WNK3激酶高表達(dá)對白介素-1β誘導(dǎo)HEK293細(xì)胞凋亡的保護(hù)作用

王德選，葉曉華，余靈芳，林洪洲，莊捷秋，楊青，鄭雯潔

（溫州醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院育英兒童醫(yī)院 小兒腎內(nèi)科，浙江 溫州 325027）

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WNK3激酶高表達(dá)對白介素-1β誘導(dǎo)HEK293細(xì)胞凋亡的保護(hù)作用

王德選，葉曉華，余靈芳，林洪洲，莊捷秋，楊青，鄭雯潔

（溫州醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院育英兒童醫(yī)院 小兒腎內(nèi)科，浙江 溫州 325027）

[摘 要]目的：觀察WNK3激酶高表達(dá)對白介素-1β（IL-1β）誘導(dǎo)人胚腎細(xì)胞（HEK293細(xì)胞）凋亡的作用。方法：HEK293細(xì)胞分為3組：Vector+NS組、Vector+IL-1β組和WNK3+IL-1β組。Vector+NS組、Vector+IL-1β組轉(zhuǎn)染對照Vector，WNK3+IL-1β組轉(zhuǎn)染W(wǎng)NK3。藥物干預(yù)時，Vector+NS組加入等量0.9%氯化鈉溶液，Vector+IL-1β組、WNK3+IL-1β組加入10 ng/mL IL-1β。分別于培養(yǎng)0、12、24、36和48 h時，采用CCK-8試劑盒檢測細(xì)胞活性。孵育0、18、36 h時應(yīng)用Western blot法檢測Caspase-3、cleaved Caspase-3、Caspase-9、cleaved Caspase-9等凋亡蛋白。在IL-1β干預(yù)0、30、60 min時采用Western blot法檢測JNK通路蛋白。結(jié)果：Vector+IL-1β組在給藥后細(xì)胞活性逐漸下降，在48 h達(dá)到最低值，WNK3+IL-1β組下降幅度較緩和，與同時間點(diǎn)Vector+IL-1β組比較細(xì)胞活性回升，在48 h時差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01）。IL-1β孵育后cleaved Caspase-3和cleaved Caspase-9表達(dá)量增加。與36 h的Vector+IL-1β組比較，WNK3+IL-1β組的cleaved Caspase-3顯著減少，2組的cleaved Caspase-9在18 h及36 h時差異亦存在統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。WNK3轉(zhuǎn)染后p-JNK的表達(dá)水平較未轉(zhuǎn)染W(wǎng)NK3組的上升幅度降低（P＜0.05）。結(jié)論：IL-1β誘導(dǎo)HEK293細(xì)胞活性下降，而轉(zhuǎn)染W(wǎng)NK3質(zhì)?？梢杂行孓D(zhuǎn)部分細(xì)胞活性。WNK3激酶通過減少JNK的磷酸化抑制Caspase途徑的活化，減少細(xì)胞凋亡，起到在不利條件下保護(hù)腎臟細(xì)胞的作用。

[關(guān)鍵詞]WNK3；JNK；白介素-1β；腎臟；凋亡

腎臟是維持水和電解質(zhì)平衡的重要臟器，但也極易受到缺血低氧、藥物等各種因素的影響，進(jìn)而引起腎臟不同細(xì)胞的功能受損，甚至細(xì)胞凋亡或壞死。WNKs激酶[with no lysis（K）kinase]是一種新型絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶家族。研究提示W(wǎng)NKs激酶構(gòu)成了一些新的信號通路，涉及人體各種離子轉(zhuǎn)運(yùn)體和通道的調(diào)節(jié)[1]。WNK3激酶是WNKs 4個家族成員之一，可在細(xì)胞水平上調(diào)節(jié)鈉氯共轉(zhuǎn)運(yùn)子（Na+-Cl--contransporter，NCC）的表達(dá)，而腎臟的NCC主要分布于遠(yuǎn)曲小管，是腎小管重吸收鈉離子的通道蛋白之一[2]。目前國內(nèi)外研究[3-4]多傾向于抑制WNK3激酶，進(jìn)而減少腎臟對鈉離子的吸收，以達(dá)到控制高血壓的目的。但也有研究[5-6]顯示W(wǎng)NK3激酶可能對某些細(xì)胞的凋亡有一定的保護(hù)作用，如子宮頸癌細(xì)胞、神經(jīng)細(xì)胞元細(xì)胞等，因此，過度抑制WNK3激酶表達(dá)可能會帶來一些負(fù)效應(yīng)。WNK3激酶對人腎臟細(xì)胞的凋亡有無保護(hù)作用，目前鮮見相關(guān)報道。本研究主要觀察WNK3對白介素-1β（IL-1β）誘導(dǎo)HEK293細(xì)胞凋亡的影響。

1　材料和方法

1.1材料 HEK293細(xì)胞（人胚腎細(xì)胞）為上海長征醫(yī)院梅長林教授惠贈?？瞻讓φ召|(zhì)粒pCMV-HAVector、重組實驗質(zhì)粒pCMV-HA-WNK3均由美國EMORY大學(xué)腎內(nèi)科蔡暉教授惠贈。IL-1β（recombinant human IL-1beta，200-01B）購自Peprotech。CCK-8分析試劑盒購于日本Dojindo Laboratories。Caspase-9（可同時檢測cleaved Caspase-9）、Caspase-3、cleaved Caspase-3抗體、p-JNK、t-JNK等抗體均為美國Cell Signal Technology產(chǎn)品。羊抗兔和羊抗鼠二抗購自美國Jackson ImmunoResearch。DMEM、OPTI-MEM培養(yǎng)基為美國Gibco公司產(chǎn)品。胎牛血清購自杭州四季青公司。Lipofectamine 2000為Invitrogen公司產(chǎn)品。其余試劑均為市售分析純。

1.2CCK-8法檢測不同干預(yù)條件下HEK293細(xì)胞活性

1.2.1細(xì)胞培養(yǎng)：HEK293細(xì)胞接種于培養(yǎng)皿中，在含10%胎牛血清、100 U/mL青霉素和100 μg/mL鏈霉素的DMEM培養(yǎng)液中傳代培養(yǎng)。細(xì)胞培養(yǎng)箱條件為37 ℃，5% CO2及飽和濕度。每2 d更換培養(yǎng)液。取對數(shù)生長期細(xì)胞用于實驗。

1.2.2細(xì)胞分組及轉(zhuǎn)染：取對數(shù)生長期的HEK293細(xì)胞懸液傳代于φ6 cm培養(yǎng)皿（分為Vector+NS組、Vector+IL-1β組、WNK3+IL-1β組），根據(jù)Lipofectamine 2000試劑盒操作步驟，待細(xì)胞生長密度在40%時按表1劑量進(jìn)行質(zhì)粒DNA轉(zhuǎn)染。轉(zhuǎn)染4 h后換成正常培養(yǎng)液。

表1　細(xì)胞分組及質(zhì)粒DNA轉(zhuǎn)染劑量表

1.2.3CCK-8法測定細(xì)胞活性：細(xì)胞轉(zhuǎn)染4 h后換成正常培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)20 h，細(xì)胞以1×104個細(xì)胞/每孔的密度重新接種于96孔板，參考預(yù)實驗及文獻(xiàn)[7]用藥劑量，加藥組培養(yǎng)液為DMEM+10% FBS+10 ng/mL IL-1β，每孔100 μL；對照組培養(yǎng)液為等量DMEM+10% FBS。于37 ℃孵箱中孵育0、12、24、36 和48 h時，換成10 μL CCK-8+100 μL DMEM正常培養(yǎng)液（每個時間點(diǎn)設(shè)5個復(fù)孔）。以加入等量CCK-8溶液、藥物以及細(xì)胞培養(yǎng)液，但不含細(xì)胞的孔作為空白對照。在37 ℃細(xì)胞培養(yǎng)箱內(nèi)繼續(xù)孵育1.5 h（避光）。使用酶標(biāo)儀測定每孔的吸光度值（OD值），測定波長為450 nm。細(xì)胞活力（%）=[A（加藥）-A（空白）]/[A（0加藥）-A（空白）]×100。A（加藥）：加有CCK8溶液、細(xì)胞和藥物溶液的孔的吸光度。A（空白）：加有CCK8溶液和培養(yǎng)基而沒有細(xì)胞的孔的吸光度。A（0加藥）：沒有藥物溶液，但加有細(xì)胞、CCK-8溶液的孔的吸光度。

1.3WNK3激酶對不同干預(yù)條件下HEK293細(xì)胞形態(tài)學(xué)的影響 取1×104的HEK293細(xì)胞懸濁液傳代于3 盤φ6 cm培養(yǎng)皿，轉(zhuǎn)染方案同1.2.2，轉(zhuǎn)染后20 h再次以1×104懸液分別接種于3盤φ6 cm培養(yǎng)皿，使藥物干預(yù)時3盤細(xì)胞密度相同，加藥方案見表1。0 h 和36 h時在光學(xué)倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)學(xué)變化。

1.4Western blot法測定WNK3激酶過表達(dá)對HEK293細(xì)胞凋亡蛋白及JNK蛋白的影響

1.4.1細(xì)胞干預(yù)及蛋白收集：細(xì)胞分組及轉(zhuǎn)染方案同1.2.2，每組3盤，于孵箱中孵育0、18、36 h時收集細(xì)胞蛋白檢測Caspase系列凋亡蛋白。另重新按上述方案傳代及轉(zhuǎn)染3組細(xì)胞，在IL-1β干預(yù)0、30、60 min時收集細(xì)胞，裂解后檢測JNK蛋白。

1.4.2Western blot法測定：預(yù)冷PBS洗滌細(xì)胞3次，轉(zhuǎn)入EP管，加入RIPA細(xì)胞裂解液。置于冰上裂解30 mim。12 000 r/min低溫離心20 min，吸取上清液至另一離心管。取20 μL用作蛋白定量檢測，其余蛋白作變性處理。方法如下：用80 ℃水浴預(yù)熱1 份6×Loading Buffer后，與5份蛋白樣品充分混勻，將混合物于100 ℃中煮沸5 min，以變性蛋白。每孔40 μg蛋白樣品。10%聚丙烯酰胺凝膠蛋白電泳時，每孔加入40 μg蛋白樣品。濃縮膠電壓設(shè)定為70 mV，分離膠電壓升至120 mV。冰浴下恒流300 mA轉(zhuǎn)膜（PVDF膜）90 min，依次孵育一抗（4 ℃過夜，一抗稀釋濃度均為1:1 000）、二抗（室溫，2 h，稀釋濃度1:12 000），ECL顯色。根據(jù)蛋白不同選擇相應(yīng)的曝光時間，使用凝膠圖像處理系統(tǒng)對目的條帶的分子量和凈光密度值進(jìn)行分析。以上所有實驗重復(fù)3次。

1.5統(tǒng)計學(xué)處理方法 數(shù)據(jù)分析采用統(tǒng)計學(xué)軟件SPSS20.0。所有定量資料以±s表示。定量資料多組間比較采用ONE-WAY ANOVA；多重比較，方差齊性采用LSD檢驗，方差不齊采用Dunnett T3檢驗。兩因素的分析采用析因分析。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2　結(jié)果

2.1CCK-8法檢測WNK3過表達(dá)對IL-1β干預(yù)下HEK293細(xì)胞活性的影響 結(jié)果顯示，Vector+NS組予等量0.9%氯化鈉溶液干預(yù)0～48 h，細(xì)胞活性變化差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。而Vector+IL-1β組在給予10 ng/mL IL-1β后細(xì)胞活性即開始逐漸下降，在24 h時，與同組0 h時比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），在48 h時達(dá)到最低值（P＜0.01）。WNK3+IL-1β組下降幅度較緩和，在36和48 h時與同組0 h時比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義（均P＜0.05），但與同時間點(diǎn)Vector+IL-1β組比較細(xì)胞活性有所回升，在48 h時差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01），見表2。

表2　IL-1β誘導(dǎo)HEK293細(xì)胞不同時間點(diǎn)的活性（n=6，±s，%）

2.2WNK3過表達(dá)對IL-1β干預(yù)下HEK293細(xì)胞形態(tài)的影響 結(jié)果顯示，在0 h相同接種密度前提下，Vector+IL-1β組36 h細(xì)胞密度明顯比Vector+NS組低，其細(xì)胞伸張程度較低，部分細(xì)胞形態(tài)接近圓形，細(xì)胞內(nèi)空泡較多。WNK3+IL-1β組細(xì)胞密度較Vector+IL-1β組增高，細(xì)胞內(nèi)空泡減少，且部分細(xì)胞呈橢圓形或梭性。見圖1。

2.3WNK3過表達(dá)對IL-1β誘導(dǎo)HEK293細(xì)胞凋亡各時間點(diǎn)相關(guān)凋亡蛋白表達(dá)的影響 結(jié)果顯示：Vector+ NS組在等量0.9%氯化鈉溶液干預(yù)過程中Caspase-3變化差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05），未檢測到剪切后的Caspase-3及Caspase-9。而Vector+IL-1β組在給藥后18 h Caspase-9和Caspase-3表達(dá)量開始逐漸下降，干預(yù)開始即檢測到較為顯著的cleaved Caspase-9，18 h到達(dá)高峰，36 h略有下降，同時在36 h時檢測到較為顯著的cleaved Caspase-3。與36 h的Vector+IL-1β組比較，WNK3+IL-1β組的cleaved Caspase-3顯著減少（蛋白條帶灰度量化值815.80±63.44 vs 350.33±51.52，P＜0.01），2組的cleaved Caspase-9在18 h（791.96±92.26 vs 349.88±97.40）及36 h（308.89±45.76 vs 103.98±36.03）時差異有統(tǒng)計學(xué)意義（均P＜0.05）。見圖2。

圖1　WNK3過表達(dá)對IL-1β干預(yù)下HEK293細(xì)胞形態(tài)的影響（×200，箭頭示細(xì)胞內(nèi)空泡）

圖2　IL-1β誘導(dǎo)HEK細(xì)胞凋亡過程中Caspase-3及Caspase-9蛋白變化

2.4WNK3過表達(dá)對HEK293細(xì)胞凋亡中JNK通路的影響 結(jié)果顯示：Vector+NS組在等量0.9%氯化鈉溶液干預(yù)1 h內(nèi)沒有檢測到顯著的磷酸化JNK（p-JNK），IL-1β干預(yù)后，Vector+IL-1β組p-JNK在30 min開始顯著增加。與Vector+IL-1β組比較，WNK3轉(zhuǎn)染后p-JNK的表達(dá)水平在30 min（1 068.67±60.29 vs 603.33±70.94）和60 min（1 183.12±142.91 vs 775.50±107.48）顯著降低（均P＜0.05），見圖3。

圖3　IL-1β誘導(dǎo)HEK細(xì)胞凋亡過程JNK通路蛋白變化

3　討論

IL-1β屬多肽類生長因子，主要由單核細(xì)胞和巨噬細(xì)胞產(chǎn)生，它能直接啟動凋亡的細(xì)胞內(nèi)過程，具有強(qiáng)烈的誘發(fā)細(xì)胞凋亡作用[8]。故本實驗選取IL-1β作為激活MAPKS通路及促進(jìn)細(xì)胞內(nèi)源性凋亡的誘導(dǎo)劑，觀察WNK3對IL-1β誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡有無保護(hù)作用。CCK-8結(jié)果顯示IL-1β能促使HEK293細(xì)胞的活性下降，而轉(zhuǎn)染W(wǎng)NK3可以有效逆轉(zhuǎn)細(xì)胞活性。細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察提示W(wǎng)NK3過表達(dá)有利于細(xì)胞增殖和細(xì)胞形態(tài)的維持。

WNK3在體內(nèi)參與腎臟鈉離子的吸收、細(xì)胞骨架形成、細(xì)胞凋亡及腫瘤細(xì)胞的侵襲轉(zhuǎn)移等[9-10]。既往研究表明轉(zhuǎn)染W(wǎng)T（野生型）-WNK3質(zhì)粒的子宮頸癌細(xì)胞，在actinomycin-D誘導(dǎo)凋亡處理下的存活時間顯著長于沒有轉(zhuǎn)染W(wǎng)T-WNK3質(zhì)粒的子宮頸癌細(xì)胞，表明WNK3可延長細(xì)胞存活時間，延緩細(xì)胞凋亡[5]。除此之外，有學(xué)者報道Lingo-1受體能通過抑制WNK3的活性而促進(jìn)神經(jīng)細(xì)胞的凋亡，推斷WNK3在神經(jīng)細(xì)胞中也具有抗凋亡作用[6]。

細(xì)胞凋亡的外源性途徑的活化是通過特定的死亡配體與細(xì)胞表面的死亡受體相互作用而介導(dǎo)的，可招募胞質(zhì)中的procaspase-8，使其通過自身剪切而活化，激活下游的效應(yīng)Caspase，如：Caspase-3、Caspase-6等，以剪切胞漿和核底物，誘導(dǎo)細(xì)胞發(fā)生凋亡。凋亡的內(nèi)源性途徑主要通過線粒體介導(dǎo)，當(dāng)細(xì)胞受到應(yīng)激刺激時，一些促凋亡蛋白如Bcl-2等從線粒體被釋放入胞漿，與凋亡激活因子Apaf-1結(jié)合，將Caspase-9前體活化，繼而誘導(dǎo)下游Caspase-3 及Caspase-7的活化，引發(fā)凋亡程序[11-12]。因此，Caspase-3是兩條途徑的下游共同關(guān)鍵調(diào)控凋亡蛋白。本研究結(jié)果顯示，在10 ng/mL的IL-1β誘導(dǎo)下，HEK293細(xì)胞中剪切后的Caspase-9和Caspase-3顯著上調(diào)，Caspase-3的剪切體在36 h、Caspase-9剪切體在18 h時表達(dá)增強(qiáng)達(dá)到高峰，而cleaved Caspase-9在IL-1β誘導(dǎo)36 h時表達(dá)反而有一定的降低，這可能是細(xì)胞在凋亡晚期時，Caspase已經(jīng)執(zhí)行完任務(wù)，其生理功能開始降解，細(xì)胞大多進(jìn)入凋亡晚期的情況有關(guān)。這說明IL-1β可以通過內(nèi)源性途徑誘導(dǎo)HEK293細(xì)胞發(fā)生凋亡。WNK3過表達(dá)主要通過凋亡的內(nèi)源性途徑，抑制Caspase-9前體活化，并使下游Caspase-3活化減少，使相關(guān)凋亡蛋白表達(dá)程度下降，起到一定的抗凋亡作用。

JNK信號通路是MAPK中重要的通路之一。JNK通路的激活與多種系統(tǒng)的促凋亡作用有關(guān)。其中一條途徑是通過磷酸化c-Jun和ATF-2激活轉(zhuǎn)錄因子AP-1，引起FasL表達(dá)增強(qiáng)，促進(jìn)細(xì)胞凋亡。另一途徑是通過磷酸化Bcl-2和Bcl-xL，促進(jìn)線粒體釋放細(xì)胞色素C，從而激活Caspase級聯(lián)反應(yīng)，導(dǎo)致細(xì)胞凋亡[13]。本研究中IL-1β激活HEK293細(xì)胞的JNK，引起Caspase級聯(lián)反應(yīng)，最終導(dǎo)致細(xì)胞凋亡。WNK3過表達(dá)主要通過抑制JNK磷酸化，減少Caspase-3、Caspase-9的剪切激活，減輕腎臟細(xì)胞凋亡程度，提升HEK293細(xì)胞在外界不利因素刺激下的存活率。

總之，WNK3激酶可抑制HEK293細(xì)胞的JNK磷酸化，通過Caspase途徑減少腎臟細(xì)胞凋亡。雖然目前國際上主流觀點(diǎn)認(rèn)為WNK3主要負(fù)責(zé)腎臟鈉離子的吸收，與高血壓的發(fā)生發(fā)展有關(guān)，主要關(guān)注如何對其進(jìn)行下調(diào)[14-16]，但本研究也顯示W(wǎng)NK3具有保護(hù)腎臟細(xì)胞在不利條件下的生存能力，故建議在調(diào)控過程中避免對其進(jìn)行過度抑制，以免影響腎臟細(xì)胞生存能力。

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（本文編輯：丁敏嬌）

·論 著·

The protective effect of WNK3kinase on apoptosis in HEK293 cell induced by interleukin-1β

WANG Dex-uan,YE Xiaohua,YU Lingfang,LIN Hongzhou,ZHUANG Jieqiu,YANG Qing,ZHENG Wenjie.Department of Pediatrics,the Second Affi liated & Yuying Children’s Hospital of Wenzhou Medical University,Wenzhou,325027

Abstract:Objective:To observe the effect of high expression of WNK3on apoptosis in HEK293 cells induced by interleukin-1β.Methods:The HEK293 cells were divided into 3 groups (Vector+NS group,Vector+IL-1β group and WNK3+IL-1β group),then tansfection was performed.Liposome 2000 was added to the 1stand 2ndgroup with PCMV-HA-Vector as the blank and negative control respectively; WNK3was added to the 3rdgroup.After treated with 10 ng/mL IL-1β (the 2ndand 3rdgroup) or the same amount of normal saline (the 1stgroup),the CCK8 analysis was performed for the detection of cell activity after incubation for 0 h,12 h,24 h,36 h and 48 h at 37 ℃ respectively.Cell proteins were collected after 0 h,18 h and 36 h incubation respectively for detection of Caspase-3,Cleaved Caspase-3,Caspase-9,Cleaved Caspase-9.In addition,cell protein were collected 0 min,30 min and 60 min after the treatment of IL-1β for JNK detection.Results:No signifi cant difference of cell activity was observed in the Vector+NS group within 48 h.In the Vector+IL-1β group,cell activity began to decline soon after administration.Signifi cant difference could be found after 24 h and the cell activity reached the lowest at 48 h (P＜0.01).Cell activity of WNK3+IL-1β group declined in a moderate manner and the signifi cant difference appeared at 36 h and 48 h when comparing with that at 0 h in the same group (both P＜0.05).However,in comparison with the Vector+IL-1β group at the same time point,cell activity of WNK3+IL-1β group was still a little higher and the signifi cant difference could be observed at 48 h (P＜0.01).The expression of Caspase-9 and Caspase-3 began to decline 18 h after the administration with an increasing peak of cleaved Caspase-9 which decreased slightly at 36 h.An obvious cleaved Caspase-3 could also be observed 36 h after thebook=2,ebook=6administration.In the WNK3+IL-1β group,the decline of Caspase-3 was more moderate when comparing with that in the Vector+IL-1β group.A small quantity of cleaved Caspase-3 could be detected and showed an statistical signifi cance in comparison with that of the same group at 0 h (P＜0.05) with the WNK3; the expression of p-JNK declined but t-JNK did not change.Conclusion:IL-1β may decrease activity of HEK293 cells while transfection of WNK3may partly reverse this affection of IL-1β.The over expression of WNK3may inhibit the activation of JNK pathways induced by IL-1β,decrease the activation of Caspase pathway to reduce apoptosis,and fi nally protect the kidney cells under adverse conditions.

Key words:WNK3; JNK; IL-1β; kidney; apoptosis

通信作者：鄭雯潔，副主任醫(yī)師，Email：wzwjzheng@sina.com。

作者簡介：王德選（1977-），男，浙江蒼南人，主治醫(yī)師，博士。

基金項目：國家自然科學(xué)基金青年基金資助項目（81200513）；錢江人才項目（2011R10049）；溫州市科技局科研基金資助項目（H20110014）。

收稿日期：2015-07-10

[中圖分類號]S941.42

[文獻(xiàn)標(biāo)志碼]A

DOI:10.3969/j.issn.2095-9400.2016.01.001