淫羊藿女貞子影響激素干預(yù)哮喘大鼠淋巴細(xì)胞凋亡的作用

年宏蕾 劉仁慧 肖般若 惠 婭 楊 燕 羅良濤 許利平 王秀娟（首都醫(yī)科大學(xué)首都醫(yī)科大學(xué)中醫(yī)藥學(xué)院中醫(yī)絡(luò)病研究北京市重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京，100069）

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淫羊藿女貞子影響激素干預(yù)哮喘大鼠淋巴細(xì)胞凋亡的作用

年宏蕾 劉仁慧 肖般若 惠 婭 楊 燕 羅良濤 許利平 王秀娟
（首都醫(yī)科大學(xué)首都醫(yī)科大學(xué)中醫(yī)藥學(xué)院中醫(yī)絡(luò)病研究北京市重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京，100069）

摘要目的：研究大鼠哮喘模型激素局部及全身給藥治療的同時(shí)合用淫羊藿女貞子對(duì)淋巴細(xì)胞凋亡的影響。方法：建立大鼠哮喘模型，分別以布地奈德霧化4周（局部給藥）及地塞米松腹腔注射治療2周（全身給藥）治療，同時(shí)配合灌胃淫羊藿女貞子煎液，流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)支氣管肺泡灌洗液（BALF）與血淋巴細(xì)胞凋亡的表達(dá)。結(jié)果：與正常組相比，哮喘大鼠BALF中淋巴細(xì)胞凋亡顯著降低（P＜0. 05）；激素局部干預(yù)及合用中藥淫羊藿女貞子均可上調(diào)BALF中淋巴細(xì)胞凋亡水平（P＜0. 01），且合用組上調(diào)作用較單用組顯著升高（P＜0. 01）；而激素全身干預(yù)大鼠血及BALF中淋巴細(xì)胞凋亡表達(dá)均顯著上調(diào)（P＜0. 05），但合用淫羊藿女貞子后則下調(diào)血淋巴細(xì)胞凋亡水平接近于正常（P＜0. 05）。結(jié)論：激素局部給藥的同時(shí)合用平補(bǔ)陰陽(yáng)藥對(duì)淫羊藿女貞子，產(chǎn)生協(xié)同上調(diào)血及BALF淋巴細(xì)胞凋亡的作用；而激素全身給藥的同時(shí)合用平補(bǔ)陰陽(yáng)藥對(duì)淫羊藿女貞子，則抑制激素全身應(yīng)用后過(guò)度促進(jìn)血淋巴細(xì)胞凋亡的影響。

關(guān)鍵詞哮喘；淫羊藿／女貞子；糖皮質(zhì)激素；淋巴細(xì)胞凋亡；大鼠

Effects of the Combination of Herba Epimedii and Fructus Ligustri Lucidi on Lymphocyte Apoptosis in the Asthmatic Rats with Glucocorticoid Intervention

Nian Honglei，Liu Renhui，Xiao Banruo，Hui Ya，Yang Yan，Luo Liangtao，Xu Liping，Wang Xiujuan
（School of Traditional Chinese Medicine，Capital Medical University and Beijing Key Laboratory of Traditional Chinese Medicine Collateral Disease Theory Research，Beijing 100069，China）

Abstract Objective：To investigate the effects of the combination of Herba Epimedii and Fructus Ligustri Lucidi on lymphocyte apoptosis in the asthmatic rats with glucocorticoid intervention. Methods：Asthmatic model was duplicated and the lymphocyte apoptosis in the blood and BALF was observed by flow cytometry with the oral administration of the combination of Herba Epimedii and Fructus Ligustri Lucidi accompanied by the injection of dexamethasone for two weeks（systemic administration）and the atomization inhalation of Budesonide for four weeks（local administration）. Results：Compared with the normal group，apoptosis of lymphocytes in BALF of the asthmatic rats decreased significantly（P＜0. 05）. Both the Budesonide group and the combination group of Budesonide，Herba Epimedii and Fructus Ligustri Lucidi could increase the lymphocyte apoptosis of BALF（P＜0. 01）. The lymphocyte apoptosis of the blood and BALF in the dexamethasone group was significantly increased（P＜0. 05），while reduced in the combination group of dexamethasone，Herba Epimedii and Fructus Ligustri Lucidi（P＜0. 05）. Conclusion：The local administration of glucocorticoid combined with Herba Epimedii and Fructus Ligustri Lucidi could produce a synergistic upregulation effect on lymphocyte apoptosis，while the systemic administration of glucocorticoid combined Herba Epimedii and Fructus Ligustri Lucidi could inhibit the over-expression of lymphocyte apoptosis.

Key Words Asthma；Herba Epimedii／Fructus Ligustri Lucidi；Glucocorticoid；Lymphocyte apoptosis；Rat

支氣管哮喘是由多種細(xì)胞（如嗜酸粒細(xì)胞、肥大細(xì)胞、淋巴細(xì)胞、中性粒細(xì)胞、平滑肌細(xì)胞、氣道上皮細(xì)胞等）和細(xì)胞組分參與的氣道慢性炎性疾病，糖皮質(zhì)激素（Glucocorticoids，GC）以其強(qiáng)大的抗炎作用而被認(rèn)為是目前防治哮喘的首選藥物，但臨床上使用GC也存在著許多問題：如免疫抑制、激素抵抗、激素依賴以及局部和全身性副作用［1-2］。結(jié)合傳統(tǒng)中醫(yī)藥理論用中醫(yī)藥預(yù)防及治療哮喘是我國(guó)的獨(dú)特優(yōu)勢(shì)，尤其是通過(guò)中醫(yī)藥有別于西醫(yī)的對(duì)全身整體的調(diào)節(jié)作用，即神經(jīng)-內(nèi)分泌-免疫功能的調(diào)節(jié)，能夠協(xié)同GC治療哮喘并可有效改善GC治療過(guò)程中所產(chǎn)生的不良反應(yīng)。課題組前期研究發(fā)現(xiàn)［3-4］，大鼠激素全身干預(yù)哮喘模型在地塞米松應(yīng)用的不同階段（激素撤停前、中、后）的同時(shí)，分別合用淫羊藿女貞子，可產(chǎn)生協(xié)同激素抗炎并有效減輕激素的不良反應(yīng)的作用。淋巴細(xì)胞是GC發(fā)揮抗炎作用及導(dǎo)致免疫抑制反應(yīng)的主要效應(yīng)細(xì)胞之一，文獻(xiàn)報(bào)道大劑量GC可通過(guò)糖皮質(zhì)激素受體（Glucocorticoid Receptor，GR）誘導(dǎo)淋巴細(xì)胞的大量凋亡［5］。本研究采用激素全身給藥與局部?jī)煞N給藥模式，觀察藥物對(duì)血與BALF不同水平的淋巴細(xì)胞凋亡的影響，探討中藥淫羊藿女貞子協(xié)同激素治療哮喘及改善激素不良反應(yīng)的可能作用機(jī)制。

1　材料與方法

1. 1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 健康SPF級(jí)SD大鼠，體重（120± 10）g，雄性，提供公司：北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物合格證號(hào)：SCXK（京）2012-0001。

1. 2 實(shí)驗(yàn)儀器 霧化箱（自制，材料：有機(jī)玻璃，規(guī)格：40 cm×30 cm×20 cm），402A超聲霧化器（江蘇魚躍醫(yī)療設(shè)備有限公司），流式細(xì)胞儀FACS Calibur（美國(guó)BD公司）。

1. 3 試劑與藥品 卵清白蛋白（OVA，美國(guó)Sigma公司，A5253-250 g）、氫氧化鋁（北京化工廠，批號(hào)：20120028）；淫羊藿水提物（批號(hào)：20130115）、女貞子水提物（批號(hào)：20130104）均由西安康威生物有限公司提供；地塞米松磷酸鈉注射液（5 mg／支，國(guó)藥集團(tuán)容生制藥有限公司，批號(hào)：H41020036）；吸入用布地奈德混懸液（AstraZeneca Pty Ltd，批號(hào)：317311）；大鼠外周血淋巴細(xì)胞分離液（天津市灝洋生物制品科技有限責(zé)任公司，批號(hào)：LTS1083-200）；一步法TUNEL細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒（上海碧云天生物技術(shù)有限公司，批號(hào)：C1088）；Mebstain Apoptosis Tunel Kit（MBL，Code No：8445）。

1. 4 分組 1）激素局部給藥實(shí)驗(yàn)：按照隨機(jī)數(shù)字表法將SD大鼠分為5組，每組7只，即正常對(duì)照1組（N1組）、哮喘模型1組（A1組）、激素干預(yù)1組（GC1組），淫羊藿女貞子1組（YN1組），淫羊藿女貞子合激素干預(yù)1組（YN＋GC1組）。2）激素全身給藥實(shí)驗(yàn)：按照隨機(jī)數(shù)字表法將SD大鼠分為5組，每組6只，即正常對(duì)照2組（N2組）、哮喘模型2組（A2組）、激素干預(yù)2組（GC2組），淫羊藿女貞子2組（YN2組），淫羊藿女貞子合激素干預(yù)2組（YN＋GC2組）。

1. 5 造模及給藥方法 參考文獻(xiàn)方法［6］于實(shí)驗(yàn)1 ～35 d，除正常對(duì)照1、2組外，剩余組動(dòng)物全部造模。1）激素局部給藥實(shí)驗(yàn)：36 d開始給藥共計(jì)4周，各造模組均每周2次給予1%OVA霧化吸入，GC1組、YN＋GC1組霧化吸入0. 01%布地奈德20 min，YN1組、YN＋GC1組灌胃淫羊藿女貞子水提物（4∶3配比，3. 5 g／kg體質(zhì)量）。2）激素全身給藥實(shí)驗(yàn)：22 d開始給藥共計(jì)2周，GC2組及YN＋GC2組腹腔注射地塞米松注射液（0. 5 g／kg體質(zhì)量），YN2組及YN＋GC2組灌胃給予淫羊藿女貞子水提物（4∶3配比，3. 5 g／kg體質(zhì)量）。

1. 6 取材及指標(biāo)檢測(cè) 分別于實(shí)驗(yàn)64 d、36 d后處死動(dòng)物，腹主動(dòng)脈取血抗凝，參考試劑盒說(shuō)明書分離血淋巴細(xì)胞；迅速開胸，取出肺組織連同氣管，結(jié)扎左主支氣管，右肺行支氣管肺泡灌洗術(shù)［7］，收集支氣管肺泡灌洗液（Branchoalveolar Lavage Fluids，BALF）混合均勻，離心，分離BALF中單個(gè)核細(xì)胞。按照試劑盒說(shuō)明書操作，以流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)血淋巴細(xì)胞及BALF中淋巴細(xì)胞凋亡的表達(dá)（TUNEL法）。

1. 7 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 所有統(tǒng)計(jì)均采用SPSS 16. 0 for Windows軟件包完成。數(shù)據(jù)采用（±s）表示，組間比較采用方差齊性檢驗(yàn)以及單因素方差分析，根據(jù)方差齊性檢驗(yàn)結(jié)果選擇LSD（方差齊）或Tamhane's T2（方差不齊），相關(guān)分析采用Pearson相關(guān)法。

2　實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2. 1 激素局部干預(yù)大鼠血及BALF淋巴細(xì)胞凋亡的比較 與正常對(duì)照組相比，哮喘模型組大鼠BALF中淋巴細(xì)胞凋亡顯著降低（P＜0. 05），血淋巴細(xì)胞凋亡水平無(wú)明顯改變；與模型組相比，各給藥組均可上調(diào)BALF細(xì)胞凋亡（P＜0. 01）；與激素組相比，淫羊藿女貞子合用激素組血及BALF中淋巴細(xì)胞凋亡水平均明顯上調(diào)（P＜0. 05或0. 01），提示激素局部給藥的同時(shí)合用淫羊藿女貞子，產(chǎn)生協(xié)同上調(diào)血及BALF淋巴細(xì)胞凋亡的影響作用。見表1。

表1　激素局部干預(yù)大鼠血及BALF淋巴細(xì)胞凋亡的比較（平均熒光強(qiáng)度，±s）

表1　激素局部干預(yù)大鼠血及BALF淋巴細(xì)胞凋亡的比較（平均熒光強(qiáng)度，±s）

注：與N1組比較，*P＜0. 05；與A1組比較，△△P＜0. 01；與GC1組比較，▲P＜0. 05，▲▲P＜0. 01。

組別　　只數(shù)血淋巴細(xì)胞凋亡　BALF 淋巴細(xì)胞凋亡N1組7 208. 57±18. 79　2544. 43±533. 12 A1組　7 244. 71±29. 36　1644. 86±399. 19*GC1組　7 215. 14±47. 19　2742. 57±590. 05△△YN1組　7 271. 14±40. 35▲▲　4252. 86±837. 62△△▲▲YN＋GC1組　7 300. 29±37. 84△△▲▲　3324. 43±919. 36△△▲

2. 2 激素全身干預(yù)大鼠血及BALF中淋巴細(xì)胞凋亡的比較 與正常對(duì)照組相比，哮喘模型組大鼠BALF中淋巴細(xì)胞凋亡顯著降低（P＜0. 05）；與模型組比較，激素干預(yù)組大鼠血及BALF中淋巴細(xì)胞凋亡表達(dá)均顯著上調(diào)（P＜0. 05或0. 01）；與激素組比較，淫羊藿女貞子合激素干預(yù)組血淋巴細(xì)胞凋亡顯著降低（P＜0. 05），并接近正常水平。見表2。

表2　激素全身干預(yù)大鼠血及BALF中淋巴細(xì)胞凋亡的比較（平均熒光強(qiáng)度，±s）

表2　激素全身干預(yù)大鼠血及BALF中淋巴細(xì)胞凋亡的比較（平均熒光強(qiáng)度，±s）

注：與N2組比較，*P＜0. 05；與A2組比較，△P＜0. 05，△△P＜0. 01；與GC2組比較，▲P＜0. 05，▲▲P＜0. 01。

組別　　只數(shù)　血淋巴細(xì)胞凋亡　BALF 6　 991. 00±414. 40　 2951. 17±427. 99 A2組　6　 934. 67±359. 78　 2315. 50±338. 86*GC2組　6　 1441. 00±490. 12△　3569. 67±461. 086*△△YN2組　6　 814. 67±209. 15▲　2374. 00±491. 84▲▲YN＋GC2組　6　 1005. 67±427. 81▲　3158. 17±612. 14淋巴細(xì)胞凋亡N2組△△

2. 3 血與BALF中淋巴細(xì)胞凋亡的相關(guān)分析 激素局部給藥實(shí)驗(yàn)中，血及BALF淋巴細(xì)胞凋亡無(wú)相關(guān)；激素全身給藥實(shí)驗(yàn)中，血及BALF中淋巴細(xì)胞凋亡水平呈顯著正相關(guān)（r＝0. 587，P＜0. 01）。見表3。

表3　血與BALF中淋巴細(xì)胞凋亡的相關(guān)分析（r值，n＝30）

3　討論

哮喘是由多種細(xì)胞特別是肥大細(xì)胞、嗜酸性粒細(xì)胞、中性粒細(xì)胞和T淋巴細(xì)胞等炎性反應(yīng)細(xì)胞參與的慢性氣道炎性反應(yīng)。慢性氣道炎性反應(yīng)、氣道高反應(yīng)性及氣道重塑是該病的三大重要特征［8-9］。其發(fā)病率、致殘率高并呈逐年上升的趨勢(shì)，已成為危害人類健康的全球性公共衛(wèi)生問題［10］。細(xì)胞凋亡失衡與自身免疫性疾病等發(fā)病密切相關(guān)，尤其是在哮喘發(fā)病過(guò)程中，炎性反應(yīng)細(xì)胞的凋亡機(jī)制日益受到重視［11］。在支氣管哮喘慢性炎性反應(yīng)的發(fā)生發(fā)展過(guò)程中，多種的炎性細(xì)胞以及炎性細(xì)胞因子在氣道局部形成復(fù)雜的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，而淋巴細(xì)胞在哮喘炎性反應(yīng)過(guò)程中發(fā)揮著極為重要的免疫調(diào)節(jié)作用，直接影響著氣道炎性反應(yīng)及氣道高反應(yīng)性的發(fā)生［12-15］。

大量研究表明，淋巴細(xì)胞凋亡減少是哮喘發(fā)病發(fā)展過(guò)程中的一個(gè)重要環(huán)節(jié)，是機(jī)體免疫系統(tǒng)紊亂、哮喘發(fā)生和加重的一個(gè)極其重要的原因［16-17］。GC治療哮喘的藥理作用與其促進(jìn)淋巴細(xì)胞凋亡相關(guān)［18-19］，但若過(guò)度促進(jìn)淋巴細(xì)胞凋亡則導(dǎo)致抑制免疫的不良反應(yīng)［20］。本研究結(jié)果表明：與正常對(duì)照組比較，哮喘模型大鼠BALF中淋巴細(xì)胞凋亡顯著降低（P＜0. 05），提示氣道局部的淋巴細(xì)胞凋亡抑制在哮喘氣道炎性反應(yīng)的發(fā)生以及發(fā)展過(guò)程中具有著重要意義。激素全身及局部2種給藥途徑均能顯著上調(diào)BALF中淋巴細(xì)胞凋亡細(xì)胞水平（P＜0. 01），而激素全身用藥同時(shí)上調(diào)血淋巴細(xì)胞凋亡水平（P＜0. 05），這與糖皮質(zhì)激素抑制淋巴細(xì)胞免疫功能的藥理作用一致，說(shuō)明GC能夠促進(jìn)哮喘大鼠氣道局部淋巴細(xì)胞的凋亡，由此減輕哮喘的氣道炎性反應(yīng)的發(fā)生發(fā)展，提示促進(jìn)淋巴細(xì)胞凋亡是GC治療哮喘的一個(gè)重要作用機(jī)制。但全身用藥對(duì)血淋巴細(xì)胞凋亡的過(guò)度促進(jìn)也可能與GC免疫功能抑制的不良反應(yīng)有關(guān)。激素局部用藥的同時(shí)合用平補(bǔ)陰陽(yáng)藥對(duì)中藥淫羊藿女貞子，可上調(diào)血及BALF中淋巴細(xì)胞凋亡水平（P＜0. 05或0. 01），對(duì)淋巴細(xì)胞凋亡產(chǎn)生協(xié)同增效作用；但激素全身用藥的同時(shí)合用中藥淫羊藿女貞子，則顯著抑制血淋巴細(xì)胞凋亡（P＜0. 05），使其接近于正常水平，提示平補(bǔ)陰陽(yáng)藥對(duì)淫羊藿女貞子可能抑制激素全身應(yīng)用后過(guò)度促進(jìn)血淋巴細(xì)胞凋亡的影響，從而減輕激素的不良反應(yīng)。

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（2015 -07 -20收稿 責(zé)任編輯：張文婷）

中圖分類號(hào)：R285. 5

文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A

doi：10. 3969／j. issn. 1673 -7202. 2016. 03. 030

通信作者：劉仁慧（1974. 07—），女，醫(yī)學(xué)博士，副教授，碩士研究生導(dǎo)師，研究方向：中藥及復(fù)方的藥效及作用機(jī)制，E-mail：liurenhui995＠163. com

基金項(xiàng)目：國(guó)家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目（編號(hào)：81373814）；北京市屬高等學(xué)校高層次人才引進(jìn)與培養(yǎng)計(jì)劃項(xiàng)目（編號(hào)：CIT＆TCD201504097）；北京中醫(yī)藥薪火傳承“3＋3”工程二室一站建設(shè)項(xiàng)目（編號(hào)：2012-SZ-C-42）