參元丹對(duì)缺血再灌注心肌細(xì)胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激相關(guān)因子GRP78、CHOP表達(dá)的影響

佟 彤劉紅旭尚菊菊楊志海邢文龍李 享（首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京中醫(yī)醫(yī)院，北京，0000；首都醫(yī)科大學(xué)，北京，00069）

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參元丹對(duì)缺血再灌注心肌細(xì)胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激相關(guān)因子GRP78、CHOP表達(dá)的影響

佟 彤1劉紅旭1尚菊菊1楊志海2邢文龍1李 享1
（1首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京中醫(yī)醫(yī)院，北京，100010；2首都醫(yī)科大學(xué)，北京，100069）

摘要目的：觀察參元丹對(duì)缺血再灌注心肌細(xì)胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激相關(guān)因子Grp78、CHOP表達(dá)的影響。方法：離體培養(yǎng)新出生1 ～3 d大鼠心肌細(xì)胞，并分為正常組、模型組、參元丹組及空白血清組。應(yīng)用三氣培養(yǎng)箱制造缺血（2 h）／再灌注（4 h）模型。采用RT-PCR法測定內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激相關(guān)因子GRP-78、CHOP因子的表達(dá)。結(jié)果：模型組細(xì)胞內(nèi)Grp78、CHOP表達(dá)均明顯上升（P＜0. 01）。與模型組比較10%參元丹組中，Grp78（P＜0. 01）及CHOP（P＜0. 05）均有明顯下降，10%空白血清組Grp78、CHOP較模型組無明顯變化。結(jié)論：參元丹可以通過減輕內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激減少心肌細(xì)胞的凋亡，保護(hù)心肌細(xì)胞。

關(guān)鍵詞參元丹；內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激；缺血再灌注損傷

Effects of Shen Yuan Dan on Grp78 and CHOP Expression in Ischemia-reperfusion Myocardium Cell

Tong Tong1，Liu Hongxu1，Shang Juju1，Yang Zhihai2，Xing Wenlong1，Li Xiang1
（1 Beijing Hospital of Traditional Chinese Medicine affiliated to Capital Medical University，Beijing 100010，China；2 Capital Medical University，Beijing 100069，China）

Abstract Objective：To observe the effect of Shen Yuan Dan（SYD）on Grp78 and CHOP expression in ischemia-reperfusion myocardium cells. Methods：To culture cardiomyocytes from newborn rats，and then divided them into normal group，model group，SYD group and blank serum group. Ischemia（2 h）／reperfusion（4 h）model was established by tri-gas incubator. Realtime polymerase chain reaction（PCR）were used to detect the Grp78 and CHOP gene expression levels. Results：The Grp78，CHOP expression levels in model group were significantly increased（P＜0. 01）. Compared with model group，Grp78 and CHOP were significantly decreased in 10%SYD group（P＜0. 05）. Levels of Grp78 and CHOP has no obvious change between 10% blank serum group and model group. Conclusion：SYD can reduce endoplasmic reticulum stress in myocardial cell apoptosis and protect myocardial cells.

Key Words SYD；Endoplasmic reticulum stress；Ischemia-reperfusion injury

心肌缺血再灌注損傷（Ischemia／Reperfusion Injury）是介入技術(shù)廣泛應(yīng)用以后帶來的新難題，也是目前醫(yī)學(xué)亟待解決的重要問題。有研究顯示，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激（Endoplasmic Reticulum Stress，ERS）是缺血再灌注損傷的原因之一。參元丹（又名參元益氣活血膠囊）是由我科劉紅旭教授研發(fā)，既往研究顯示其可以減輕大鼠心梗面積，抑制缺氧復(fù)氧心肌細(xì)胞自噬，減少氧化應(yīng)激損傷等作用［1-3］。本實(shí)驗(yàn)將通過參元丹含藥血清對(duì)缺血再灌注心肌細(xì)胞進(jìn)行干預(yù)，觀察其對(duì)ERS相關(guān)因子GRP78及CHOP表達(dá)的影響。

1　材料和方法

1. 1 動(dòng)物 Wistar大鼠40只（雄性），新出生1～3 d Wistar大鼠，雌雄不限，體質(zhì)量不限，均購于北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司。

1. 2 藥物 參元丹由北京中醫(yī)醫(yī)院藥劑科提供（批準(zhǔn)文號(hào)：京藥制字Z20053327），按照臨床等效劑量換算，用蒸餾水配置成0. 048 g／mL，灌胃給藥，1 mL／100 g，藥物濃度為0. 48 g／kg。

1. 3 試劑 Ⅱ型膠原酶，Sigma；胰蛋白酶，Ameresco；DMEM／F12混合培養(yǎng)基，Hyclone；胎牛血清（FBS），Gibco（特級(jí)）；PBS平衡鹽溶液，Sigma；5-溴脫氧尿嘧啶（Brd-u），Sigma；Trizol，Sigma；TransStart Top Green qPCR SuperMix、TransScript?One-Step gDNA Removal and cDNA Synthesis SuperMix均來自于北京全式金生物技術(shù)有限公司。

2　方法

2. 1 原代心肌細(xì)胞培養(yǎng) 將出生1～3 d的Wistar大鼠固定于泡沫板上，75%乙醇常規(guī)消毒乳鼠胸腹部皮膚。超凈臺(tái)內(nèi)沿乳鼠第3、4肋間打開胸腔，取出心臟，至于盛有預(yù)冷PBS培養(yǎng)皿中。剪掉大血管等非心肌組織，反復(fù)清洗4次，將心臟在冰上剪成1 mm3大小的組織塊，加入胰酶、膠原酶混合消化液（1∶1），于37℃消化，消化完畢后輕輕吹打組織塊，重復(fù)消化步驟，收集除第1次以外的細(xì)胞懸液至15 mL離心管中，加入等量的含胎牛血清的DMEM／F12培養(yǎng)液終止消化，4℃、800 r／min離心10 min，棄去上清，輕柔吹打成單細(xì)胞懸液。過200目篩網(wǎng)，差速貼壁分離法純化心肌細(xì)胞（90 min）。加入Brd-U抑制成纖維細(xì)胞生長，以5×105密度種12孔板。細(xì)胞于37℃、5%CO2、飽和濕度環(huán)境培養(yǎng)，48 h換液后開始正式實(shí)驗(yàn)。

2. 2 含藥血清的制備 將40只Wistar大鼠隨機(jī)分為含藥血清組和空白血清組，每組20只。含藥血清組給予濃度為0. 48 g／kg參元丹溶液，空白組予等量生理鹽水，連續(xù)給藥5 d，2次／d，末次給藥后1 h對(duì)大鼠進(jìn)行腹腔麻醉，腹主動(dòng)脈取血，靜置2 h后，3 000 r／min離心10 min，無菌條件下分離血清，將2組血清分別合并混勻，56℃，30 min滅活，4 mL分裝，-80℃保存?zhèn)溆谩?/p>

2. 3 細(xì)胞分組 1）正常培養(yǎng)組：心肌細(xì)胞不做任何處理，按正常條件培養(yǎng)。2）模型組：缺氧、缺糖2 h，氧氣飽和的含胎牛血清DMEM／F12培養(yǎng)液再灌注4 h。3）10%空白血清對(duì)照組（10%對(duì)照組）：缺氧、缺糖2 h，10%空白血清再灌注4 h。4）10%參元丹含藥血清后處理組（10%參元丹組）：缺氧、缺糖2 h，10%參元丹含藥血清再灌注4 h。

2. 4 缺血再灌注模型制備 缺氧前將培養(yǎng)液換成無糖Ear1e's液，將心肌細(xì)胞置入含有95%N2和5% CO2混合氣的37℃缺氧箱中，缺氧2 h（缺血模型），之后將培養(yǎng)液換為空氣飽和的含血清DMEM／F12培養(yǎng)液，置于5%CO2培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)4 h，此為復(fù)氧（再灌注）。

2. 5 RT-PCR測定 使用Primer5. 0設(shè)計(jì)目的基因，GRP78引物序列上游為：5'-CTGGACTGAATGTCATGAGG-3'；下游為：5'-TATCCAGGCCATATGCAATAG-3'；預(yù)計(jì)擴(kuò)增片段長度為66bp。CHOP引物序列上游為：5'-TCCCAAAGCCCTCGCTCTCCA-3'；下游為：5'-GCTGCGCAC-TGACCACTCTGTT-3'；預(yù)計(jì)擴(kuò)增片段長度為111bp。GAPDH引物序列上游為：5'-TGCACCACCAACTGCTTAGC-3'，下游為：5'-GGCATGGACTGTGGTCATGAG-3'，預(yù)計(jì)擴(kuò)增片段長度為87bp。PCR反應(yīng)條件：95℃3 min，95℃30 s，60℃30 s，72℃30 s，共40個(gè)循環(huán)。

2. 6 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì) 數(shù)據(jù)采用SPSS 15. 0統(tǒng)計(jì)軟件包進(jìn)行分析。結(jié)果以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，使用student-Newman-KeulsTest法進(jìn)行組間差異性比較。P＜0. 05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3　結(jié)果

3. 1 參元丹對(duì)缺血／再灌注心肌細(xì)胞Grp78 mRNA表達(dá)的影響 經(jīng)過缺氧、缺糖（缺血模型）2 h及復(fù)氧（再灌注）4 h后，模型組心肌細(xì)胞Grp78 mRNA表達(dá)明顯增加，為正常組的169%（P＜0. 01）。10%參元丹組細(xì)胞GRP78 mRNA含量降至正常組的130% （P＜0. 01）。10%空白血清組Grp78表達(dá)為正常組的160%，與模型組無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

圖1　參元丹對(duì)缺血／再灌注心肌細(xì)胞Grp78 mRNA表達(dá)的影響

圖2　參元丹對(duì)缺血／再灌注心肌細(xì)胞CHOP mRNA表達(dá)的影響

3. 2 參元丹對(duì)缺血／再灌注心肌細(xì)胞CHOP mRNA表達(dá)的影響 缺血／再灌注模型組心肌細(xì)胞CHOPmRNA表達(dá)顯著增加，是正常組的212%（P＜0. 01）。10%參元丹組細(xì)胞CHOP mRNA含量為正常組的170%（P＜0. 05）。10%空白血清組CHOP表達(dá)為正常組的186%，與模型組無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

4　討論

內(nèi)質(zhì)網(wǎng)（Endoplasmic Reticulum，ER）存在于除哺乳動(dòng)物成熟的紅細(xì)胞外的各種真核細(xì)胞中，是重要的細(xì)胞器之一，其主要的功能是參與蛋白質(zhì)的折疊、加工、分泌及調(diào)節(jié)Ca2＋儲(chǔ)存、轉(zhuǎn)運(yùn)。在細(xì)胞內(nèi)外部環(huán)境改變下，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)功能紊亂而引起了ERS。ERS激活細(xì)胞內(nèi)三條通路，即未折疊蛋白反應(yīng)（Unfolded Protein Response，UPR）、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)超負(fù)荷反應(yīng)（Endoplasmic Reticulum Overload Response，EOR）和固醇調(diào)節(jié)級(jí)聯(lián)反應(yīng)［4］。

大量的未折疊蛋白及錯(cuò)誤蛋白的蓄積啟動(dòng)了UPR，細(xì)胞內(nèi)葡萄糖調(diào)節(jié)蛋白78（Grp78）為對(duì)蛋白質(zhì)進(jìn)行重新折疊而與跨膜蛋白ATF6、IRE1、PERK解離，導(dǎo)致了ATF6、IRE1和PERK分別激活，通路分別激活了下游的凋亡因子（如bcl-2、caspase-12、CHOP等），導(dǎo)致細(xì)胞凋亡。Grp78表達(dá)上調(diào)是內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激的標(biāo)志之一。EOR是內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激的另一種表現(xiàn)形式，由正確折疊蛋白在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)過度蓄積激活NF-κB而引起。固醇調(diào)節(jié)元件結(jié)合蛋白（SREBP）是肝內(nèi)調(diào)節(jié)固醇代謝的重要蛋白，當(dāng)ERS時(shí)因內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜表面合成膽固醇被消耗可以啟動(dòng)SREBP而調(diào)控脂質(zhì)代謝。實(shí)驗(yàn)表明，心肌細(xì)胞的缺血缺氧條件可引起內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激并最終導(dǎo)致心肌細(xì)胞的凋亡［5］。

參元丹是首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京中醫(yī)醫(yī)院劉紅旭教授研制，由黃芪、黨參、玄參、丹參、地龍、土鱉蟲、水蛭、延胡索等組成。方中重用黃芪為君藥，補(bǔ)氣扶正。黨參性平，味甘補(bǔ)中益氣，與丹參活血祛瘀共為臣藥，《血證論》中云：瘀血在經(jīng)絡(luò)臟腑之間，被氣火煎熬，則為干血，蓋系干血，使氣化隔絕，非尋常行血之品所能治也，故用諸蟲嚙血之物，以消蝕干血，且力求破血而不傷正。故方選地龍、土鱉蟲、水蛭三種蟲類藥物活血逐瘀，且加用玄參育陰軟堅(jiān)，地龍行經(jīng)通絡(luò)，延胡索行氣活血，是佐使之藥。全方扶正益氣與破血逐瘀同用，共奏益氣養(yǎng)陰、破血逐瘀、通絡(luò)止痛之功效。具有很好的臨床療效。在本實(shí)驗(yàn)中，缺血／再灌注模型組細(xì)胞內(nèi)Grp78、CHOP的表達(dá)均明顯上升，提示細(xì)胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激啟動(dòng)，可通過CHOP的過表達(dá)誘發(fā)細(xì)胞凋亡。在10%參元丹組中，Grp78及CHOP的表達(dá)較模型組均有明顯下降，而此現(xiàn)象在10%空白血清組沒有出現(xiàn)，提示了參元丹可以通過減輕內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激減少心肌細(xì)胞的凋亡，保護(hù)心肌細(xì)胞。

參考文獻(xiàn)

［1］尚菊菊，李愛勇，楊洪志，等.參元丹藥理預(yù)適應(yīng)對(duì)大鼠缺血再灌注心肌梗死面積、蛋白激酶C及熱休克蛋白70的影響［J］.中華中醫(yī)藥雜志，2011，26（8）：78-81.

［2］解欣然，張蕾，尚菊菊，等.參元丹含藥血清對(duì)缺氧復(fù)氧心肌細(xì)胞自噬的影響［J］.中華中醫(yī)藥雜志，2012，27（3）：49-52.

［3］劉紅旭，李愛勇，解欣然，等.參元丹后處理對(duì)心肌缺血／再灌注大鼠血清MDA、SOD水平的影響［J］.微循環(huán)學(xué)雜志，2011，23（1）：5，8，11-12，15.

［4］張國中，劉增長.內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激與心肌缺血再灌注損傷［J］.實(shí)用臨床醫(yī)藥雜志，2015，19（7）：178-180.

［5］馬青變，高煒，郭艷紅，等.缺氧復(fù)氧誘導(dǎo)大鼠心肌細(xì)胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激反應(yīng)［J］.北京大學(xué)學(xué)報(bào)：醫(yī)學(xué)版，2005，37（4）：52-54.

（2016 -02 -24收稿 責(zé)任編輯：洪志強(qiáng)）

理論研究

中圖分類號(hào)：R256. 22

文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A

doi：10. 3969／j. issn. 1673 -7202. 2016. 03. 009

通信作者：尚菊菊，主任醫(yī)師，博士，研究方向：中西醫(yī)結(jié)合防治心血管疾病基礎(chǔ)與臨床研究，E-mail：1823042511＠qq. com，郵政編碼：100010，Tel：（010）52176633

作者簡介：佟彤（1986—），女，醫(yī)學(xué)碩士，主治醫(yī)師

基金項(xiàng)目：北京市科學(xué)技術(shù)委員會(huì)十病十藥課題（編號(hào)：Z141100002214010）；北京市教委科技發(fā)展計(jì)劃面上項(xiàng)目（編號(hào)：KM201310025027）；國家自然科學(xué)基金項(xiàng)目（編號(hào)：81273741）；首都中醫(yī)藥研究專項(xiàng)（編號(hào)：13ZY12）