黃芩素對人牙周膜細胞骨向分化能力的影響

陳利嬌，喻文彬，任曼曼，岑勝丹，鄧輝，胡榮黨

（溫州醫(yī)科大學附屬口腔醫(yī)院，浙江 溫州 325027，1.正畸科；2.牙周科）

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黃芩素對人牙周膜細胞骨向分化能力的影響

陳利嬌1，喻文彬1，任曼曼2，岑勝丹2，鄧輝2，胡榮黨1

（溫州醫(yī)科大學附屬口腔醫(yī)院，浙江 溫州 325027，1.正畸科；2.牙周科）

[摘 要]目的：探討中藥黃芩提取物黃芩素對人牙周膜細胞（hPDLCs）增殖和成骨分化功能的影響。方法：原代培養(yǎng)hPDLCs，向hPDLCs中分別加入濃度為0.3125、0.625、1.25 μmol/L的黃芩素作為實驗組，對照組不加黃芩素。MTT法檢測黃芩素對hPDLCs增殖的影響后，分別采用堿性磷酸酶（ALP）活性測定、茜素紅S染色、Real-time PCR和Western Blot法研究黃芩素對hPDLCs ALP活性、礦化結節(jié)形成、I型膠原（Col-I）mRNA和蛋白表達的影響。結果：與對照組相比，各濃度黃芩素對hPDLCs增殖均無明顯影響；各濃度黃芩素組均表現(xiàn)為ALP活性上升；同時骨向誘導21 d后可見黃芩素組礦化結節(jié)形成增加，定量分析結果顯示1.25 μmol/L黃芩素組形成礦化結節(jié)數(shù)量最多；Real-time PCR和Western Blot結果顯示各濃度黃芩素組Col-I mRNA和蛋白表達均有上升，7 d時隨濃度的增加其表達上升，1.25 μmol/L黃芩素組達到最高水平。結論：黃芩素能促進hPDLCs的骨向分化能力，具有進一步研究其輔助牙周再生治療的價值。

[關鍵詞]牙周炎；黃芩素；人牙周膜細胞；骨向分化

慢性牙周炎是累及牙周支持組織的慢性感染性疾病，可造成牙槽骨吸收、附著喪失和牙周袋形成，最終導致牙齒松動，是成年人牙齒脫落的主要原因之一[1]。目前，牙周炎治療主要包括基礎治療和手術治療，治療的最終目標是控制炎癥，并實現(xiàn)牙周組織特別是牙槽骨的再生和新附著的形成。人牙周膜細胞（human periodontal ligament cells，hPDLCs）作為牙周膜中的主要功能細胞，能向成骨細胞、成牙骨質細胞分化，形成礦化組織，在牙周軟硬組織的修復再生中發(fā)揮著重要作用，如何促進hPDLCs骨向分化是實現(xiàn)牙周炎患者牙周組織再生的關鍵之一[2]。隨著生物制藥技術的發(fā)展和祖國醫(yī)學的推廣，應用中藥來控制牙周炎癥，阻斷牙槽骨吸收和促進牙槽骨再生被認為可能成為牙周治療的輔助手段之一[3]。如有研究表明，中藥骨碎補的提取物能促進小鼠成骨細胞株MC3T3-E1的增殖、分化[4-5]。

黃芩是唇形科植物黃芩的干燥根，是我國著名的傳統(tǒng)中藥，研究表明其具有抗菌、抗炎、抗氧化、抗腫瘤、解熱鎮(zhèn)痛、抗變態(tài)反應、抗糖尿病等廣泛的藥理學活性[6-11]。黃芩素（5，6，7-三羥基黃酮，baicalein）是從黃芩的干燥根中提取的一種黃酮類化合物，是黃芩的主要有效單體之一[12]。有文獻報道黃芩素能促進小鼠MC3T3-E1細胞成骨分化[13]。然而，有關黃芩素能否促進牙槽骨新生，從而在牙周組織再生中發(fā)揮作用，國內外尚未見報道。為此，本研究從細胞和分子水平探討不同濃度、不同時間的黃芩素作用對hPDLCs增殖和成骨分化功能的影響，為今后黃芩素應用于牙周組織再生提供實驗依據。

1　材料和方法

1.1試劑與儀器

1.1.1主要試劑：DMEM培養(yǎng)基、胰酶、膠原酶（Gibco，美國），胎牛血清（fetal calf serum，F(xiàn)BS，Millipore，美國），黃芩素（純度≥98%）、二甲基亞砜（dimethyl sulfoxide，DMSO）、地塞米松、抗壞血酸、β-甘油磷酸、茜素紅S、MTT（Sigma，美國），SYBR Green I染料（Roche，瑞士），堿性磷酸酶（alkaline phosphatase，ALP）活性檢測試劑盒（南京建成），山羊抗人I型膠原（collagenase-I，Col-I）蛋白多抗、β-actin單抗、兔抗山羊二抗（CST，美國），BCA試劑盒（杭州弗德），反轉錄試劑盒（Takara，日本），引物、Trizol試劑（Invitrogen，美國），其余試劑均為國產分析純或進口分裝。

1.1.2主要儀器：超凈臺（蘇州凈化），倒置顯微鏡（Nikon，日本），PCR擴增儀、化學發(fā)光儀、電泳儀、轉膜儀（Bio-Rad，美國），酶標儀（TECAN，瑞士），LightCycle 480熒光定量PCR儀（Roche，瑞士），培養(yǎng)瓶、培養(yǎng)板（Corning，美國）。

1.2實驗方法

1.2.1hPDLCs的培養(yǎng)與鑒定：選取溫州醫(yī)科大學附屬口腔醫(yī)院口腔外科門診拔除的第三磨牙。要求患者年齡為20～30歲，牙體無齲損，牙周組織無炎癥。用無菌PBS液反復沖洗，無菌條件下刮取牙根中1/3的牙周膜組織，剪碎，用0.3% I型膠原酶37 ℃消化30 min，離心（1 500×g）5 min，棄上清，置于T25培養(yǎng)瓶中，加入含有10% FBS、0.1 μg/L青霉素、0.1 μg/L鏈霉素的DMEM培養(yǎng)液1 mL，37 ℃，5% CO2飽和條件下培養(yǎng)12 h后，補加培養(yǎng)液2 mL后繼續(xù)培養(yǎng)。每隔3 d換液，待細胞長滿至80%后，0.25%胰酶消化，傳代。采用抗波形蛋白與抗角蛋白染色鑒定細胞來源，選取3～5代細胞進行后續(xù)試驗。本研究經溫州醫(yī)科大學附屬口腔醫(yī)院醫(yī)學倫理委員會批準，事先告知患者并簽署知情同意書。

1.2.2實驗分組：DMSO溶解黃芩素制成100 mmol/L儲存液備用。以含10% FBS的培養(yǎng)液梯度稀釋成含0.3125、0.625和1.25 μmol/L濃度黃芩素的培養(yǎng)液。選取3～5代的hPDLCs以5×104個/mL密度接種到6孔板中，待細胞融合率達到70%后，吸棄原培養(yǎng)液，加入不同濃度的黃芩素，設0.3125、0.625和1.25 μmol/L組3個實驗組，加入0.1% DMSO作為對照組（下文圖內均標為control），分別培養(yǎng)3、7、11 d后，測定Col-I mRNA和蛋白的表達水平。各組培養(yǎng)7 d后換成骨誘導液（含5 mmol/L β-甘油磷酸鈉、50 μg/mL抗壞血酸、10-5mmol/L地塞米松、10% FBS的DMEM培養(yǎng)液），每隔3 d換液，連續(xù)誘導21 d，行茜素紅S染色。

1.2.3MTT法測定黃芩素對hPDLCs增殖的影響：以5 000個/孔的密度接種hPDLCs于96孔板，每孔加入100 μL的培養(yǎng)液，培養(yǎng)24 h后，吸棄原有培養(yǎng)液，加入不同濃度的黃芩素分別培養(yǎng)1、3、5和7 d后，吸棄培養(yǎng)液，每孔加入MTT（5 mg/mL）20 μL，37 ℃，5% CO2條件下避光孵育4 h，每孔加入DMSO 150 μL，搖床振蕩10 min后，酶標儀測OD490值。含10% FBS的培養(yǎng)液作為空白對照，設4個復孔。

1.2.4ALP活性測定：各組細胞培養(yǎng)3、7和11 d，根據ALP試劑盒說明書操作，酶標儀測定各孔的OD520值，再換算出各組的ALP活性。

1.2.5茜素紅S染色、礦化結節(jié)定量：各組細胞誘導21 d后，棄培養(yǎng)液，PBS漂洗3次，經4%多聚甲醛4 ℃固定30 min，行茜素紅S（1 mg/mL）染色。茜素紅S染色拍照后，每孔加入等量的氯化十六烷基吡啶溶液溶解礦化結節(jié)，酶標儀測OD560值，比較各組形成礦化結節(jié)的數(shù)量。

1.2.6實時熒光定量PCR（Real-time PCR）：采用Trizol試劑提取各組細胞樣本的RNA，通過OD280/OD260比值來測定其純度，比值在1.8～2.0之間為合格。然后根據PrimeScriptTMRT-PCR Kit說明在20 μL反應體系中進行反轉錄反應合成cDNA。反應體系如下：1 μg Total RNA、4 μL 5‘PrimeScript Buffer、1 μL PrimeScriptTMRT Enzyme Mix I、1 μL oligo（dT）primer和1 μL random 6 mers，RNase free dH2O補足20 μL。反應條件為37 ℃ 15 min，85 ℃ 5 s。合成好的cDNA置于-70 ℃保存?zhèn)溆?。引物序列如?所示，設計和合成由Invtrogen公司完成。使用LightCycler 480熒光定量PCR儀進行檢測，擴增反應體系如下：10 μL SYBR Green Premix Ex Taq（2×）、1 μL Forward和Reverse Primer、2 μL cDNA template、6 μL ddH2O。擴增步驟包括預變性：95 ℃ 30 s，1個循環(huán)；擴增：95 ℃ 10 s，60 ℃ 10 s，72 ℃ 10 s，40個循環(huán)；融解：95 ℃5 s，65 ℃ 1 min，1個循環(huán)；冷卻：40 ℃ 30 s，1個循環(huán)。每個cDNA樣本設2個復孔，實時監(jiān)測每個反應的循環(huán)熒光信號，獲得Ct（cycle threshold）值。然后根據目的基因Col-1和管家基因β-actin的Ct值通過相對定量方法2-△△Ct進行統(tǒng)計分析。每個樣本重復測試3次，取平均值。

表1　引物序列

1.2.7Western Blot：采用RIPA全細胞裂解液（含1 mmol/L PMSF蛋白酶抑制劑）置于冰上裂解各組細胞樣本20 min，用刮刀將細胞刮起轉移到EP管中。根據BCA試劑盒使用說明對蛋白進行定量。將煮沸后的蛋白通過8% SDS-PAGE電泳分離后，轉移至PVDF膜上，5%的脫脂牛奶封閉2 h，一抗Col-I （1:1 000）和β-actin（1:1 000）4 ℃孵育過夜，接著采用辣根過氧化物酶（horseradish peroxidase，HRP）標記的兔抗山羊二抗室溫搖床孵育2 h，免疫反應條帶用ECL增強化學發(fā)光顯帶，按照試劑說明書在暗室條件下進行拍照。

1.3統(tǒng)計學處理方法 所有統(tǒng)計分析由SPSS19.0軟件完成。數(shù)據以±s表示，多個樣本均數(shù)的比較采用單因素方差分析和LSD-t檢驗。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2　結果

2.1hPDLCs原代培養(yǎng)及鑒定 倒置顯微鏡下觀察可見原代培養(yǎng)1周后有細胞從組織塊中爬出，2周后細胞密集呈放射狀生長（見圖1A）。傳代1 d后大多數(shù)細胞為長梭形或多角形（見圖1B）。免疫組織化學染色后觀察可見波形蛋白染色呈陽性（見圖1C），角蛋白染色呈陰性（見圖1D），證實培養(yǎng)的細胞來源于中胚層間充質而不是上皮。根據細胞形態(tài)并結合取材部位可以確定是hPDLCs。

A：原代培養(yǎng)2周；B：傳代培養(yǎng)1 d；C：波形蛋白染色陽性；D:角蛋白染色陰性圖1　hPDLCs的培養(yǎng)及鑒定(×100)

2.2黃芩素對hPDLCs增殖的影響 黃芩素刺激1、3、5和7 d后，0.3125 μmol/L組、0.625 μmol/L 組OD值略大于對照組，1.25 μmol/L組略小于對照組，但差異均無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。各濃度黃芩素對hPDLCs的增殖無明顯影響，見圖2。

2.3黃芩素對hPDLCs ALP活性的影響 與對照組相比，1.25 μmol/L黃芩素作用3 d，其ALP活性上升（P＜0.05）；7 d時，各實驗組ALP活性繼續(xù)上升，1.25 μmol/L組最高（P＜0.01）；作用11 d后，各實驗組ALP活性較7 d時有所下降（P＜0.05），但仍較對照組高（P＜0.05），見圖3。

2.4礦化結節(jié)形成及定量分析 各組細胞體外成骨誘導21 d后，鏡下可見細胞呈現(xiàn)復層生長，聚集形成圓形結節(jié)。茜素紅S染色后肉眼可見：隨著黃芩素濃度的增加，染色逐漸加深（見圖4A）；鏡下可見紅色礦化結節(jié)，結節(jié)中心染色深，呈黑紅色，向外周逐漸變淡，其四周呈白色云霧狀（見圖4B）。染色結果顯示，與對照組相比，隨著黃芩素濃度的增加，礦化結節(jié)形成數(shù)量逐漸增多。OD值定量分析結果表明加入黃芩素后，形成礦化結節(jié)數(shù)量增多（P＜0.01），1.25 μmol/L組最多，呈濃度依賴性（見圖4C）。

圖2　黃芩素對hPDLCs增殖的影響

與對照組比：aP＜0.05，bP＜0.01圖3　黃芩素對ALP活性的影響

2.5黃芩素對hPDLCs Col-I mRNA和蛋白表達的影響 Real-time PCR結果發(fā)現(xiàn)，黃芩素作用3 d，0.3125 μmol/L組Col-I的mRNA表達量高于對照組（P＜0.01），0.625 μmol/L組略上升，1.25 μmol/L組則低于對照組（P＜0.05）；7 d后，Col-I mRNA的表達隨著濃度增加而上升，差異具有統(tǒng)計學意義，1.25 μmol/L時最高（P＜0.01）；隨著作用時間延長到11 d，其表達水平較7 d時略下降（見圖5A）。Western Blot結果表明，與對照組相比，Col-I蛋白表達水平在0.3125 μmol/L黃芩素作用3 d時有所上升（P＜0.05）；7 d時隨著黃芩素濃度的增大Col-I蛋白表達量隨之上升（P＜0.05），1.25 μmol/L組表達水平達到最高（P＜0.001）；黃芩素作用11 d后其表達較7 d時有所下降，但0.3125、0.625 μmol/L組仍較對照組高（P＜0.05）（見圖5B、C）。

A：成骨誘導21 d茜素紅S染色后肉眼觀；B：成骨誘導21 d茜素紅S染色后鏡下觀（×100）；C：礦化結節(jié)定量分析（bP＜0.01）圖4　黃芩素對hPDLCs礦化結節(jié)形成的影響

A：hPDLCs 3、7、11 d時Col-I mRNA表達水平；B：hPDLCs 3、7、11 d時Col-I蛋白表達水平；C：蛋白表達的相對定量分析（aP＜0.05，bP＜0.01）圖5　黃芩素對 Col-I mRNA和蛋白表達水平的影響

3　討論

牙周炎最主要的病理改變是牙槽骨吸收。傳統(tǒng)的牙周治療對于控制牙周炎及其進展有很好的效果，但是很難恢復已經破壞的牙周組織尤其是硬組織，其導致的咀嚼功能下降也較難得到徹底改善。近年來牙周組織工程的發(fā)展為實現(xiàn)牙周組織的再生帶來了希望[14]。hPDLCs作為成骨細胞、成牙骨質細胞、成纖維細胞等的前體細胞，如何誘導其分化形成包括牙槽骨在內的牙周組織，已成為牙周組織工程的重要研究方向之一[15]。因此，如何促進hPDLCs骨向分化是牙周再生治療的關鍵之一。近年來的研究主要集中于骨再生相關的細胞因子上。Lee 等[16]研究發(fā)現(xiàn)成纖維細胞生長因子-2（fibroblast growth factor 2，F(xiàn)GF-2）能促進牙周前體細胞的增殖和分化，并形成礦化組織，證實其在牙周硬組織再生中發(fā)揮重要作用。Acil等[17]也發(fā)現(xiàn)骨形態(tài)發(fā)生蛋白-7（bone morphogenetic protein 7，BMP-7）能誘導hPDLCs向成骨細胞、成牙骨質細胞分化。還發(fā)現(xiàn)釉基質蛋白（emdogain，EMD）能促進hPDLCs骨向分化，促進牙周組織再生[18-20]。另有學者研究發(fā)現(xiàn)一氧化氮在血紅素氧合酶的作用下能促進hPDLCs向成骨細胞分化，推測其可能是牙周組織再生中的一個重要的媒介因子[21]。

隨著生物技術的發(fā)展，中藥的有效單體和成份被成功分離和鑒定，中藥治療日益受到關注，其藥性緩和、不良反應較小且價格廉惠、藥源豐富都將成為它的優(yōu)勢所在。黃芩作為唇形科多年生草本植物，是我國著名的傳統(tǒng)中藥材，臨床應用有悠久的歷史，它包含黃芩素、黃芩苷、漢黃芩素和漢黃芩苷等黃酮類有效成分，具有抗菌、抗氧化、抗腫瘤、解熱鎮(zhèn)痛、抗變態(tài)反應、抗糖尿病、降壓、鎮(zhèn)靜等多種作用[7-11，22-23]。研究表明，黃芩苷、黃芩素和漢黃芩素能夠促進牙齦成纖維細胞膠原蛋白和總蛋白的合成，其中以黃芩素和黃芩苷的作用最強[24]。Liu等[25]發(fā)現(xiàn)黃芩素和漢黃芩素能促進hPDLCs的增殖和基質礦化。蔡霞等[26]研究證實黃芩苷能明顯促進hPDLCs增殖及增加細胞總蛋白，并能減少大鼠實驗性牙周炎牙周組織的破壞。黃芩素作為黃芩中提取的一種主要的有效單體，Kim等[13]研究發(fā)現(xiàn)其可促進小鼠MC3T3-E1細胞成骨向分化，加速骨的生成。此后，他們又發(fā)現(xiàn)黃芩素能抑制破骨細胞的分化，促進其凋亡，并通過抑制成熟破骨細胞的骨吸收作用抑制骨吸收[27]。

本實驗通過酶消化結合組織塊法培養(yǎng)出hPDLCs，并通過免疫組織化學染色波形蛋白表達陽性，角蛋白表達陰性，證實其中胚層來源。當加入不同濃度的黃芩素時，MTT結果顯示其對細胞增殖活力無明顯影響，表明本實驗所選3個濃度均未對hPDLCs造成毒性作用，這與以往發(fā)現(xiàn)相同濃度的黃芩素對小鼠MC3T3-E1細胞的活力無影響的結果[13]相一致。但Liu等[25]發(fā)現(xiàn)黃芩素能促進hPDLCs的增殖，這可能是因為其研究中所用黃芩素的濃度較本研究低所致。ALP在骨形成和礦化中發(fā)揮著重要的作用，是反映成骨活性的標志之一，組織中某些具有成骨分化特性的細胞開始分化時，ALP的活性可顯著升高[28]。本研究發(fā)現(xiàn)，hPDLCs在不同濃度的黃芩素作用下，ALP活性均高于對照組，1.25 μmol/L組在作用7 d時上升最明顯，11 d時有所下降，但仍高于對照組。這可能與ALP是骨基質礦化早期的重要酶有關，隨著成骨分化晚期鈣鹽沉積逐漸增多，ALP活性逐漸減弱[28-29]。成骨誘導液中的地塞米松、抗壞血酸等成分可誘導細胞向成骨細胞轉化，在細胞表面沉積鈣鹽，形成鈣結節(jié)，其在茜素紅S染液作用下呈紅色。實驗組在黃芩素作用7 d并成骨誘導3周后，茜素紅S染色可見大量紅色礦化結節(jié)形成，表明細胞外基質礦化，鈣鹽沉積。Col-I是骨組織基質的主要成分，與成骨細胞的分化、骨組織的修復與重建密切相關，可作為檢測成骨分化早中期的標志物[30-31]。本實驗檢測了不同濃度黃芩素在不同作用時間對hPDLCs Col-I mRNA和蛋白表達的影響，證實在7 d時，Col-I的表達隨著黃芩素濃度的增加而逐漸上升，黃芩素的濃度為1.25 μmol/L時，Col-I的表達最高。提示在本研究條件下，1.25 μmol/L黃芩素作用7 d促進hPDLCs成骨分化的效果最佳。本研究結果提示黃芩素有較強的促進hPDLCs骨向分化的作用。

綜上所述，黃芩素對hPDLCs具有一定的成骨促進作用，有望未來用于牙周組織再生治療當中。本研究為進一步探討黃芩素應用于牙周組織的修復再生提供了前期的理論基礎和實驗依據。黃芩素促進成骨的具體機制及其效果還需今后更多的體內外研究來進一步闡明。

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(本文編輯：丁敏嬌)

·論 著·

The effects of baicalein on promoting the osteogenesis of human periodontal ligament cells

CHEN Lijiao1,YU Wenbin1,REN Manman2,CEN Shengdan2,DENG Hui2,HU Rongdang1.1.Department of Orthodontics,Hospital of Stomatology,Wenzhou Medical University,Wenzhou,325027; 2.Department of Periodontics,Hospital of Stomatology,Wenzhou Medical University,Wenzhou,325027

Abstract:Objective:To evaluate the effects of baicalein extracted from Scutellaria baicalensis Georgi on the function of proliferation and osteogenesis of human periodontal ligament cells (hPDLCs).Methods:Baicalein at a concentration of 0.3125,0.625,1.25 μmol/L was added into hPDLCs primary cultured in vitro accordingly as experimental group,the one with no baicalein as blank control group.The effect of proliferation of hPDLCs was assessed through MTT assay.Alkaline phosphatase (ALP) activity assay,Alizarin red S staining,RT-qPCR and Western Blot were used to observe the ALP activity,formation of mineral nodules,mRNA and protein expression of collagenase-Ι (Col-Ι) of hPDLCs,respectively.Results:Compared to the control group,baicalein at different concentrations had no signifi cant infl uence on the proliferation of hPDLCs.Baicalein was shown to enhance the ALP activity of hPDLCs.After 21 days of osteogenic induction,more mineral nodules could be observed compared to the control group,which increased in a dose-dependent manner at the concentration of 0.3125-1.25 μmol/L baicalein according to the results of quantifi cation.The mRNA and protein level of Col-Ι increased by baicalein in different concentration,which reached maximum at 7 days,appearring in a dosedependent manner from 0.3125 to 1.25 μmol/L using Western Blot and Real-time PCR analysis.Conclusion:Baicalein can promote hPDLCs to differentiate into osteoblasts,which is of great value for further study acting as the adjuvant drug for periodontal regenerative therapy.

Key words:periodontitis; baicalein; human periodontal ligament cells; osteogenic differentiation

通信作者：胡榮黨，教授，碩士生導師，Email：hurongdang@ hotmail.com。

作者簡介：陳利嬌（1991-），女，浙江永康人，碩士生。

基金項目：浙江省中醫(yī)藥科技計劃項目（2015ZA122）；浙江省自然科學基金資助項目（LY12H14003）；國家自然科學基金資助項目（81200795）。

收稿日期：2015-08-09

[中圖分類號]R78

[文獻標志碼]A

DOI:10.3969/j.issn.2095-9400.2016.01.002