、AGID、ELISA等試驗(yàn)檢測(cè)，研究該地區(qū)禽流感發(fā)病情況。試驗(yàn)結(jié)果顯示：兩個(gè)種雞場(chǎng)雞群都具有較高禽流感的抗體，HI效價(jià)都大于4log2，即免疫合格。因此可以判定，兩家種雞場(chǎng)禽流感的免疫效果較好，無(wú)禽流感的發(fā)病情況。

[1]季大平，李超，劉立濤.山東省部分地區(qū)產(chǎn)蛋雞群低致病性禽流感免疫狀況調(diào)查[J].Shandong Journal of Animal Sciences& sveterinary Medicine，2013，（3）：48-49.