• <tr id="yyy80"></tr>
  • <sup id="yyy80"></sup>
  • <tfoot id="yyy80"><noscript id="yyy80"></noscript></tfoot>
  • 99热精品在线国产_美女午夜性视频免费_国产精品国产高清国产av_av欧美777_自拍偷自拍亚洲精品老妇_亚洲熟女精品中文字幕_www日本黄色视频网_国产精品野战在线观看 ?

    HPV E6/E7 mRNA和HPV DNA作為宮頸癌篩查分子標(biāo)記物的比較研究

    2016-04-06 07:16:44王娟楊嵐崔彬王麗峰文清華徐蘭蘭吳福清
    海南醫(yī)學(xué) 2016年21期
    關(guān)鍵詞:敏感度特異性宮頸癌

    王娟,楊嵐,崔彬,王麗峰,文清華,徐蘭蘭,吳福清

    (湛江廉江市人民醫(yī)院婦產(chǎn)科1、檢驗(yàn)科2,廣東湛江524400)

    HPV E6/E7 mRNA和HPV DNA作為宮頸癌篩查分子標(biāo)記物的比較研究

    王娟1,楊嵐1,崔彬1,王麗峰1,文清華1,徐蘭蘭1,吳福清2

    (湛江廉江市人民醫(yī)院婦產(chǎn)科1、檢驗(yàn)科2,廣東湛江524400)

    目的探討人乳頭瘤病毒(HPV)DNA和HPV E6/E7 mRNA的兩種檢測標(biāo)記物在宮頸癌篩查中的應(yīng)用價(jià)值。方法選取2014年1月至2016年1月湛江廉江市人民醫(yī)院婦產(chǎn)科收治的406例宮頸癌患者為研究對象,采用超薄液基細(xì)胞學(xué)檢查(TCT)作為金標(biāo)準(zhǔn)。采用PCR法檢測所有患者的HPV DNA和HPV E6/E7 mRNA,并評價(jià)兩種標(biāo)記物對宮頸癌診斷的敏感性和特異性。結(jié)果406例患者中HPV DNA陽性率為47%(191/406),而HPV E6/E7 mRNA檢測陽性率為31.2%(127/406),兩者比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05);兩種檢測標(biāo)記物所得結(jié)果的符合率為85.5%;在CIN1標(biāo)本中,HPV DNA檢測的敏感度和特異度分別為88.6%、75.8%,與HPV E6/E7 mRNA檢測的86.9%、73.4%比較差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05);在CIN2標(biāo)本中,HPV E6/E7 mRNA檢測的特異性為90.5%,高于HPV DNA的79.8%,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),但是敏感性為83.9%,明顯低于HPV DNA的93.7%,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05);在CIN3標(biāo)本中,HPV mRNA檢測的敏感度和特異性分別為98.7%、85.9%,均高于HPV DNA的89.1%、78.8%,差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。結(jié)論檢測HPV mRNA在宮頸癌患者的診斷方面比檢測HPV DNA更具有優(yōu)勢。

    人乳頭瘤病毒;E6/E7 mRNA;宮頸癌;篩查;分子標(biāo)記物

    宮頸癌是婦產(chǎn)科常見的腫瘤疾病之一,隨著對宮頸癌早期篩查的開展,其發(fā)病率和病死率得到明顯的改善[1]。然而,宮頸癌仍然是婦女發(fā)病和死亡的最常見惡性疾病[2]。人乳頭瘤病毒(human papilloma virus,HPV)屬于乳多空病毒科乳頭瘤空泡病毒A屬球形DNA病毒,其與宮頸癌有密切關(guān)聯(lián),必須早期診斷及重視[3]。HPV最常見的基因型為HPV16、18、31、33和45[4]。在宮頸癌檢測中,宮頸涂片的細(xì)胞學(xué)檢測已得到廣泛的應(yīng)用,但是它并不是宮頸癌篩查的理想方法。隨著表觀遺傳學(xué)與精準(zhǔn)醫(yī)學(xué)的發(fā)展,HPV病毒DNA檢測在宮頸癌篩查中已有較大的改善,但其陽性預(yù)測率和特異性仍然偏低。研究表明HPV的感染是瞬時(shí)事件,通常不需要治療就可在6~24個(gè)月后自動清除,因此可能出現(xiàn)假陽性的結(jié)果[5]。而在病毒表達(dá)方面,研究則認(rèn)為長期反復(fù)感染與HPV E6/E7密切相關(guān)[6]。與HPV DNA的檢測不同,對病毒RNA的檢測可以檢測有轉(zhuǎn)錄活性的病毒。因此,作為受感染細(xì)胞中E6/E7癌基因持續(xù)表達(dá)的標(biāo)志,HPV E6/E7 mRNA可能成為有意義的腫瘤標(biāo)志物[7],是目前宮頸癌風(fēng)險(xiǎn)評估的重要參考指標(biāo)之一[8]。本研究通過比較HPV DNA檢測與HPV E6/E7 mRNA檢測在宮頸癌患者中的特異性和敏感性,為宮頸癌的臨床篩查提供更有效的手段。

    1 資料與方法

    1.1 一般資料選取2014年1月至2016年1月湛江市廉江人民醫(yī)院婦產(chǎn)科收治的406例重度宮頸炎患者。納入標(biāo)準(zhǔn):宮頸炎,分級為重度,伴見宮頸糜爛、接觸性出血、宮頸腫物等,尚未經(jīng)系統(tǒng)治療,知情同意取宮頸脫落細(xì)胞及宮頸活檢組織?;颊咂骄挲g(40.1±10.8)歲。按照Bethesda系統(tǒng)分類標(biāo)準(zhǔn),其中正常為未見病變細(xì)胞(NILM,258例),異常為非典型鱗狀細(xì)胞(ASCUS,26例)、低度鱗狀上皮內(nèi)病變(LSIL,81例)、高度鱗狀上皮內(nèi)病變(HSIL,41例)。以病理檢查報(bào)告為金標(biāo)準(zhǔn),組織學(xué)采用Richart標(biāo)準(zhǔn)分級:CIN1 (85例)、CIN2(267例)、CIN3(54例),分別指輕、中、重度宮頸鱗狀上皮非典型增生。按照浸潤情況分類,超過1/2的有283例,小于1/2的有123例。

    1.2 實(shí)驗(yàn)方法

    1.2.1 臨床標(biāo)本收集所有患者行宮頸超薄液基細(xì)胞學(xué)檢查(thin prep liquid-based cytology test,TCT),陰道鏡下活檢組織進(jìn)行病理學(xué)檢查。TCT取材采用活檢刷拭法,在宮頸管內(nèi)和鱗住上皮交界處采集細(xì)胞后刷洗在TCT保存液中。

    1.2.2 RNA提取采用TRI裂解液(購自Sigma公司)進(jìn)行常規(guī)裂解。使用微量移液器吹打使之裂解充分并混勻。加入氯仿200 μL,水平振蕩器勻速振蕩15 s。預(yù)冷離心機(jī)至4°C,待室溫平衡3 min后置于低溫高速離心機(jī)離心(Thermo公司),條件為12 000 r/min,離心15 min。取400 μL水相并加入異丙醇500 μL,充分混勻;低溫高速離心機(jī)離心15 min,條件為12 000 r/min,棄上清;加入70%乙醇溶液1 000 μL洗滌;4°C,7 500 r/min,低溫高速離心機(jī)離心5 min,棄上清。沉淀風(fēng)干3~5 min后加入焦碳酸二乙酯處理水40 μL溶解RNA沉淀,測定RNA濃度和完整性,-70°C保存。

    1.2.3 HPV E6/E7 mRNA檢測按照說明書進(jìn)行常規(guī)預(yù)處理,利用宮頸穩(wěn)態(tài)檢測試劑盒進(jìn)行測試,通過配套計(jì)算軟件自動讀取HPV E6/E7 mRNA拷貝數(shù)值。HPV RNA陽性判斷標(biāo)準(zhǔn)為檢測樣本的平均拷貝數(shù)值>1.0。

    1.2.4 HPV DNA檢測采用PCR反向點(diǎn)雜交法對人乳頭瘤病毒HPV基因分型進(jìn)行檢測(試劑盒購自杭州美聯(lián)生物科技有限公司)。按照試劑盒說明書對上述標(biāo)本進(jìn)行HPV檢測及基因分型。

    1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法應(yīng)用SPSS19.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析,計(jì)量數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(±s)表示,組間比較采用獨(dú)立兩樣本t檢驗(yàn)(方差不齊采用校正t檢驗(yàn)),計(jì)數(shù)資料采用Pearsonχ2檢驗(yàn),以P<0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

    2 結(jié)果

    2.1 兩種檢測標(biāo)記物陽性率比較406例宮頸癌患者中191例HPV DNA檢測陽性,占47.0%,127例HPV E6/E7 mRNA檢測陽性,占31.2%,兩組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。兩種標(biāo)記物檢測的總體符合率為85.5%,其中兩種標(biāo)記物檢測均呈陽性者204例,均為陰性144例。有59例檢測結(jié)果不一致(14.5%),見表1。在HPV DNA陽性患者中,HPV mRNA陽性的病理分型分布為NILM占19.6%,ASCUS占41.2%,LSIL占45.9%,HSIL占83.7%,結(jié)果見圖1。病理分級分布為CIN1占63.6%,CIN2占85.7%,CIN3占100%,見圖2。

    表1 兩種檢測標(biāo)記物陽性率較比(n=406)

    2.2 兩種檢測標(biāo)記物的診斷符合率比較在CIN1標(biāo)本中,HPV DNA檢測的敏感度為88.6%,特異度75.8%,而HPV mRNA檢測的敏感度為86.9%,特異度為73.4%。在CIN2的標(biāo)本中HPV DNA檢測的敏感度為93.7%,特異度為79.8%,而HPV mRNA檢測的敏感度為83.9%,特異度為90.5%。在CIN3標(biāo)本中,HPV DNA檢測的敏感度為85.9%,特異度為78.8%,而HPV mRNA檢測的敏感度為98.7%,特異度為89.4%。兩種檢測標(biāo)記物對CIN1標(biāo)本檢測的敏感度與特異度比較差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=0.05,敏感度= 0.83;χ2=0.10,特異度=0.75)。在對CIN2標(biāo)本的檢測中,HPV mRNA檢測的特異度高于HPV DNA(χ2=4.89,P= 0.03),而敏感度比HPV DNA稍差(χ2=4.74,P=0.03)。在對CIN3標(biāo)本的檢測中,HPV mRNA檢測的敏感度和特異性均高于對HPV DNA的檢測,差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=9.78,敏感度=0.00;χ2=4.39,特異度=0.04)。

    圖1 HPV DNA陽性患者中HPV mRNA陽性的病理分型分布

    圖2 HPV DNA陽性患者中HPV mRNA陽性的病理分級分布

    3 討論

    3.1 宮頸癌及目前臨床常用的篩查方法宮頸癌是一高發(fā)的婦科腫瘤,雖然在發(fā)達(dá)國家中已經(jīng)成功的降低了宮勁癌的死亡率,在其早期預(yù)防階段推行更加敏感和更加具體的方法學(xué)仍然存在著挑戰(zhàn)。流行病學(xué)統(tǒng)計(jì)學(xué)研究表明,宮頸癌死亡率較高,每年約有50萬的婦女因其去世,對家庭和社會帶來嚴(yán)重的健康威脅。再者,人乳頭瘤病毒感染也被認(rèn)定為宮頸癌的主要病因之一,早期篩查有助于宮頸癌的防治與轉(zhuǎn)歸[9]。因此,臨床迫切需要新型特異性生物標(biāo)記物來實(shí)現(xiàn)診斷與干預(yù)。當(dāng)前HPV的分子診斷方法主要依賴于對HPV DNA標(biāo)記物檢測。有研究認(rèn)為,HPV DNA標(biāo)記物檢測是病因?qū)W依據(jù),不能判斷出宮頸感染的具體階段以及癌基因的活性程度[10]。相對來說,HPV E6/E7標(biāo)記物則可在宮頸癌組織中表現(xiàn)為癌基因活性,同時(shí)HPV E6/E7標(biāo)記物水平與病變的嚴(yán)重程度有關(guān)[11]。再者,研究還發(fā)現(xiàn)高危型HPV癌基因E6和E7對于惡性腫瘤的轉(zhuǎn)化和維持具有重要作用,因而檢測HPV E6和E7標(biāo)記物得到越來越多的關(guān)注。

    目前,最常用的篩查方法包括宮頸刮片檢查。基于重復(fù)的細(xì)胞學(xué)檢測,將追蹤患者異常的細(xì)胞形態(tài)切片作為指標(biāo),HPV DNA標(biāo)記物檢測以及陰道鏡檢測[1]。在篩查子宮頸癌中,細(xì)胞形態(tài)學(xué)的低敏感性以及HPV DNA標(biāo)記物檢測的特異性都需要提高,并且采用更加特異的方法進(jìn)行演算,而不是采用細(xì)胞形態(tài)學(xué)和HPV DNA標(biāo)記物檢測,尤其對于年輕的群體(21~29歲)來說,因?yàn)檫@一群體不建議采用HPV DNA檢測。對于區(qū)分暫時(shí)性和永久性感染,DNA檢測不足以提供信息。這種檢測標(biāo)記物賦予了全面診斷和全局治療暫時(shí)性感染的風(fēng)險(xiǎn)。檢測HPV原癌基因的活性而不是檢測HPV DNA的存在是一種更加相關(guān)的診斷宮頸癌病變以及宮頸癌的指標(biāo)。它能夠提供臨床上的預(yù)測標(biāo)志,以區(qū)分女性存在發(fā)展為高級別的宮頸不典型增生病變或者宮頸癌的風(fēng)險(xiǎn)。并且在評估女性輕微宮頸病變中,對于檢測HPV DNA的存在,檢測其活性可以用來作為更加特異的指標(biāo)。為了提高篩查的程序,建立更好的特異性,基于HPV mRNA的檢測方法學(xué)。

    3.2 HPV DNA和E6/E7 mRNA檢測標(biāo)記物與宮頸病變程度HPV基因組中E6/E7基因是病毒原癌基因,病毒DNA一旦整合進(jìn)入宿主細(xì)胞DNA中,E6/E7基因?qū)⒉皇芸刂频馗叨缺磉_(dá)。E6/E7 mRNA表達(dá)是宮頸癌發(fā)生發(fā)展的必經(jīng)步驟。隨著宮頸病變的加重,HPV E6/E7 mRNA檢測的陽性率也隨之增加。張生枝等[10]的對CIN2宮頸病變患者的研究發(fā)現(xiàn),HPV E6/ E7 mRNA特異度高于HPV DNA,通過ROC曲線分析,其準(zhǔn)確性也高于HPV DNA。但HPV DNA的靈敏度不夠高,導(dǎo)致漏診風(fēng)險(xiǎn)的存在。

    3.3 兩種標(biāo)記物的敏感性和特異性本研究分別采用HPV DNA和E6/E7 mRNA檢測兩種標(biāo)記物對406例患者標(biāo)本進(jìn)行了比較研究。研究結(jié)果表明,HPV DNA檢測的陽性率(47%)高于HPV E6/E7 mRNA檢測(31.2%)。本研究采用組織病理學(xué)標(biāo)準(zhǔn)作為診斷的金標(biāo)準(zhǔn)。在CIN1分級標(biāo)本中,HPV DNA檢測的敏感度與特異度與HPV mRNA檢測的敏感度和特異性上沒有差異。在CIN2分級標(biāo)本的檢測中,HPV mRNA檢測的特異性高于HPV DNA檢測,但是敏感性比HPV DNA檢測低。在對CIN3分級標(biāo)本的檢測中,HPV mRNA檢測的敏感度和特異性都高于對HPV DNA的檢測。這與張生枝等[10]的研究結(jié)果相一致。上述研究結(jié)果表明,HPV mRNA檢測在對宮頸癌患者的診斷方面比HPV DNA檢測更具有優(yōu)勢,可以顯著減少假陰性結(jié)果。因此HPV E6/E7 mRNA檢測在臨床上對宮頸病變的檢測與診斷中具有廣闊的應(yīng)用前景,加之PCR技術(shù)日漸成熟,其具有檢測時(shí)間少,靶點(diǎn)精確和技術(shù)先進(jìn)的特點(diǎn),HPV E6/E7 mRNA檢測未來可能成為宮頸癌篩查的重要輔助診斷指標(biāo)與手段。

    [1]Carcopino X,Henry M,Olive D,et al.Detection and quantification of human papillomavirus genital infections:virological,epidemiological,and clinical applications[J].Med Mal Infect,2011,41(2):68-79.

    [2]Ronco G,Dillner J,Elfstr?m KM,et al.Efficacy of HPV-based screening for prevention of invasive cervical cancer:Follow-up of four European randomised controlled trials[J].Lancet,2014,383 (9916):524-532.

    [3]Andersson E,Karrberg C,Radberg T,et al.Type-dependent E6/E7 mRNA expression of single and multiple high-risk human papillomavirus infections in cervical neoplasia[J].J Clin Virol,2012,54(1): 61-65.

    [4]Ratnam S,Coutlee F,Fontaine D,et al.Clinical performance of the Pre Tect HPV-Proofer E6/E7 mRNA assay in comparison with that of the Hybrid Capture 2 test for identification of women at risk of cervical cancer[J].J Clin Microbiol,2010,48(8):2779-2785.

    [5]Verdoodt F,Szarewski A,Halfon P,et al.Triage of women with minor abnormal cervical cytology:Meta analysis of the accuracy of an assay targeting messenger ribonucleic acid of 5 high-risk human papillomavirus types[J].Cancer Cytopathol,2013,121(12):675-687.

    [6]Shen Y,Gong J,He Y,et al.Quntivirus HPV E6/E7 RNA 3.0 assay (Bdna)is as sensitive,but less specific than Hybrid caputure 2 test [J].J VirolMethods,2013,187(2):288-293.

    [7]Pietrzak B,Mazanowska N,Ekiel AM,et al.Prevalence of high-risk human papillomavirus cervical infection in female kidney graft recipients:an observational study[J].Virol J,2012,9:117.

    [8]杜彩英,李芳.人乳頭瘤病毒DNA及E6/E7 mRNA檢測在宮頸病變診斷中的比較研究[J].中國優(yōu)生與遺傳雜志,2015,23(4):38-40.

    [9]Argyri E,Tsimplaki E,et al.E6/E7 mRNA expression of high-risk HPV types in 849 greek women[J].Anticancer Res,2013,33(9): 4007-4011.

    [10]張生枝,邵華江,馬建婷.人乳頭瘤病毒E6/E7 mRNA檢測在宮頸病變篩查中的應(yīng)用價(jià)值[J].中國實(shí)驗(yàn)診斷學(xué),2014,18(4):582-585.

    [11]黃寶英,周倫順,富顯果,等.HPV E6/E7 mRNA檢測對宮頸癌篩查意義的初步評價(jià)[J].中華腫瘤防治雜志,2013,7(14):1061-1064.

    Comparative study of HPV E6/E7 mRNA and HPV DNA biomarker in the diagnosis of cervical carcinoma.

    WANG Juan1,YANG Lan1,CUI Bing1,WANG Li-feng1,WEN Qing-hua1,XU Lan-lan1,WU Fu-qing2.Department of Obstetrics and Gynecology1,Department of Laboratory2,the People's Hospital of Lianjiang City,Zhanjiang 524400,Guangdong,CHINA

    ObjectiveTo explore the application value of two biomarkers of HPV E6/E7 mRNA and HPV DNA in the screening diagnosis of cervical carcinoma.MethodsA total of 406 patients with cervical carcinoma, who admitted to Department of Obstetrics and Gynecology of the People's Hospital of Lianjiang City from January 2014 to January 2016,were selected as the research objects.Human papillomavirus(HPV)E6/E7 mRNA and HPV DNA were detected by polymerase chain reaction(PCR)in all patients,and the sensitivity and specificity of the two markers for cervical intraepithelial neoplasia diagnosis were evaluated and compared by ThinPrep liquid based cytology(TCT).ResultsThe positive rate of HPV DNA and E6/E7 mRNA test were 47%(191/406)and 31.2%(127/406), respectively(P<0.05).The overall coincidence rate of the two markers was 85.5%.There were no significant difference between HPV DNA and E6/E7 mRNA test in sensitivity and specificity for detecting CIN1(88.6%vs 86.9%,75.8%vs 73.4%,P>0.05).There were significant differences between HPV DNA and E6/E7 mRNA test in sensitivity and specificity for detecting CIN2(93.7%vs 83.9%,P<0.05;79.8%vs 93.7%,P<0.05).The sensitivity and specificity of HPV E6/E7 mRNA assay(98.7%,85.9%,respectively)were significantly higher than those of HPV DNA test(89.1%,78.8%,respectively)for detecting CIN3(P<0.05).ConclusionIn the screening diagnosis of HPV of cervical carcinoma,HPV E6/E7 mRNAtest has significantly higher specificity and sensitivity than HPV DNAtest.

    Human papillomavirus(HPV);E6/E7 mRNA;Cervical carcinoma;Screening,Biomarker

    R737.33

    A

    1003—6350(2016)21—3458—04

    2016-05-25)

    廣東省湛江市非資助科技攻關(guān)計(jì)劃項(xiàng)目(編號:2014B101)

    王娟。E-mail:13610188703@qq.com

    10.3969/j.issn.1003-6350.2016.21.006

    猜你喜歡
    敏感度特異性宮頸癌
    中老年女性的宮頸癌預(yù)防
    全體外預(yù)應(yīng)力節(jié)段梁動力特性對于接縫的敏感度研究
    電視臺記者新聞敏感度培養(yǎng)策略
    新聞傳播(2018年10期)2018-08-16 02:10:16
    精確制導(dǎo) 特異性溶栓
    在京韓國留學(xué)生跨文化敏感度實(shí)證研究
    Hepsin及HMGB-1在宮頸癌組織中的表達(dá)與侵襲性相關(guān)性分析
    BOPIM-dma作為BSA Site Ⅰ特異性探針的研究及其應(yīng)用
    重復(fù)周圍磁刺激治療慢性非特異性下腰痛的臨床效果
    E-cadherin、Ezrin在宮頸癌組織中的表達(dá)及臨床意義
    食管疾病(2015年3期)2015-12-05 01:45:07
    兒童非特異性ST-T改變
    亚洲精品第二区| 夫妻性生交免费视频一级片| 久久99精品国语久久久| 国产精品三级大全| 国产精品嫩草影院av在线观看| 亚洲专区中文字幕在线 | 亚洲精品久久午夜乱码| 国产精品一二三区在线看| 在线观看免费视频网站a站| 免费观看人在逋| 久久久精品国产亚洲av高清涩受| 日日摸夜夜添夜夜爱| 热re99久久精品国产66热6| 久久毛片免费看一区二区三区| 亚洲国产精品一区二区三区在线| 性少妇av在线| 美国免费a级毛片| 中文字幕制服av| 中文字幕人妻丝袜一区二区 | 国产欧美日韩一区二区三区在线| 成人免费观看视频高清| 午夜老司机福利片| 毛片一级片免费看久久久久| 成年av动漫网址| 在线天堂中文资源库| 黄片无遮挡物在线观看| 欧美久久黑人一区二区| 老汉色∧v一级毛片| 熟女av电影| 18在线观看网站| 久久久国产一区二区| 在现免费观看毛片| 亚洲精品久久成人aⅴ小说| 51午夜福利影视在线观看| av片东京热男人的天堂| av不卡在线播放| 极品少妇高潮喷水抽搐| 欧美日韩综合久久久久久| 欧美人与性动交α欧美精品济南到| 成人漫画全彩无遮挡| 韩国av在线不卡| 亚洲人成网站在线观看播放| 久久99精品国语久久久| 一区二区三区四区激情视频| 黑人巨大精品欧美一区二区蜜桃| 性高湖久久久久久久久免费观看| 99热网站在线观看| 我要看黄色一级片免费的| videos熟女内射| 免费高清在线观看日韩| 久久久久视频综合| 女性被躁到高潮视频| 巨乳人妻的诱惑在线观看| 你懂的网址亚洲精品在线观看| 99热网站在线观看| 亚洲一区中文字幕在线| 免费看不卡的av| 亚洲精品自拍成人| 我的亚洲天堂| www.自偷自拍.com| 亚洲欧美一区二区三区黑人| 欧美另类一区| 国产成人欧美| 老司机影院毛片| 日韩制服骚丝袜av| 五月天丁香电影| 精品亚洲成国产av| 肉色欧美久久久久久久蜜桃| 国产亚洲欧美精品永久| 一边摸一边做爽爽视频免费| 老汉色av国产亚洲站长工具| 色婷婷av一区二区三区视频| 亚洲国产精品成人久久小说| 80岁老熟妇乱子伦牲交| 欧美日韩视频精品一区| 日日爽夜夜爽网站| 亚洲欧美色中文字幕在线| 51午夜福利影视在线观看| 成人三级做爰电影| a 毛片基地| 久久久欧美国产精品| 国产精品国产三级专区第一集| 亚洲情色 制服丝袜| 久久精品久久久久久久性| 久久av网站| 日本色播在线视频| 欧美乱码精品一区二区三区| 秋霞伦理黄片| 国产一区二区三区av在线| 久久精品久久精品一区二区三区| 精品亚洲成a人片在线观看| 香蕉丝袜av| 在线观看三级黄色| 欧美精品亚洲一区二区| 99re6热这里在线精品视频| 看非洲黑人一级黄片| 精品少妇内射三级| 一区福利在线观看| 亚洲精品视频女| 久久国产精品大桥未久av| 日韩一卡2卡3卡4卡2021年| 精品久久久精品久久久| 久久久精品免费免费高清| 亚洲精品视频女| 欧美日韩视频高清一区二区三区二| 丝袜在线中文字幕| 丝袜美腿诱惑在线| www.熟女人妻精品国产| 亚洲专区中文字幕在线 | 亚洲欧美日韩另类电影网站| 不卡视频在线观看欧美| 欧美人与性动交α欧美精品济南到| 美女福利国产在线| avwww免费| 婷婷色麻豆天堂久久| 91老司机精品| 丝瓜视频免费看黄片| 国产精品av久久久久免费| 中文字幕色久视频| 秋霞在线观看毛片| 午夜福利在线免费观看网站| 成人国语在线视频| 久久久精品区二区三区| 香蕉丝袜av| 欧美中文综合在线视频| 久久久精品区二区三区| 欧美最新免费一区二区三区| 成人国产av品久久久| 肉色欧美久久久久久久蜜桃| 成人18禁高潮啪啪吃奶动态图| 999精品在线视频| 女性生殖器流出的白浆| 大片电影免费在线观看免费| 欧美 日韩 精品 国产| 久久久国产精品麻豆| 各种免费的搞黄视频| 久久久久精品性色| 不卡视频在线观看欧美| 大片电影免费在线观看免费| 啦啦啦啦在线视频资源| 亚洲av电影在线进入| 日韩中文字幕视频在线看片| 狂野欧美激情性bbbbbb| 国产精品.久久久| 成人国语在线视频| 老汉色∧v一级毛片| 大陆偷拍与自拍| 国产成人免费观看mmmm| 国产精品一二三区在线看| 性高湖久久久久久久久免费观看| 一级毛片电影观看| 亚洲av成人不卡在线观看播放网 | 久久鲁丝午夜福利片| 极品人妻少妇av视频| 曰老女人黄片| 尾随美女入室| 成年女人毛片免费观看观看9 | 在线亚洲精品国产二区图片欧美| 精品国产一区二区三区久久久樱花| 高清av免费在线| 黄网站色视频无遮挡免费观看| 亚洲中文av在线| 国产男人的电影天堂91| 亚洲欧美一区二区三区国产| 国产精品一区二区在线观看99| xxx大片免费视频| 免费黄色在线免费观看| 成年人免费黄色播放视频| 日本vs欧美在线观看视频| 美女国产高潮福利片在线看| 老汉色av国产亚洲站长工具| 国产精品三级大全| 中文字幕制服av| 久久精品国产亚洲av高清一级| 制服人妻中文乱码| 999久久久国产精品视频| 制服丝袜香蕉在线| 久久热在线av| 一个人免费看片子| 日本色播在线视频| 一级a爱视频在线免费观看| 欧美日本中文国产一区发布| 国产97色在线日韩免费| 美女视频免费永久观看网站| 久久精品人人爽人人爽视色| 成人18禁高潮啪啪吃奶动态图| 国产乱人偷精品视频| 亚洲av欧美aⅴ国产| 日本av手机在线免费观看| 精品亚洲成a人片在线观看| 亚洲精品视频女| 热re99久久国产66热| 日韩电影二区| 国产极品粉嫩免费观看在线| 亚洲五月色婷婷综合| 99国产精品免费福利视频| 操美女的视频在线观看| 女的被弄到高潮叫床怎么办| 最近中文字幕2019免费版| 成人影院久久| 波多野结衣av一区二区av| 91国产中文字幕| 亚洲国产最新在线播放| 两个人免费观看高清视频| 久久精品亚洲av国产电影网| 2021少妇久久久久久久久久久| 亚洲视频免费观看视频| 狂野欧美激情性xxxx| 婷婷色av中文字幕| 麻豆av在线久日| 男男h啪啪无遮挡| 午夜福利乱码中文字幕| 亚洲伊人久久精品综合| 妹子高潮喷水视频| 亚洲激情五月婷婷啪啪| 午夜91福利影院| 国产精品国产av在线观看| 看非洲黑人一级黄片| 久久久久精品性色| 亚洲精品美女久久av网站| 日日撸夜夜添| 国产精品蜜桃在线观看| 精品国产乱码久久久久久男人| 国产男女内射视频| 国产亚洲av片在线观看秒播厂| 母亲3免费完整高清在线观看| av卡一久久| 成年动漫av网址| 亚洲一卡2卡3卡4卡5卡精品中文| 亚洲国产精品成人久久小说| videosex国产| 亚洲情色 制服丝袜| 午夜影院在线不卡| 国产成人91sexporn| 少妇人妻精品综合一区二区| 美女高潮到喷水免费观看| 男女边吃奶边做爰视频| 精品人妻一区二区三区麻豆| 国产欧美日韩综合在线一区二区| 久热爱精品视频在线9| 大陆偷拍与自拍| 黄片播放在线免费| 久久久欧美国产精品| 亚洲精品乱久久久久久| 日日啪夜夜爽| 成人国产麻豆网| 国产精品免费视频内射| 纵有疾风起免费观看全集完整版| 丰满少妇做爰视频| 美女午夜性视频免费| 日本一区二区免费在线视频| 日韩中文字幕欧美一区二区 | 国产成人欧美在线观看 | 90打野战视频偷拍视频| 综合色丁香网| avwww免费| 精品久久久久久电影网| 久久久久久久国产电影| 成年美女黄网站色视频大全免费| 国产av国产精品国产| 日韩一区二区视频免费看| 亚洲美女视频黄频| 亚洲精品国产av蜜桃| 国产精品国产三级专区第一集| 欧美 亚洲 国产 日韩一| 国产一区二区三区综合在线观看| 9色porny在线观看| 国产精品国产av在线观看| 成人国语在线视频| 高清在线视频一区二区三区| 99热国产这里只有精品6| 少妇 在线观看| 黄频高清免费视频| 午夜91福利影院| 精品少妇黑人巨大在线播放| 久久ye,这里只有精品| 久久久国产欧美日韩av| 日韩精品有码人妻一区| 韩国av在线不卡| 高清黄色对白视频在线免费看| 在线观看免费高清a一片| 黄片小视频在线播放| 熟女少妇亚洲综合色aaa.| 涩涩av久久男人的天堂| 日韩不卡一区二区三区视频在线| 蜜桃国产av成人99| 91aial.com中文字幕在线观看| 国产精品99久久99久久久不卡 | 97精品久久久久久久久久精品| 人体艺术视频欧美日本| netflix在线观看网站| 亚洲第一青青草原| 搡老乐熟女国产| 日韩精品免费视频一区二区三区| 又粗又硬又长又爽又黄的视频| 日日啪夜夜爽| 99久久精品国产亚洲精品| 欧美成人精品欧美一级黄| 日韩大码丰满熟妇| 侵犯人妻中文字幕一二三四区| 叶爱在线成人免费视频播放| 丝袜美足系列| 波野结衣二区三区在线| 啦啦啦视频在线资源免费观看| 国产一卡二卡三卡精品 | 十八禁高潮呻吟视频| 两性夫妻黄色片| 97精品久久久久久久久久精品| 男女免费视频国产| 高清欧美精品videossex| av有码第一页| 在线观看免费高清a一片| 亚洲久久久国产精品| 丰满乱子伦码专区| 欧美变态另类bdsm刘玥| 免费av中文字幕在线| 午夜影院在线不卡| xxx大片免费视频| 亚洲成人免费av在线播放| 精品国产乱码久久久久久小说| 免费看av在线观看网站| 国产一区二区三区av在线| 一级黄片播放器| 国产精品久久久久久人妻精品电影 | 狠狠精品人妻久久久久久综合| 欧美日韩成人在线一区二区| 国产精品一二三区在线看| 亚洲激情五月婷婷啪啪| 亚洲精品成人av观看孕妇| 伊人亚洲综合成人网| 老司机亚洲免费影院| 精品国产一区二区三区久久久樱花| 91精品国产国语对白视频| 高清视频免费观看一区二区| 天美传媒精品一区二区| 亚洲成av片中文字幕在线观看| www.熟女人妻精品国产| kizo精华| 久久久精品94久久精品| 热99久久久久精品小说推荐| 久久午夜综合久久蜜桃| 亚洲精品一二三| 激情五月婷婷亚洲| 蜜桃在线观看..| 国产精品欧美亚洲77777| 国产xxxxx性猛交| 成年女人毛片免费观看观看9 | 亚洲国产精品999| 伦理电影免费视频| 尾随美女入室| 日本av手机在线免费观看| 亚洲,欧美,日韩| 中国国产av一级| 国产一卡二卡三卡精品 | 欧美在线黄色| 国产亚洲欧美精品永久| 日韩欧美一区视频在线观看| 国产精品 欧美亚洲| 午夜免费观看性视频| 国产男人的电影天堂91| 欧美黑人精品巨大| svipshipincom国产片| 亚洲精品久久成人aⅴ小说| 免费久久久久久久精品成人欧美视频| 一区二区日韩欧美中文字幕| 成人手机av| 不卡av一区二区三区| 日本黄色日本黄色录像| 成人漫画全彩无遮挡| 欧美激情 高清一区二区三区| 久久午夜综合久久蜜桃| 男女床上黄色一级片免费看| 日本av手机在线免费观看| 99国产精品免费福利视频| 午夜免费鲁丝| 19禁男女啪啪无遮挡网站| 看免费av毛片| 国产精品一区二区在线观看99| 色播在线永久视频| 免费观看av网站的网址| 久久精品亚洲熟妇少妇任你| 老鸭窝网址在线观看| 久久久久精品性色| 国产精品国产三级专区第一集| 建设人人有责人人尽责人人享有的| 麻豆av在线久日| 99热全是精品| 一区在线观看完整版| 老汉色∧v一级毛片| 美女主播在线视频| 伊人久久国产一区二区| 一本色道久久久久久精品综合| 少妇精品久久久久久久| 久久久国产一区二区| 日韩一区二区视频免费看| av一本久久久久| 蜜桃在线观看..| 久久久久久久久免费视频了| 亚洲国产日韩一区二区| 欧美日韩国产mv在线观看视频| 你懂的网址亚洲精品在线观看| 热99国产精品久久久久久7| 永久免费av网站大全| 国产精品熟女久久久久浪| videosex国产| 欧美日韩视频高清一区二区三区二| 日韩欧美一区视频在线观看| 99热网站在线观看| 国产免费又黄又爽又色| 丰满乱子伦码专区| 99国产精品免费福利视频| 啦啦啦视频在线资源免费观看| 国产精品一区二区在线观看99| 女人爽到高潮嗷嗷叫在线视频| 狠狠婷婷综合久久久久久88av| 2021少妇久久久久久久久久久| 天天操日日干夜夜撸| 久久久久网色| 亚洲av中文av极速乱| 一区二区三区激情视频| 99精品久久久久人妻精品| 亚洲av成人不卡在线观看播放网 | 看非洲黑人一级黄片| av线在线观看网站| 国产精品欧美亚洲77777| 欧美变态另类bdsm刘玥| 久久99热这里只频精品6学生| www.av在线官网国产| av卡一久久| 肉色欧美久久久久久久蜜桃| 一级a爱视频在线免费观看| 91国产中文字幕| 国产欧美日韩一区二区三区在线| 日韩大片免费观看网站| 人妻 亚洲 视频| 男女国产视频网站| 成年人免费黄色播放视频| 王馨瑶露胸无遮挡在线观看| 亚洲七黄色美女视频| 久热爱精品视频在线9| 午夜av观看不卡| 老熟女久久久| 熟女少妇亚洲综合色aaa.| 亚洲欧美成人精品一区二区| 黄色毛片三级朝国网站| 国产男女超爽视频在线观看| 美女国产高潮福利片在线看| 两性夫妻黄色片| 久久人人97超碰香蕉20202| e午夜精品久久久久久久| 男女无遮挡免费网站观看| 制服人妻中文乱码| 成人亚洲精品一区在线观看| a级毛片黄视频| 在线观看免费日韩欧美大片| 久久人人97超碰香蕉20202| 久久久久视频综合| 欧美老熟妇乱子伦牲交| 国产成人免费无遮挡视频| 色网站视频免费| 久久久久精品性色| 亚洲天堂av无毛| 99久久人妻综合| 亚洲综合色网址| 国产午夜精品一二区理论片| 黄色毛片三级朝国网站| 久久99精品国语久久久| 亚洲av综合色区一区| 又大又黄又爽视频免费| 国产免费又黄又爽又色| 黄片播放在线免费| 美女脱内裤让男人舔精品视频| 黄色视频在线播放观看不卡| 哪个播放器可以免费观看大片| 国产乱人偷精品视频| 免费久久久久久久精品成人欧美视频| 精品少妇黑人巨大在线播放| 亚洲精品国产av成人精品| 亚洲激情五月婷婷啪啪| 国产爽快片一区二区三区| 亚洲精品乱久久久久久| 宅男免费午夜| 中文字幕高清在线视频| 美女大奶头黄色视频| 国产无遮挡羞羞视频在线观看| 菩萨蛮人人尽说江南好唐韦庄| 成年动漫av网址| 精品少妇久久久久久888优播| 黑丝袜美女国产一区| 欧美精品亚洲一区二区| 日韩伦理黄色片| 在线观看一区二区三区激情| 丰满迷人的少妇在线观看| 久久久久久久久久久免费av| 老司机在亚洲福利影院| 国产熟女午夜一区二区三区| 日本91视频免费播放| 国产人伦9x9x在线观看| 夫妻性生交免费视频一级片| 一二三四在线观看免费中文在| 免费观看a级毛片全部| 国产亚洲精品第一综合不卡| 在线观看国产h片| 午夜福利在线免费观看网站| 最近的中文字幕免费完整| 操出白浆在线播放| 男女无遮挡免费网站观看| 日本av手机在线免费观看| 肉色欧美久久久久久久蜜桃| 久久久精品区二区三区| 成人国语在线视频| 午夜福利,免费看| 国语对白做爰xxxⅹ性视频网站| 天天躁夜夜躁狠狠久久av| 国产欧美日韩一区二区三区在线| 熟女少妇亚洲综合色aaa.| 国产一区二区三区综合在线观看| 免费日韩欧美在线观看| 波多野结衣一区麻豆| 无遮挡黄片免费观看| 久久热在线av| 免费观看人在逋| 久久精品久久久久久久性| 最新在线观看一区二区三区 | 夫妻性生交免费视频一级片| 少妇 在线观看| 亚洲国产av影院在线观看| 成人午夜精彩视频在线观看| 热re99久久国产66热| 日韩人妻精品一区2区三区| 999久久久国产精品视频| 亚洲国产中文字幕在线视频| 欧美激情极品国产一区二区三区| 曰老女人黄片| 日韩不卡一区二区三区视频在线| 考比视频在线观看| 9191精品国产免费久久| 欧美日韩成人在线一区二区| 无遮挡黄片免费观看| 人人澡人人妻人| 欧美日韩一区二区视频在线观看视频在线| 久久精品久久久久久久性| 一本—道久久a久久精品蜜桃钙片| 免费在线观看完整版高清| 婷婷色综合www| 国产精品无大码| 国产成人系列免费观看| 国产99久久九九免费精品| 国产女主播在线喷水免费视频网站| 久久久久久久大尺度免费视频| 精品午夜福利在线看| 久久鲁丝午夜福利片| 国产 精品1| 亚洲av成人精品一二三区| 国产精品国产av在线观看| 亚洲国产最新在线播放| 黄片无遮挡物在线观看| 精品一区二区三卡| 久久 成人 亚洲| 欧美精品一区二区大全| 中文字幕亚洲精品专区| 久久久精品94久久精品| 人体艺术视频欧美日本| 亚洲av综合色区一区| 啦啦啦在线观看免费高清www| 国产在线免费精品| 少妇 在线观看| 色吧在线观看| 国产精品二区激情视频| 美女国产高潮福利片在线看| 国产精品秋霞免费鲁丝片| 亚洲欧美成人精品一区二区| 老司机深夜福利视频在线观看 | 亚洲精品久久久久久婷婷小说| 国产日韩欧美亚洲二区| 观看美女的网站| 男女免费视频国产| 久久久久久人妻| 欧美精品av麻豆av| 免费观看av网站的网址| 在线亚洲精品国产二区图片欧美| 男女国产视频网站| 肉色欧美久久久久久久蜜桃| 久久久久久久大尺度免费视频| 一级毛片电影观看| 中文字幕另类日韩欧美亚洲嫩草| 国产精品久久久久久久久免| 免费av中文字幕在线| 国产av码专区亚洲av| 国产无遮挡羞羞视频在线观看| 国产亚洲欧美精品永久| 亚洲人成77777在线视频| 国产乱来视频区| 18禁裸乳无遮挡动漫免费视频| 亚洲精品美女久久av网站| 狂野欧美激情性bbbbbb| 一本—道久久a久久精品蜜桃钙片| 国产一区二区三区综合在线观看| 狂野欧美激情性bbbbbb| 一本色道久久久久久精品综合| 国产欧美亚洲国产| 国产亚洲av高清不卡| 国产精品人妻久久久影院| 看十八女毛片水多多多| 激情视频va一区二区三区| 中文精品一卡2卡3卡4更新| 国产成人精品福利久久| 国产日韩欧美视频二区| 色综合欧美亚洲国产小说| 亚洲人成77777在线视频| 蜜桃国产av成人99| www.熟女人妻精品国产| 国产成人精品久久久久久| 丝瓜视频免费看黄片| 人人妻人人添人人爽欧美一区卜|