山羊TTF-1基因的表達及其分子生物學(xué)特性

韓芬霞,蔣雪蒙,侯蘇梅

（河南科技學(xué)院,河南新鄉(xiāng)453003）

山羊TTF-1基因的表達及其分子生物學(xué)特性

韓芬霞,蔣雪蒙,侯蘇梅

（河南科技學(xué)院,河南新鄉(xiāng)453003）

甲狀腺轉(zhuǎn)錄因-1（TTF-1）是NKx組織特異性轉(zhuǎn)錄因子家族中的一員.TTF-1基因可能是調(diào)節(jié)哺乳動物初情期的關(guān)鍵基因.采取山羊的甲狀腺、下丘腦、垂體、大腦、卵巢等與青春期發(fā)育和繁殖性能有關(guān)的組織樣,采用RT-PCR方法來檢測TTF-1基因在以上組織中的表達特性.結(jié)果表明：TTF-1基因在甲狀腺、下丘腦、垂體、大腦、卵巢中均有表達,為進一步研究山羊TTF-1基因及其對哺乳動物繁殖性能的影響提供理論基礎(chǔ).

山羊；TTF-1基因；RT-PCR；表達

甲狀腺轉(zhuǎn)錄因子-1（TTF-1）為NKx轉(zhuǎn)錄因子家族成員[1],是調(diào)控細胞分化及特異功能維持的關(guān)鍵因子,在胚胎和發(fā)育成熟的甲狀腺、肺上皮細胞中表達[2-4].Lee等[5]研究發(fā)現(xiàn)TTF-1基因可能是影響哺乳動物青春期早期主要激活活動的因素.Ojeda博士的科學(xué)研究小組在2004年的神經(jīng)學(xué)年會上公布了他們的發(fā)現(xiàn)[6],在性發(fā)育開始時,下丘腦中的一個分泌細胞群中存在TTF-1基因的表達；在非人類的靈長動物青春期開始時,該基因的表達水平有所上升.在隨后的研究中,他們又發(fā)現(xiàn)當(dāng)選擇性的刪除小鼠神經(jīng)元中的TTF-1基因后,小鼠的性成熟期推遲,可生育時間縮短,產(chǎn)仔次和窩產(chǎn)子數(shù)均減少,表明TTF-1基因存在于控制性發(fā)育和生殖功能的室周核和神經(jīng)元內(nèi),因此該基因與動物的繁殖機能有著密切關(guān)系.

本研究對山羊的甲狀腺,下丘腦,垂體,大腦及卵巢等組織進行采樣、進行RT-PCR檢測TTF-1在各組織中的表達情況,為進一步研究TTF-1基因與山羊繁殖機能及多胎的相關(guān)性奠定基礎(chǔ).

1 材料及方法

1.1 試劑

試驗樣品采自莎能奶山羊（外來品種和本地品種的雜交）,由輝縣山羊養(yǎng)殖農(nóng)戶提供.采集樣品部位：1甲狀腺,2下丘腦,3垂體,4大腦,5卵巢,-70℃保存.

1.2 方法

1.2.1 總RNA提取使用TRIzol一步法提取總RNA,-70℃保存[7].

1.2.2 引物引物根據(jù)GenBank已公布TTF-1基因,進行同源性比對,參照韓芬霞在GenBank發(fā)表的綿羊TTF-1基因序列（登錄號FJ177515.2）[8],利用Primer Premier V5.0和Primer 3軟件進行設(shè)計.TTF-1基因所設(shè)計引物序列為：

SP1（上游）：5’-TGTCGATGAGTCCAAAGCAC-3’（20 bp）

SP2（下游）：5’-TGTTCCGCATGGTGTCCT-3’（18 bp）

1.2.3 RT-PCR反應(yīng)RT-PCR反應(yīng)體系：Total RNA 1.00 μL,MgCl2（25 mmol/L）2.00 μL,10×RT Buffer 1.00 μL,dNTP Mixture（10 mmol/L）1.00μL,RNase Inhibitor（40 U/μL）0.25 μL,AMV Reverse Transcriptase XL（5 U/μL）0.50 μL,Oligo dT-A daptor Primer（2.5 μmol/L）0.50 μL,加入RNase Free dd H2O到10.00 μL. RT反應(yīng)條件：30℃10 min,42℃30 min,99℃5 min,5℃5 min.

PCR反應(yīng)體系：模板DNA 1.0 μL,PCR Buffer 2.5 μL,dNTP1.0 μL,上、下游引物各1.0 μL,TagDNA聚合酶0.5 μL,加超純水至25 μL.PCR反應(yīng)條件：94℃預(yù)變性5 min,94℃變性30 s,55℃退火20 s,72℃延伸20 s,35個循環(huán),最后72℃終延伸5 min.

1.2.4 目的片段克隆與測序回收TTF-1基因的RT-PCR產(chǎn)物,將回收產(chǎn)物與pGEM-T載體連接,轉(zhuǎn)化入大腸桿菌DH 5α,經(jīng)藍白斑篩選和菌落PCR鑒定,選擇3個陽性克隆送上海生工進行測序.

1.2.5 生物信息學(xué)分析通過生物軟件DNAStar中的SeqMAN程序構(gòu)建TTF-1基因的DNA序列.

2 結(jié)果與分析

2.1 RT-PCR擴增結(jié)果

RT-PCR擴增結(jié)果見圖1.

圖1 山羊TTF-1基因表達部位檢測Fig.1 Detecting of the expression position of TTF-1 in goat

由圖1可以看出,RT-PCR擴增后所得的條帶大小跟預(yù)期的條帶基本一致,在甲狀腺、肺、肝臟、腎臟、卵巢中均檢測到320 bp左右的片段,可初步判斷TTF-1基因在這幾個部位有表達.

2.2 測序結(jié)果

對RT-PCR的產(chǎn)物進行回收、克隆,送由上海生工測序.測序結(jié)果表明：試驗得到的DNA片段為318bp,經(jīng)BLAST同源性分析,與綿陽TTF-1基因序列相比,同源性為100%,可確定為山羊TTF-1基因的序列.測序結(jié)果如下：

3 討論

卵巢是卵泡的發(fā)育場所,卵巢分泌的雌激素可正負反饋與下丘腦和垂體,促進或抑卵泡的生長和發(fā)育.本研究對TTF-1基因在甲狀腺、下丘腦、垂體、大腦和卵巢等組織樣進行RNA的提取、RT-PCR、測序,測序結(jié)果與已知的綿羊TTF-1基因片段基本一致.這就表明,TTF-1基因在與山羊青春期發(fā)育和繁殖機能有關(guān)的組織中都有表達.

溴化乙錠是瓊脂糖凝膠電泳中的熒光染色劑,當(dāng)染料插入分子后,與DNA結(jié)合的染料呈現(xiàn)熒光,其熒光產(chǎn)率比游離染料有所增加.從圖1可看出,前三個條帶的亮度和寬度明顯優(yōu)于后兩個,說明TTF-1基因雖然在各個樣本中都有表達,但相對來說,在甲狀腺、下丘腦、垂體中的表達量可能大于其在大腦、卵巢中的表達,但對這一基因在各自組織樣中具體表達量的多少,還需要進一步研究證明和補充.

4 小結(jié)

本試驗發(fā)現(xiàn)TTF-1基因不僅在甲狀腺、下丘腦、垂體、大腦等與內(nèi)分泌調(diào)節(jié)有關(guān)的組織中表達,還特異性的在影響山羊繁殖性狀的卵巢中表達,這為進一步研究山羊TTF-1基因及其功能,尋找影響山羊發(fā)情的主基因和多胎性提供了理論依據(jù).

[1]Agoff S N,Lamps L W,Philip A P,et al.Thyroid Transcription Factor-1 is expressed in extrapulmonary neuro endocrine tumors[J]. ModPathol,2000,13：238-242.

[2]Civitareal D,Lonigro R,Sinclair A J,et al.AThyroid-Specific Nuclear-Protein essential for Tissue-Specific expression of the thyroglobilin promoter[J].Embo Journal,1989,8（3）：35-42.

[3]Wert S E,Dey C R,Blair P A,et al.Increased expression of thyroid transcription Factor-1（TTF-1）in respiratory epithelial cells inhibits alveolarization and causes pulmonary inflammation[J].Dev.Biol.,2002,242：75-87.

[4]Breedveld G J,Jeroen W F,Danesino C,et al.Mutations in TTF-1 are associated with benign hereditary chorea[J].Human Molecular Genetics,2002,11（8）：971-979.

[5]Lee B J,Cho G J,Norgren R,et al.TTF-1,a homeodomain gene required for diencephalic morphogenesis,is postnatally expressed in the neuroendocrine brain in a developmentally regulated and cell-specifc fashion[J].Molecular and Cellar Neuroscience,2001,17（1）：107-126.

[6]OHSUscientistsidentify key gene that delays female puberty[EB]//Ol.（2004-10-25）[2010-12-08].http：//www. sciencedaily.com/releases/2004（10）/041025124145.htm.

[7]薩姆布魯克J,弗里奇E F,曼尼阿帝斯T.分子克隆實驗指南[M].北京：科學(xué)出版社,2002.

[8]韓芬霞.綿羊TTF-1基因的克隆、序列分析及表達部位檢測[D].蘭州：甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué),2009.

（責(zé)任編輯：盧奇）

Study on the expression and characterization of TTF-1 gene in goat

HAN Fenxia；JIANG Xuemeng；HOU Sumei
（Henan Institute of Science and Technology,Xinxiang 453003,China）

Thyroid transcription factor-1 belongs to NKx tissues's specific transcription factor.Some studies indicate that TTF-1 gene could be a critical gene which regulate puberty of mammalian.The thyroid,hypothalamus,hypophysis, brain,ovary which have a close relation with mammalian's adolescent development and reproductive trait were taked to detect the expression of TTF-1 mRNA in tissues through RT-PCR.The result indicated that the TTF-1 gene is expressed respectively in thyroid,hypothalamus,hypophysis,brain,ovary,giving theory basis for further study on the TTF-1 gene of goat and the effect on reproductive trait of mammalian.

goat;TTF-1 gene;RT-PCR;expression

S827

A

1008-7516（2016）01-0043-03

10.3969/j.issn.1008-7516.2016.01.010

2015-12-02

國家大學(xué)生創(chuàng)新項目(201310467060);河南省教育廳自然科學(xué)項目(15A230001)

韓芬霞(1978-),女,甘肅會寧人,碩士,講師.主要從事動物遺傳育種工作.