抗阻訓(xùn)練對心梗大鼠心肌Neuregulin-1的表征和心臟結(jié)構(gòu)與功能的影響

蔡夢昕，王慶安，田振軍

抗阻訓(xùn)練對心梗大鼠心肌Neuregulin-1的表征和心臟結(jié)構(gòu)與功能的影響

蔡夢昕，王慶安，田振軍

目的：探討抗阻訓(xùn)練對心梗(Myocardial Infarction,MI)大鼠心肌組織中神經(jīng)調(diào)節(jié)蛋白(Neuregulin-1,NRG1)及其信號通路表達(dá)的影響及其對心臟結(jié)構(gòu)與功能的保護(hù)效應(yīng)。方法：3月齡雄性SD大鼠，體重180～220 g，隨機(jī)分為假手術(shù)組(Sham)、心梗組(MI)和心?？棺栌?xùn)練組(MR)，每組10只。MI和MR組結(jié)扎左冠脈前降支(LAD)，建立MI模型。其中MR組于術(shù)后1周進(jìn)行為期4周的抗阻訓(xùn)練，結(jié)束后測定心功能；采用石蠟切片和HE、Masson染色技術(shù)觀察并計算組織形態(tài)學(xué)變化和膠原容積分?jǐn)?shù)(Collagen volume fraction,CVF)，采用免疫組化、Real Time-qPCR和Western Blotting技術(shù)檢測心肌血管新生、細(xì)胞凋亡等相關(guān)蛋白α-SMA、CD105、BCL-2和Bax以及NRG1及其受體ErbB2/4和下游信號通路蛋白的表達(dá)變化。結(jié)果：抗阻訓(xùn)練有效提升了MI大鼠心功能，改善心肌細(xì)胞病理性肥大；促進(jìn)非梗死區(qū)心肌α-SMA和CD105表達(dá)、顯著升高BCL-2/Bax比值；顯著增加MI大鼠心肌NRG1蛋白的表達(dá)和erbb2 mRNA表達(dá)，升高PI3K-Akt和ERK1/2的磷酸化水平。結(jié)論：本研究發(fā)現(xiàn)，抗阻訓(xùn)練可改善MI心臟的病理性重塑，促進(jìn)非梗死區(qū)血管新生，抑制心肌細(xì)胞凋亡，安全有效的改善MI心臟的功能；抗阻訓(xùn)練可促進(jìn)心肌NRG1及其ErbBs的表達(dá)，其心臟的保護(hù)效應(yīng)與心肌NRG1/ErbBs及PI3K/Akt和ERK1/2信號通路激活有關(guān)。

抗阻訓(xùn)練;心肌梗死;心臟保護(hù);神經(jīng)調(diào)節(jié)蛋白1;心肌修復(fù)

心肌梗死(Myocardial Infarction,MI)后心肌缺血引起梗死區(qū)心肌細(xì)胞壞死、凋亡，心臟發(fā)生替代性纖維化，嚴(yán)重?fù)p害心功能[32]。如何改善心臟的病理性重構(gòu)，抑制心肌細(xì)胞凋亡，促進(jìn)心肌細(xì)胞和血管再生，降低心肌纖維化水平，促進(jìn)其結(jié)構(gòu)與功能有效恢復(fù)，一直是心血管基礎(chǔ)和臨床研究的熱點問題。

近10年的動物和人體臨床研究表明，耐力性鍛煉作為重要的心血管疾病預(yù)防和康復(fù)手段，在預(yù)防MI發(fā)生和后期康復(fù)等方面均發(fā)揮積極作用，可降低細(xì)胞凋亡程度[9]、減輕心肌纖維化[38,39]和促進(jìn)血管再生[25]，有效提升心功能和改善左室重塑現(xiàn)象[11,14,18]。根據(jù)臨床轉(zhuǎn)化醫(yī)學(xué)和MI患者的臨床特點，從改善MI(或心衰)患者生存質(zhì)量與并發(fā)癥分析，抗阻訓(xùn)練可能會更安全有效。針對MI疾病，如何選擇科學(xué)、安全、有效的康復(fù)運動方式，一直備受學(xué)者和臨床專家的高度關(guān)注，尤其是心臟負(fù)荷相對較小的抗阻訓(xùn)練對改善MI心臟結(jié)構(gòu)與功能的影響及其機(jī)制研究，目前文獻(xiàn)報道尚缺。

神經(jīng)調(diào)節(jié)蛋白1(Neuregulin-1,NRG1)在心臟發(fā)育及成體心功能維持中發(fā)揮重要作用[31]。研究發(fā)現(xiàn)，內(nèi)皮細(xì)胞釋放NRG1與心肌細(xì)胞上其受體ErbB4結(jié)合后，可促進(jìn)MI后心臟中單核心肌細(xì)胞增殖，修復(fù)損傷心臟[3]。注射 rhNRG-1可抑制大鼠心肌間質(zhì)纖維化和心肌細(xì)胞凋亡[26]。大量研究表明，NRG1與ErbBs結(jié)合后激活PI3K/Akt和ERK1/2等通路，在心肌細(xì)胞肥大和增殖、心肌血管再生和抑制心肌細(xì)胞凋亡等方面發(fā)揮作用，已成為近年來高度關(guān)注的心臟保護(hù)因子[3,13,17]。但運動與心臟NRG1表征的研究報道十分有限[35]，且尚缺乏針對MI心臟的研究報道。本研究擬探討抗阻訓(xùn)練對MI大鼠NRG1及其信號通路和心臟結(jié)構(gòu)與功能的影響，以期為MI等心臟疾病篩選科學(xué)、安全、有效的康復(fù)運動方式提供實驗依據(jù)，并探討抗阻訓(xùn)練對MI保護(hù)效應(yīng)的生物學(xué)機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 主要儀器和試劑

主要儀器：ALC V8動物呼吸機(jī)、PowerLab/8ST生物信號采集處理系統(tǒng)、LEICA RM2126切片機(jī)、BMⅡ型病理組織包埋機(jī)、生物組織攤烤片機(jī)、尼康熒光顯微鏡、BX51奧林巴斯光學(xué)顯微鏡、Bio Tek epoch超微量微孔板分光光度計、Bio Rad CFX96熒光定量PCR儀、Bio Rad電泳儀和轉(zhuǎn)移槽等。

主要試劑：兔多克隆抗體α-SMA和CD105(美國Abcam公司)，BCL-2、Bax、NRG1、ErbB2和ErbB4(bioworld公司)，PI3K、pPI3K、Akt、pAkt、ERK1/2和pERK1/2(美國CST公司)，nrg1、erbb2和erbb4引物[生工生物工程(上海)股份有限公司]，反轉(zhuǎn)錄試劑盒(美國Thermo Scientific公司)、SYBR Green I熒光染料(GenStar北京康潤公司)。

1.2 動物實驗分組、MI大鼠模型制備和抗阻訓(xùn)練方案制定

動物實驗分組：3月齡雄性Sprague Dawley大鼠(購自西安交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院實驗動物中心，合格號為SCXK2013-003)，適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后，隨機(jī)選取10只為假手術(shù)對照組(Sham)，余下大鼠全部進(jìn)行左冠脈前降支(LAD)結(jié)扎術(shù)，1周后隨機(jī)分為心梗組(MI)和心?？棺栌?xùn)練組(MR)，每組10只。大鼠分籠飼養(yǎng)，每籠5只，自由進(jìn)食、飲水。

MI大鼠模型制備：大鼠稱重后，腹腔麻醉(5%戊巴比妥鈉，30 mg/kg)，采用人工面罩正壓通氣呼吸，心電圖監(jiān)測手術(shù)過程。在大鼠左側(cè)第4肋骨位置開胸剝離心包，暴露心臟，采用3/8U型圓縫合針和5-0絲線在左心耳和肺動脈圓錐交界處下緣2 mm處進(jìn)針，深度為0.3～0.5 mm，結(jié)扎LAD，以左室心肌顏色變淺或變白，心電圖ST段抬高，出現(xiàn)病理性Q波或T波倒置為結(jié)扎成功標(biāo)志，之后逐層縫合肌肉和皮膚。Sham組只進(jìn)針穿線，不結(jié)扎。

抗阻訓(xùn)練方案：根據(jù)文獻(xiàn)資料及前期預(yù)實驗確定抗阻訓(xùn)練方案[22]。訓(xùn)練組大鼠術(shù)后7 d進(jìn)行爬梯抗阻訓(xùn)練。爬梯高1.1 m，間隔2 cm，傾斜角度為80°。第1周為適應(yīng)性訓(xùn)練，以不負(fù)重起始，每天以10%體重的負(fù)荷遞增，終負(fù)荷為體重的75%，5 d/周，共4周。

1.3 血流動力學(xué)指標(biāo)測定和死亡率統(tǒng)計

大鼠訓(xùn)練結(jié)束后次日，腹腔麻醉，采用右頸總動脈逆行插管術(shù)將導(dǎo)管送至左心室，PowerLab/8ST信號采集系統(tǒng)記錄左心室收縮壓(left ventricular systolic pressure,LVSP)、左心室舒張末壓(left ventricular end-diastolic pressure,LVEDP)和左心室壓力變化速度(±dp/dt max)。

1.4 取材、樣品處理和組織學(xué)實驗方法

血流動力學(xué)指標(biāo)測試結(jié)束后，立刻開胸摘取心臟，組織學(xué)實驗的標(biāo)本于10%中性甲醛溶液固定48 h后制片。用于Western Blotting和Real Time-qPCR實驗的標(biāo)本入液氮24 h后，移至-80℃低溫冰存?zhèn)溆谩?/p>

甲醛固定樣本進(jìn)行石蠟包埋，連續(xù)切片(厚5 μm)。每張HE染色切片選取10個視野，每個視野選擇10個胞核位于中央的心肌細(xì)胞，測量其橫截面積。每張Masson染色切片測量心肌膠原容積分?jǐn)?shù)(Collagen Volume Fraction,CVF)。CVF=膠原面積/心肌組織總面積×100%(不包括血管周圍膠原面積)。

免疫組化實驗嚴(yán)格按照SABC免疫組化染色試劑盒說明書操作步驟進(jìn)行。切片脫蠟至水，PBS清洗，3%H2O2浸泡10 min以消除內(nèi)源性過氧化物酶，微波抗原修復(fù)，山羊血清封閉液37℃孵育30 min，甩去血清，孵育兔抗大鼠多克隆α-SMA(1∶400)和CD105(1∶200)抗體，4℃過夜。次日室溫復(fù)溫30 min，滴加生物素標(biāo)記的山羊抗兔抗體，37℃孵育30 min，滴加SABC復(fù)合物，37℃孵育30 min，DAB顯色，蒸餾水洗滌終止反應(yīng)，常規(guī)脫水、透明，中性樹膠封片。設(shè)置空白對照(PBS取代一抗和二抗)及陰性對照(PBS取代一抗)。

1.5 Real Time-qPCR和Western Blotting實驗方法

Real Time-qPCR實驗方法：常規(guī)Trizol試劑盒提取心肌組織總mRNA。嚴(yán)格按照反轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書操作步驟，獲得cDNA產(chǎn)物，20 μl反應(yīng)體系進(jìn)行實時熒光定量PCR反應(yīng)，內(nèi)部參照為gapdh。引物序列為：nrg1:F 5’-GCTAAGTCCACAACATACCTCAGA-3’，R 5’-AAGGGAG- CCAGAGAAGAAACTC-3’，退火溫度53℃；erbb2:F 5’-TACCGACTGTTGAGGCAGAAC-3’，R 5’-TGAAGGAGAGTTTGAGGAGAT-3’，退火溫度55℃；erbb4:F 5’-CTTGCCATCTCTTCCCTGA A-3’，R 5’-AATCGCCTCTGTGTTCTTTCTC-3’，退火溫度56℃；gapdh:F 5’-CAGTGCCAGCCTC GTCTCAT-3’，R 5’-AGGGGCCATCCACAGTCTTC -3’，退火溫度55℃。

Western Blotting實驗方法：取心肌組織50 mg左右，加入預(yù)冷蛋白抽提試劑，電動勻漿器勻漿，4℃離心12 000 rpm×15 min，取上清。BCA試劑盒進(jìn)行蛋白定量。10%～12% Tris-甘氨酸SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳分離蛋白，300 mA恒流轉(zhuǎn)膜，3% BSA室溫封閉1 h。孵育一抗BCL-2(1∶500)、Bax(1∶500)、NRG1(1∶1 000)、PI3K(1∶1 000)、pPI3K(1∶2 000)、Akt(1∶1 000)、pAkt(1∶1 000)、ERK1/2(1∶2 000)和pERK1/2(1∶2 000)，4℃過夜。次日復(fù)溫30 min，洗一抗，孵育山羊抗兔二抗(1∶10 000)，室溫50 min，洗二抗，ECL發(fā)光，內(nèi)部參照為GAPDH。

1.6 圖像與數(shù)據(jù)處理

2 實驗結(jié)果

2.1 大鼠心功能測試結(jié)果

MI手術(shù)后實驗大鼠共30只，實驗過程中無一例死亡。血流動力學(xué)檢測結(jié)果表明，與Sham組比較，MI組LVEDP顯著升高(P<0.01)，LVSP和±dp/dtmax顯著降低(P<0.01)；與MI組比較，抗阻訓(xùn)練有效降低了LVEDP水平(P<0.05)，顯著提高了LVSP和±dp/dtmax水平(P<0.05,P<0.01，圖1)。提示，MI嚴(yán)重?fù)p害了心功能，抗阻訓(xùn)練可顯著改善心功能。

圖 1 本研究大鼠心功能變化柱狀圖

2.2 大鼠心肌的組織學(xué)觀察與測試結(jié)果

HE染色結(jié)果顯示，Sham組大鼠心肌細(xì)胞排列緊密，結(jié)構(gòu)清楚，細(xì)胞核染色清晰，呈藍(lán)色，胞漿呈紅色，區(qū)分明顯；MI組大鼠梗死區(qū)心肌細(xì)胞大量壞死，心肌纖維排列紊亂，出現(xiàn)斷裂、溶解等現(xiàn)象，部分胞漿嗜伊紅性增強(qiáng)，梗死區(qū)的存活細(xì)胞、邊緣細(xì)胞及梗死遠(yuǎn)端細(xì)胞均出現(xiàn)肥大現(xiàn)象(P<0.01)；MR組大鼠梗死區(qū)心肌細(xì)胞仍存在肥大現(xiàn)象，梗死邊緣區(qū)細(xì)胞代償性肥大現(xiàn)象有所改善(P<0.01)，非梗死區(qū)心肌細(xì)胞有肥大趨勢，但無顯著性差異(圖2)。

Masson染色結(jié)果顯示，膠原纖維呈藍(lán)色，心肌細(xì)胞呈紅色，細(xì)胞核呈藍(lán)紫色。Sham組心肌組織膠原纖維染色清晰，區(qū)分明顯，細(xì)胞排列整齊，膠原纖維分布正常；MI組可見典型的替代性纖維化，膠原纖維過度增生，并向梗死邊緣區(qū)和非梗死區(qū)延伸；MR組仍存在膠原纖維過度增生情況，CVF值有所下降，但無顯著性差異，梗死區(qū)出現(xiàn)程度不同的存活心肌細(xì)胞島和幼稚的心肌細(xì)胞(圖3)。

圖 2 本研究大鼠心肌細(xì)胞橫截面積比較切片圖

圖 3 本研究大鼠心臟Masson染色結(jié)果切片圖

2.3 大鼠心肌α-SMA和CD105表達(dá)結(jié)果

平滑肌肌動蛋白α-SMA在血管平滑肌中表達(dá)。CD105作為內(nèi)皮細(xì)胞增殖的標(biāo)記物，可反映血管增生情況。免疫組化結(jié)果顯示，MI后梗死區(qū)α-SMA和CD105表達(dá)顯著增加(P<0.01)。與MI組比較，MR組大鼠梗死區(qū)α-SMA表達(dá)減少(P<0.01)，梗死邊緣區(qū)α-SMA和CD105表達(dá)增加(P<0.05)，非梗死區(qū)α-SMA表達(dá)增加(P<0.05)。提示，MI后梗死區(qū)發(fā)生代償性血管新生，抗阻訓(xùn)練可改善MI區(qū)代償現(xiàn)象，并促進(jìn)梗死邊緣和非梗死區(qū)的血管新生(圖4)。

圖 4 本研究大鼠心臟梗死區(qū)和梗死遠(yuǎn)端α-SMA和CD105表達(dá)情況

2.4 大鼠心肌BCL-2/Bax蛋白表達(dá)結(jié)果

BCL-2可通過拮抗促凋亡基因Bax抑制細(xì)胞凋亡現(xiàn)象，Bcl-2/Bax的比值可反映細(xì)胞凋亡抑制作用的強(qiáng)弱。Western Blotting結(jié)果顯示，Sham、MI和MR組大鼠心肌組織中BCL-2表達(dá)無顯著性差異，而MI組心肌Bax蛋白表達(dá)顯著升高，抗阻訓(xùn)練干預(yù)后其表達(dá)下降。BCL-2/Bax比值在MI后顯著降低(P<0.01)，而抗阻訓(xùn)練后表達(dá)顯著升高(P<0.05)。提示，MI后心肌細(xì)胞發(fā)生顯著凋亡，抗阻訓(xùn)練可有效抑制其凋亡水平(圖5)。

圖 5 本研究大鼠心肌Bcl-2和Bax蛋白表達(dá)變化

2.5 抗阻訓(xùn)練對心肌NRG1及其受體和PI3K/Akt和ERK1/2信號通路的影響

RT-qPCR結(jié)果顯示，MI后心肌中nrg1 mRNA表達(dá)升高(P<0.05)，erbb2和erbb4 mRNA表達(dá)有升高趨勢，但無顯著差異。與MI組比較，MR組心肌中erbb2 mRNA表達(dá)升高(P<0.05)，erbb4 mRNA表達(dá)有升高趨勢。Western Blotting結(jié)果顯示，與Sham組比較，MI組NRG1有所升高，但無顯著差異，抗阻訓(xùn)練顯著促進(jìn)了心肌組織中NRG1的表達(dá)(P<0.01)。與MI組比較，MR組心肌中pPI3K/PI3K、pAkt/Akt和pERK/ERK比值升高(P<0.05，P<0.01)。提示，抗阻訓(xùn)練可激活PI3K/Akt和ERK1/2通路(圖6、圖7、圖8)。

圖 6 本研究大鼠心肌NRG1蛋白表達(dá)變化

圖 7 本研究大鼠心肌中nrg1及其受體erbb2和erbb4 mRNA表達(dá)變化柱狀圖

圖 8 本研究大鼠心肌組織PI3K/Akt和ERK1/2及其磷酸化蛋白表達(dá)結(jié)果

3 分析與討論

3.1 抗阻訓(xùn)練可安全有效的改善MI大鼠心功能

運動康復(fù)可有效提升MI患者心功能已得到證實，但針對MI后運動形式、強(qiáng)度及開始時間的選擇，仍缺乏足夠系統(tǒng)的探討。傳統(tǒng)的心臟康復(fù)計劃主要是在MI臨床的后期以有氧訓(xùn)練為主，適宜的耐力運動可有效逆轉(zhuǎn)MI后心臟的病理性重塑，提高心功能[8]。MI發(fā)病早期，合理的康復(fù)訓(xùn)練有利于緩解心功能的進(jìn)行性衰退和纖維化程度。然而，根據(jù)臨床轉(zhuǎn)化醫(yī)學(xué)和MI患者的臨床特點與并發(fā)癥，有氧運動對心臟負(fù)荷較大，絕大多數(shù)MI患者早期進(jìn)行大強(qiáng)度有氧運動存在風(fēng)險。研究發(fā)現(xiàn)，MI可致心功能降低的同時，伴隨著其它遠(yuǎn)隔器官的結(jié)構(gòu)與功能的降低[16,27,34]。MI后早期進(jìn)行抗阻訓(xùn)練誘發(fā)的心臟并發(fā)癥幾率小于有氧運動，并適合老年人群[5,6,30]。美國心臟學(xué)會提出抗阻訓(xùn)練可作為心血管疾病患者進(jìn)行有氧運動康復(fù)的補(bǔ)充[37]，對改善MI(或心衰)患者的生存質(zhì)量可能會更安全有效，但缺乏有力的實驗支持，且其機(jī)制研究十分有限。研究表明，短期和長期的力量練習(xí)均可增加心系數(shù)。3個月抗阻訓(xùn)練可降低基礎(chǔ)心率，使LVDP和±dp/dtmax值顯著增加[1]。本研究結(jié)果表明，抗阻訓(xùn)練可顯著升高M(jìn)I大鼠的LVSP和±dp/dtmax值，降低LVEDP值，未出現(xiàn)動物死亡現(xiàn)象，表明抗阻訓(xùn)練可安全有效的改善心功能，為MI后的康復(fù)訓(xùn)練方式篩選提供了實驗證據(jù)。

3.2 抗阻訓(xùn)練對MI心臟可產(chǎn)生保護(hù)效應(yīng)

MI后，心肌缺血誘導(dǎo)梗死區(qū)心肌細(xì)胞數(shù)目減少并發(fā)生存活細(xì)胞病理性肥大，血管代償性再生，膠原纖維過度增生并導(dǎo)致心肌替代性纖維化，進(jìn)而導(dǎo)致MI心臟組織重構(gòu)和心功能障礙。降低心肌替代性纖維化和心肌細(xì)胞代償性肥大，抑制心肌細(xì)胞凋亡，促進(jìn)心肌血管再生等心臟保護(hù)效應(yīng)，對于維持MI心臟實質(zhì)與間質(zhì)成分比例，建立側(cè)支循環(huán)并減緩后期病理性重塑意義重大。運動訓(xùn)練可改變心肌組織結(jié)構(gòu)和功能，且與運動方式和強(qiáng)度相關(guān)。目前，運動對MI心臟的保護(hù)效應(yīng)主要集中在有氧耐力訓(xùn)練方式。研究發(fā)現(xiàn)，適宜的有氧訓(xùn)練可誘導(dǎo)非梗死區(qū)心肌血管生成，改善血流狀態(tài)和內(nèi)皮功能[4,7,25,36]，抑制心肌細(xì)胞凋亡[9,20]。抗阻訓(xùn)練可增加左室質(zhì)量，誘導(dǎo)心臟向心性肥大[2]，但對MI心臟是否也產(chǎn)生同樣的保護(hù)效應(yīng)，尚無文獻(xiàn)報道。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，MI大鼠術(shù)后1周進(jìn)行抗阻訓(xùn)練干預(yù)，梗死邊緣區(qū)心肌細(xì)胞肥大顯著降低，非梗死區(qū)肥大程度有所增加，且非梗死區(qū)心肌組織中α-SMA和CD105表達(dá)增多，BCL-2/Bax比值升高，顯著抑制心肌細(xì)胞凋亡。提示，抗阻訓(xùn)練可改善病理性心肌肥大現(xiàn)象，促進(jìn)非梗死區(qū)心肌血管新生，降低細(xì)胞凋亡水平，產(chǎn)生心臟保護(hù)效應(yīng)。

3.3 抗阻訓(xùn)練促進(jìn)心肌NRG1的表達(dá)，并激活PI3K/Akt和ERK1/2信號通路

NRG1是心血管系統(tǒng)中重要的細(xì)胞保護(hù)因子，在心臟發(fā)育、成體心臟功能維持和病理性心臟保護(hù)等方面發(fā)揮重要作用[10,29,31]。成體心臟NRG1主要在內(nèi)皮細(xì)胞中表達(dá)，心肌細(xì)胞膜上有其受體ErbBs的表達(dá)。內(nèi)皮細(xì)胞合成并釋放NRG1，作用于心肌細(xì)胞發(fā)揮旁分泌效應(yīng)[15,24]。心臟NRG-1/ErbBs在心衰早期高表達(dá)，晚期則降低，推測為早期室壁機(jī)械張力刺激心肌微血管內(nèi)皮細(xì)胞的結(jié)果[21]。目前認(rèn)為，NRG1的心臟保護(hù)效應(yīng)主要表現(xiàn)在抑制心肌細(xì)胞凋亡[19]、促進(jìn)血管新生[23,33]、降低心肌纖維化[26]和促進(jìn)心肌再生[3]等方面。NRG1與ErbB4結(jié)合后，與ErbB2形成受體復(fù)合物，主要通過激活PI3K/Akt和ERK1/2以及FAK等信號通路，發(fā)揮心臟保護(hù)效應(yīng)[28]。目前，NRG1已經(jīng)成為心血管疾病的臨床治療靶點之一。Waring等發(fā)現(xiàn)，有氧運動可促進(jìn)正常心肌NRG1顯著高表達(dá)[35]，但尚缺對MI心臟的檢測。本實驗發(fā)現(xiàn)，MI后心肌中nrg1 mRNA表達(dá)顯著升高，但其蛋白表達(dá)變化無顯著差異。分析認(rèn)為，MI后梗死及其邊緣部位缺血缺氧，低氧誘導(dǎo)因子等細(xì)胞因子水平升高，誘導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞增殖標(biāo)記CD105表達(dá)升高，從而上調(diào)內(nèi)皮細(xì)胞中nrg1 mRNA水平。但由于NRG1表達(dá)隨MI后時間變化而不同，且同時具有自分泌和旁分泌作用，其蛋白和基因水平并未出現(xiàn)同步性；抗阻訓(xùn)練促進(jìn)了MI心臟NRG1蛋白及其受體erbb2 mRNA高表達(dá)，升高PI3K、Akt和ERK1/2信號蛋白的磷酸化水平，但nrg1 mRNA表達(dá)沒有顯著提升。提示，抗阻訓(xùn)練可激活NRG1/ErbBs及其下游信號通路，NRG1蛋白來源可能包括心源性NRG1以及外周源性NRG1。表明，抗阻訓(xùn)練發(fā)揮心臟保護(hù)效應(yīng)可能與NRG1/ErbBs信號通路激活有關(guān)。

根據(jù)本研究實驗和文獻(xiàn)結(jié)果推測，抗阻訓(xùn)練發(fā)揮心臟保護(hù)效應(yīng)可包括：1)對心臟產(chǎn)生直接保護(hù)效應(yīng)。MI后心功能的提升由多種因素決定，抗阻訓(xùn)練對心臟和血管產(chǎn)生間接應(yīng)力刺激，直接引起心肌形態(tài)結(jié)構(gòu)改變，促進(jìn)包括NRG1在內(nèi)的多種細(xì)胞因子的表達(dá)，發(fā)揮自分泌或旁分泌作用，保護(hù)存活心肌細(xì)胞，降低心肌纖維化程度和心肌細(xì)胞丟失率，促進(jìn)血管再生，改善氧化應(yīng)激和神經(jīng)內(nèi)分泌調(diào)控等；2)促進(jìn)外周器官的內(nèi)分泌功能，參與心肌保護(hù)；3)提高外周血管內(nèi)皮功能，改善機(jī)體內(nèi)環(huán)境和代謝水平。研究表明，長期抗阻訓(xùn)練可使左心室壁厚度增加，提高外周血管內(nèi)皮功能[12]，減輕個體心血管壓力負(fù)荷，減少氧自由基的產(chǎn)生，降低氧化應(yīng)激損傷[1]。因此認(rèn)為，抗阻訓(xùn)練可改善MI后機(jī)體代謝水平，是心臟康復(fù)運動方案中不可或缺的組成部分?？棺栌?xùn)練可促進(jìn)心源性NRG1以及外周源性NRG1的分泌，激活PI3K/Akt和ERK1/2信號通路，通過改善病理性心肌細(xì)胞肥大，抑制細(xì)胞凋亡和促進(jìn)血管新生等方面發(fā)揮心臟保護(hù)效應(yīng)。

4 結(jié)論

本研究發(fā)現(xiàn)，抗阻訓(xùn)練可改善MI心臟的病理性重塑，促進(jìn)非梗死區(qū)血管新生，抑制心肌細(xì)胞凋亡，安全有效地改善MI心臟的功能；抗阻訓(xùn)練可促進(jìn)心肌NRG1及ErbBs的表達(dá)，其心臟的保護(hù)效應(yīng)與心肌NRG1/ErbBs信號及PI3K/Akt和ERK1/2信號通路激活有關(guān)。

[1]AHMADIASL N,NAJAFIPOUR H,SOUFI F G,etal.Effect of short- and long-term strength exercise on cardiac oxidative stress and performance in rat[J].J Phys Biochem,2012,68(1):121-128.

[2]BARAUNA V G,ROSA K T,IRIGOYEN M C,etal.Effects of resistance training on ventricular function and hypertrophy in a rat model[J].Clin Med Res,2007,5(2):114-120.

[3]BERSELL K,ARAB S,HARING B,etal.Neuregulin1/ErbB4 signaling induces cardiomyocyte proliferation and repair of heart injury[J].Cell,2009,138(2):257-270.

[4]BLACK M A,CABLE N T,THIJSSEN D H,etal.Impact of age,sex,and exercise on brachial artery flow-mediated dilatation[J].Am J Phys Heart Circ Phys,2009,297(3):H1109-H1116.

[5]CHALOUPKA V,ELBL L,NEHYBA S.Strength training in patients after myocardial infarct[J].Vnitr Lek,2000,46(12):829-834.

[6]DAUB W D,KNAPIK G P,BLACK W R.Strength training early after myocardial infarction[J].J Cardiopulm Rehabil,1996,16(2):100-108.

[7]DUNCKER D J,BACHE R J.Regulation of coronary blood flow during exercise[J].Phys Rev,2008,88(3):1009-1086.

[8]DUNCKER D J,VAN DEEL ED,DE WAARD M C,etal.Exercise training in adverse cardiac remodeling[J].Pflugers Arch,2014.[ DOI 10.1007/s00424-014-1464-8]

[9]FRENCH J P,HAMILTON K L,QUINDRY J C,etal.Exercise-induced protection against myocardial apoptosis and necrosis:MnSOD,calcium-handling proteins,and calpain[J].Faseb J,2008,22(8):2862-2871.

[10]GARRATT AN."To erb-B or not to erb-B..." Neuregulin-1/ErbB signaling in heart development and function[J].J Mol Cell Cardiol,2006,41(2):215-218.

[11]GIALLAURIA F,GALIZIA G,LUCCI R,etal.Favourable effects of exercise-based cardiac rehabilitation after acute myocardial infarction on left atrial remodeling[J].Int J Cardiol,2009,136(3):300-306.

[12]GORDON B A,BENSON A C,BIRD S R,etal.Resistance training improves metabolic health in type 2 diabetes:a systematic review[J].Diabetes Res Clin Pract,2009,83(2):157-175.

[13]GU X,LIU X,XU D,etal.Cardiac functional improvement in rats with myocardial infarction by up-regulating cardiac myosin light chain kinase with neuregulin[J].Cardiovasc Res,2010,88(2):334-343.

[14]HAYKOWSKY M,SCOTT J,ESCH B,etal.A meta-analysis of the effects of exercise training on left ventricular remodeling following myocardial infarction:start early and go longer for greatest exercise benefits on remodeling[J].Trials,2011,12:92.

[15]HEDHLI N,HUANG Q,KALINOWSKI A,etal.Endothelium-derived neuregulin protects the heart against ischemic injury[J].Circulation,2011,123(20):2254-2262.

[16]JANNIG P R,MOREIRA J B,BECHARA L R,etal.Autophagy signaling in skeletal muscle of infarcted rats[J].PLoS One,2014,9(1):e85820.

[17]JIE B,ZHANG X,WU X,etal.Neuregulin-1 suppresses cardiomyocyte apoptosis by activating PI3K/Akt and inhibiting mitochondrial permeability transition pore[J].Mol Cell Biochem,2012,370(1-2):35-43.

[18]KORZENIOWSKA-KUBACKA I,BILINSKA M,MICHALAK E,etal.Influence of exercise training on left ventricular diastolic function and its relationship to exercise capacity in patients after myocardial infarction[J].Cardiol J,2010,17(2):136-142.

[19]KURAMOCHI Y,COTE GM,GUO X,etal.Cardiac endothelial cells regulate reactive oxygen species-induced cardiomyocyte apoptosis through neuregulin-1beta/erbB4 signaling[J].J Biol Chem,2004,279(49):51141-51147.

[20]KWAK H B,SONG W,LAWLER J M.Exercise training attenuates age-induced elevation in Bax/Bcl-2 ratio,apoptosis,and remodeling in the rat heart[J].Faseb J,2006,20(6):791-793.

[21]KY B,KIMMEL S E,SAFA R N,etal.Neuregulin-1 beta is associated with disease severity and adverse outcomes in chronic heart failure[J].Circulation,2009,120(4):310-317.

[22]LEITE R D,DURIGAN R C,DE SOUZA L A,etal.Resistance training may concomitantly benefit body composition,blood pressure and muscle MMP-2 activity on the left ventricle of high-fat fed diet rats[J].Metabolism,2013,62(10):1477-1484.

[23]LEMMENS K,DOGGEN K,DE KEULENAER GW.Role of neuregulin-1/ErbB signaling in cardiovascular physiology and disease:implications for therapy of heart failure[J].Circulation,2007,116(8):954-960.

[24]LEMMENS K,SEGERS V F,DEMOLDER M,etal.Role of neuregulin-1/ErbB2 signaling in endothelium- cardiomyocyte cross-talk[J].J Biol Chem,2006,281(28):19469-19477.

[25]LEOSCO D,RENGO G,IACCARINO G,etal.Exercise promotes angiogenesis and improves beta-adrenergic receptor signalling in the post-ischaemic failing rat heart[J].Cardiovasc Res,2008,78(2):385-394.

[26]LI B,ZHENG Z,WEI Y,etal.Therapeutic effects of neuregulin-1 in diabetic cardiomyopathy rats[J].Card Diabetol,2011,10:69.

[27]MARTINEZ P F,OKOSHI K,ZORNOFF L A,etal.Chronic heart failure-induced skeletal muscle atrophy,necrosis,and changes in myogenic regulatory factors[J].Med Sci Monit,2010,16(12):R374-R383.

[28]MENDES-FERREIRA P,DE KEULENAER G W,LEITE-MOREIRA A F,etal.Therapeutic potential of neuregulin-1 in cardiovascular disease[J].Drug Discov Today,2013,18(17-18):836-842.

[29]MEYER D,BIRCHMEIER C.Multiple essential functions of neuregulin in development[J].Nature,1995,378(6555):386-390.

[30]OLIVEIRA J L,GALVAO C M,ROCHA S M.Resistance exercises for health promotion in coronary patients:evidence of benefits and risks[J].Int J Evid Based Health,2008,6(4):431-439.

[31]PENTASSUGLIA L,SAWYER D B.The role of neuregulin-1beta/ErbB signaling in the heart[J].Exp Cell Res,2009,315(4):627-637.

[32]PFEFFER M A,BRAUNWALD E.Ventricular remodeling after myocardial infarction.Experimental observations and clinical implications[J].Circulation,1990,81(4):1161-1172.

[33]RUSSELL K S,STERN D F,POLVERINI P J,etal.Neuregulin activation of ErbB receptors in vascular endothelium leads to angiogenesis[J].Am J Physiol,1999,277(6 Pt 2):H2205-H2211.

[34]THOMAS D P,HUDLICKA O,BROWN M D,etal.Alterations in small arterioles precede changes in limb skeletal muscle after myocardial infarction[J].Am J Phys,1998,275(3 Pt 2):H1032-H1039.

[35]WARING C D,VICINANZA C,PAPALAMPROU A,etal.The adult heart responds to increased workload with physiologic hypertrophy,cardiac stem cell activation,and new myocyte formation[J].Eur Heart J,2012.[DOI:10.1093/eurheartj/ehs338]

[36]WHITE F C,BLOOR C M,MCKIRNAN M D,etal.Exercise training in swine promotes growth of arteriolar bed and capillary angiogenesis in heart[J].J Appl Phys(1985),1998,85(3):1160-1168.

[37]WILLIAMS M A,HASKELL W L,ADES P A,etal.Resistance exercise in individuals with and without cardiovascular disease:2007 update:a scientific statement from the American Heart Association Council on Clinical Cardiology and Council on Nutrition,Physical Activity,and Metabolism[J].Circulation,2007,116(5):572- 584.

[38]XU X,WAN W,POWERS A S,etal.Effects of exercise training on cardiac function and myocardial remodeling in post myocardial infarction rats[J].J Mol Cell Cardiol,2008,44(1):114-122.

[39]XU X,ZHAO W,WAN W,etal.Exercise training combined with angiotensin II receptor blockade reduces oxidative stress after myocardial infarction in rats[J].Exp Phys,2010,95(10):1008-1015.

InfluenceofResistanceTrainingonMyocardialNeuregulin-1ExpressionandCardiacStructureandFunctioninRatswithMyocardialInfarction

CAI Meng-xin,WANG Qing-an,TIAN Zhen-jun

Objectives:To discuss the influence of resistance training on cardiac structure and function,expression of Neuregulin-1(NRG1) and its signaling pathway in rats with myocardial infarction (MI).Methods:Adult male sprague-dawley rats,3-mouth old,weight about 180-220g were randomly divided into three groups:Sham-operated group (Sham),sedentary MI group (MI) and MI with resistance training group (MR).The MI model in rat was established by ligation of the left anterior descending (LAD) coronary artery,and rats in MR were subjected to 4-week resistance training.At the end of the 4-week training,hemodynamic measurement was preformed to evaluate cardiac function;after that the heart was picked for histological section.The expression levels of α-SMA,CD105,BCL-2,Bax,NRG1,ErbB2,ErbB4,PI3K,Akt and ERK1/2 were detected by Immunohistochemical measurement,Western Blotting or RT-qPCR.Results:Compared with MI group,resistance training has effectively promoted cardiac function and the pathological myocardial hypertrophy,increased BCL-2/Bax ratio and the expression of α-SMA,CD105,NRG1 protein and erbb2,erbb4 mRNA in myocardial tissue,upregulated the phosphorylation levels of PI3K-Akt and ERK1/2 signal.Conclusion:Resistance training could improve the cardiac function by ameliorating cardiomyocyte pathologic hypertrophy,inhibiting apoptosis and promoting angiogenesis after MI,its mechanism may be associated with NRG1 and the activation of its downstream signaling pathways.

resistancetraining;myocardialinfarction;cardioprotection;Neuregulin-1;cardiacrepair

1000-677X(2014)09-0024-08

2014-03-21；

：2014-08-14

國家自然科學(xué)基金項目(31040045,31171141, 31371199)；陜西師范大學(xué)“211工程”—運動生物學(xué)重點建設(shè)學(xué)科項目(2014-02)。

蔡夢昕(1987-)，女，河南商丘人，在讀博士研究生，主要研究方向為運動心臟生物學(xué)，E-mail：tianzj2011@126.com；王慶安(1990-)，男，山東泰安人，碩士研究生，主要研究方向為運動心臟生物學(xué)；田振軍(1965-)，男，陜西綏德人，教授，博士研究生導(dǎo)師，主要研究方向為運動心血管生物學(xué)，Tel：(029)85308092，E-mail：tianzj611@hotmail.com。

陜西師范大學(xué) 體育學(xué)院暨運動生物學(xué)研究所，運動與心血管研究室，陜西 西安710062. Shaanxi Normal University,Xi’an 710062,China.

G804.5

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