水通道蛋白在糖尿病大鼠陰道組織的表達*

楊雷，夏紀毅，姜雋，姜睿

（西南醫(yī)科大學附屬醫(yī)院：1泌尿外科;2醫(yī)學實驗中心;3血管外科，四川瀘州646000）

論著

水通道蛋白在糖尿病大鼠陰道組織的表達*

楊雷1，夏紀毅2，姜雋3，姜睿1

（西南醫(yī)科大學附屬醫(yī)院：1泌尿外科;2醫(yī)學實驗中心;3血管外科，四川瀘州646000）

目的：研究AQP 0、5、6、10、11及12在糖尿病大鼠陰道組織的表達。方法：將糖尿病大鼠隨機分為12、16周組并將正常大鼠隨機分為12、16周組（n=6）。分別測各組大鼠陰道潤滑及AQPs在陰道組織的表達情況。結(jié)果：本實驗中12、16周齡糖尿病大鼠血糖水平分別較12、16周對照組大鼠血糖水平顯著升高（P＜0.05），12及16周齡糖尿病大鼠陰道潤滑性（2.12± 1.41；2.64±0.88）分別較12及16周對照大鼠血糖陰道潤滑性（4.21±0.86；4.41±0.77）顯著降低（P＜0.05），糖尿病大鼠陰道組織中AQPs的表達均低于相應對照大鼠陰道組織中AQPs的表達（P＜0.05）。結(jié)論：糖尿病大鼠陰道組織AQPs的表達下降可能導致其陰道潤滑性下降。

水通道蛋白；糖尿??；陰道潤滑性；雌性大鼠

陰道潤滑困難指性生活時難以獲取并且保持陰道潤滑，是女性性功能障（Female sexual dysfunction，F(xiàn)SD）常見的癥狀和致病因素，損害患者的生活質(zhì)量[1-3]，女性陰道潤滑不充分發(fā)生率達3%-43%[3-5]。陰道潤滑與生殖器血管充血相關(guān)[6-7]。局部或全身雌激素替代可減緩低雌激素水平導致的陰道萎縮及干燥等癥狀[8]。然而陰道潤滑困難可發(fā)生于更年期前[9]，多種疾病如糖尿病、多發(fā)性硬化癥、高血壓等均可導致陰道干燥[10-12]，且與雌激素水平關(guān)系尚不清楚。多數(shù)研究顯示糖尿病女性軀體并發(fā)癥與FSD之間無相關(guān)性[13]。糖尿病患者心理因素導致FSD發(fā)病率可能高于生理因素，罹患糖尿病女性FSD風險更高[13]。糖尿病患者中FSD發(fā)病率75%高于普通人群的30.6%[14]，高血糖可以導致陰道干燥[15]。陰道潤滑困難在1型糖尿病中達14%～47%，對照組陰道潤滑困難為6%[16-17]，2型糖尿病中陰道潤滑困難達37.5%～66%，對照組陰道潤滑困難為22%[18-19]。因此有必要研究高血糖在FSD中所產(chǎn)生的作用。

陰道潤滑與血管活性腸肽、神經(jīng)肽Y、降鈣素相關(guān)基因肽的活性或表達以及使用選擇性5-羥色胺再攝取抑制劑有關(guān)[5-6,20]。最近認為女性性喚起是生殖器官血流增加是由NO所介導的[21-23]。部分實驗證明西地那非對陰道潤滑困難的功效[23-25]，其余研究顯示西地那非較安慰劑并未增加陰道潤滑[26-27]。PDE5I治療FSD的不同結(jié)果表明陰道潤滑過程有多種因素參與，其機制尚不清楚[26]。

水通道蛋白（Aquaporin water channels，AQPs）是一種有助于水和小分子溶質(zhì)進出細胞的膜蛋白，與陰道分泌作用有關(guān)。AQP 1～3主要表達在陰道毛細血管、靜脈及上皮細胞，AQP 5～6主要表達在陰道上皮細胞胞膜，未發(fā)現(xiàn)AQP 4、7、8、9在女性陰道組織的表達[28]。切除卵巢后陰道分泌物及AQP2在陰道組織的表達顯著降低，AQP 1表達無顯著變化[29]。高血糖可降低AQP 1～3的表達，導致陰道分泌物減少[30-31]，表示AQP 1～3在高血糖相關(guān)陰道潤滑及干燥中起主要作用。其他亞型AQPs在陰道組織的表達報道較少，進一步研究其余亞型AQPs（AQP 0、5、6、10、11、12）在大鼠陰道組織的表達、潤滑程度及血糖水平之間的關(guān)系有助于了解潤滑的機制，研究有效的糖尿病患者陰道潤滑困難的治療方法。

1 材料和方法

1.1 建立糖尿病大鼠模型及分組

于西南醫(yī)科大學醫(yī)學實驗動物中心購買雌性大鼠24只，隨機選取12只大鼠進行糖尿病建模，根據(jù)本課題組前期方法將鏈脲佐菌素（STZ）溶解于pH 4.5檸檬酸鹽緩沖液中（現(xiàn)配現(xiàn)用），濃度為0.1 mol/L，予以大鼠55 mg/kg腹腔內(nèi)注射建立糖尿病模型[30]，對照組大鼠以相同劑量檸檬酸緩沖液腹腔注射。STZ注射后48 h測所有大鼠尾靜脈血糖，血糖＞16.8 mmol/L認為建模成功。建模成功后糖尿病大鼠隨機分為：12周糖尿病大鼠（group A,n=6），16周糖尿病大鼠（group C,n=6），對照大鼠隨機分為12周對照大鼠（group B,n=6）以及16周對照大鼠（group D,n=6）。普通飲食及進水。每周檢測大鼠血糖及體重。

1.2 測定陰道潤滑

用1.5%戊巴妥鈉（50 mg/kg腹腔注射）麻醉大鼠，于直腸兩側(cè)分離暴露盆神經(jīng)，將棉簽置入大鼠陰道內(nèi)，以7 V、16 Hz、0.8 ms波幅電流刺激其盆神經(jīng)60 s，1 min后取出棉簽，測得陰道分泌物重量[29-30]。陰道潤滑性為分泌物重量/陰道重量×100%。

1.3 測定血漿雌激素

取大鼠血漿經(jīng)放射免疫分析測得大鼠血清雌激素水平(Bayer Inc,Germany)。

1.4 免疫組化測AQP 0、5、6、11的表達

取大鼠陰道組織遠端三分之一使用4%多聚甲醛固定液固定并包埋。用avidin-biotin complex (ABC)法進行免疫組化分析。用1∶50羊血清和1%牛血清白蛋白阻斷非特異性IgG。分別滴加AQP 0（兔抗大鼠多克隆抗體，1∶200，Santa Cruz），AQP 5、6、11（羊抗大鼠多克隆抗體，1∶100，Santa Cruz）后孵育，清洗切片后與二抗（50 uL/片，DK-2600，Dako，Glostrup，Denmark）孵育。正常大鼠血清代替一抗作為陰性對照。光鏡下觀察結(jié)果陽，用Image-Pro Plus 6.0圖像分析軟件（Media Cybernetics Inc.Bethesda，MD，USA）進行分析。AQP 10、12暫無適用免疫組化抗體，故未做免疫組化檢測。

1.5 Western印記測AQPs在陰道組織的表達

取大鼠遠端三分之一陰道組織行Western Blot[29]，待陰道組織裂解充分后，使用高速離心機按照17 000轉(zhuǎn)/分4℃下離心5 min，取上清液即為蛋白提取物，測其蛋白濃度。取蛋白樣品100℃水浴變性5 min，120 V下SDS–PAGE電泳90 min后，于4℃中400 mA恒流轉(zhuǎn)膜40 min將蛋白轉(zhuǎn)移至0.2 um PVDF膜（Millipore，Billerica，MA，USA）。5%脫脂奶粉室溫下封閉1 h，兔抗大鼠多克隆抗體AQP 0（1:200），羊抗大鼠多克隆抗體AQP 5（1∶100）、AQP 6（1∶100）、AQP 11（1∶100），兔抗大鼠多克隆抗體AQP 10（1∶200，Acris）、AQP 12（1∶200，Acris）按比例稀釋后孵育。使用β-actin作為內(nèi)參。

1.6 統(tǒng)計學分析

使用SPSS13.0統(tǒng)計軟件分析，結(jié)果中定量資料以均數(shù)±標準差（±s）表示，多個樣本均數(shù)間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用LSD法，多重線性回歸分析血糖和體重與AQPs表達的相關(guān)性，P＜0.05有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 一般情況及陰道潤滑性

所有大鼠發(fā)情期每一組體重、血糖、血漿雌激素和陰道潤滑性見表1。A和C組大鼠血糖分別較B組和D組顯著增高（P＜0.05），A、C組大鼠的體重分別顯著低于B、D組（P＜0.05）。各組大鼠雌激素無顯著差異。電刺激后陰道潤滑性A組較B組、C組較D組均顯著降低（P＜0.05）。

表1 實驗大鼠基本情況

2.2 免疫組化測AQP0、5、6、11在陰道組織的表達

AQP 0、5、6、11在陰道組織的表達（圖1，圖2）。AQP 0主要表達在陰道上皮胞質(zhì)內(nèi)，AQP 5主要表達在陰道血管內(nèi)皮及陰道上皮細胞，AQP 6及 AQP 11主要在陰道毛細血管及靜脈內(nèi)皮細胞表達。B、D組中AQPs在陰道小靜脈、毛細血管及上皮細胞保質(zhì)的表達顯著強于A、C組（P＜0.05）。

圖1 AQPs在大鼠陰道組織中的表達

圖2 IHC的統(tǒng)計學分析

2.3 Western Blot測各組大鼠陰道組織中AQPs的表達（圖3，圖4）。

2.4 陰道潤滑性與血糖和體重的關(guān)系

體重與陰道潤滑性沒有相關(guān)性（P>0.05），血糖與陰道潤滑性呈負相關(guān)，本實驗中血糖是影響大鼠陰道潤滑性的獨立因素（P＜0.05）（表2）。

圖3 AQPs在大鼠陰道組織中的表達

圖4 AQPs在大鼠陰道組織中的表達的統(tǒng)計學分析

表2 多重線性回歸分析血糖和體重與AQPs表達的相關(guān)性

3 討論

性刺激引起盆腔血管流量增加致陰道及陰蒂充血，隨著陰道血流動力學的改變，從陰道粘膜及陰道上皮下血管而來的滲出物使陰道潤滑[32]。越來越多的人開始研究AQPs在FSD中所起的作用[33]，并有大量AQPs在生殖系統(tǒng)的研究。AQP 0主要表達在睪丸生精上皮的支持細胞及間質(zhì)細胞[34]。AQP 5在小鼠、大鼠、豬及人的子宮[35]，大鼠和豬的輸卵管，大鼠睪丸間質(zhì)細胞中有表達[36]。孕酮通過上調(diào)子宮AQP 5的表達引起分娩時宮頸擴張[37]。AQP 10位于成人睪丸輸出小管[34]并調(diào)控附睪水的轉(zhuǎn)運[38]。AQP 11表達于成年大鼠支持細胞[39]。

AQP 0、6的表達受胞外pH影響[38]，AQP 6表達在人內(nèi)耳及腎臟[40-41]。AQP 11、12轉(zhuǎn)運水的作用尚存爭議[42]。AQP 11可能參與緩慢而持久的水跨膜運動[43]，表達于大鼠腦、肝及眼[44-46]。AQP 12在胰腺腺泡細胞中表達，可能參與消化酶的分泌[47]。

血糖水平可能影響各組織AQPs的表達。糖尿病患者腮腺AQP 5表達下降可能導致其口腔干燥[48]。STZ所致糖尿病可上調(diào)神經(jīng)視網(wǎng)膜AQP 1及視網(wǎng)膜色素上皮AQP 5、9、11、12的表達，下調(diào)神經(jīng)視網(wǎng)膜AQP 6、11及視網(wǎng)膜色素上皮AQP 0的表達[49]。然而，除了高血糖下調(diào)AQP 1-3在陰道組織的表達外，對AQP 0、5、6、10、11、12在陰道組織的影響鮮為人知。

本實驗中各組大鼠之間雌激素水平無顯著差異，電刺激盆神經(jīng)后陰道分泌物量/陰道重量所得陰道潤滑性顯示糖尿病大鼠明顯低于正常大鼠，且免疫組化及Western-blot顯示糖尿病大鼠陰道組織AQP 0、5、6、10、11、12的表達顯著降低（Figures 1、2），AQPs的表達與糖尿病病程無明顯關(guān)系。參考本課題組前期研究[30]，表明高血糖可能通過抑制糖尿病大鼠陰道中AQP0、1-3、5、6、10-12的表達致刺激盆神經(jīng)后陰道潤滑下降。

本實驗不足之處為缺乏臨床數(shù)據(jù)證實AQPs與糖尿病患者陰道潤滑困難的關(guān)系。除了AQPs在陰道組織水的轉(zhuǎn)運外其他功能缺乏研究，也缺乏其他類型糖尿病的影響。接下來我們將研究糖尿病患者AQPs的表達，通過提高糖尿病大鼠陰道AQPs的表達引起陰道潤滑性提高的有效性。值得注意的是幾乎每一種AQPs均下降，表明可能存在一種生理機制可以調(diào)控所有AQPs的表達，所以將來我們也將證實這個猜想。

1.Bultrini A,Carosa E,Colpi EM,et al.Possible correlation between type 1 diabetes mellitus and female sexual dysfunction:case report and literature review[J].J Sex Med, 2004,1:337-340.

2.Sutton KS,Boyer SC,Goldfinger C,et al.To lube or not to lube:experiences and perceptions of lubricant use in women with and without dyspareunia[J].J Sex Med 2012, 9:240-250.

3.Hayes RD,Bennett CM,Dennerstein L,et al.Are aspects of study design associated with the reported prevalence of female sexual difficulties[J].Fertil Steril.2008,90: 497-505.

4.Leiblum SR,Hayes RD,Wanser RA,et al.Vaginal dryness:A comparison of prevalence and interventions in 11 countries[J].J Sex Med.2009,6:2425-2433.

5.Maserejian NN,Shifren J,Parish SJ,et al.Sexual arousal and lubrication problems in women with clinically diagnosed hypoactive sexual desire disorder:preliminary findings from the hypoactive sexual desire disorder registry for women[J].J Sex Marital Ther.2012,38:41-62.

6.Levin R J.The ins and outs of vaginal lubrication[J].Sex Relation,2013,18:509-513.

7.Berman JR,Adhikari SP,Goldstein I.Anatomy and physiology of female sexual function and dysfunction[J].Eur Urol,2000,38:20-29.

8.Del Pup L.Management of vaginal dryness and dyspareunia in estrogen sensitive cancer patients[J].Gynecol Endocrinol,2012,28:740-745.

9.Schick V,Herbenick D,Reece M,et al.Sexual behaviors, condom use,and sexual health of Americans over 50:Implications for sexual health promotion for older adults.[J]. 2010,7:315-329.

10.Esposito K,Maiorino MI,Bellastella G,et al.Determinants of female sexual dysfunction in type 2 diabetes[J].Int J Impot Res,2010,22:179-184.

11.Dachille G,Ludovico GM,Pagliarulo G,et al.Sexual dysfunctions in multiple sclerosis[J].Minerva Urol Nefrol, 2008,60:77-79.

12.Doumas M,Tsiodras S,Tsakiris A,et al.Female sexualdysfunction in essential hypertension:a common problem being uncovered[J].J Hypertens,2006,24:2387-2392.

13.Giraldi A,Kristensen E.Sexual dysfunction in women with diabetes mellitus[J].J Sex Res,2010,47:199-211.

14.Palacios S,Castano R,Grazziotin A.Epidemiology of female sexual dysfunction[J].Maturitas,2009,63:119-3.

15.Mezones-Holguin E,Blümel JE,Huezo M,et al.Impact of diabetes mellitus on the sexuality of Peruvian postmenopausal[J].Gynecol Endocrinol,2008,24:470-474.

16.Enzlin P,Mathieu C,Van den Bruel A,et al.Sexual dysfunction in women with type 1 diabetes:a controlled study[J].Diabetes Care,2002,25:672-677.

17.Enzlin P,Rosen R,Wiegel M,et al.DCCT/EDIC Research Group.Sexual dysfunction in women with type 1 diabetes:long-term findings from the DCCT/EDIC study cohort[J].Diabetes Care,2009,32:780-785.

18.Fatemi SS,Taghavi SM.Evaluation of sexual function in women with type 2 diabetes mellitus[J].Diab Vasc Dis Res,2009,6:38-39.

19.Erol B,Tefekli A,Ozbey I,et al.Sexual dysfunction in type II diabetic females:a comparative study[J].J Sex Marital Ther,2002,28:55-62.

20.Ottesen B,Fahrenkrug J.Vasoactive intestinal polypeptide and other preprovasoactive intestinal polypeptide-derived peptides in the female and male genital tract:localization, biosynthesis,and functional and clinical significance[J].Am J Obstet Gynecol,1995,172:1615-1631.

21.Clayton AH,DeRogatis LR,Rosen RC,et al.Intended or unintended consequences.The likely implications of raising the bar for sexual dysfunction diagnosis in the proposed DSM-V revisions:1.for women with Incomplete Loss of desire or sexual receptivity[J].J Sex Med,2012,9: 2027-2039.

22.Krychman M,Millheiser LS.Sexual health issues in Women with cancer[J].J Sex Med,2013,10:5-15.

23.Gamé X,Roumiguié M,Bouali O,et al.Vaginal lubrication after cervicovaginal stimulation is facilitated by phosphodiesterase type 5 inhibition in ovariectomized mice[J].J Sex Med,2013,10:1452-1460.

24.Brown DA,Kyle JA,Ferrill MJ.Assessing the clinical efficacy of sildenafil for the treatment of female sexual dysfunction[J].Ann Pharmacother,2009,43:1275-1285.

25.Caruso S,Intelisano G,Lupo L,et al.Premenopausal women affected by sexual arousal disorder treated with sildenafil:a double-blind,cross-over,placebo-controlled study[J].Br J Obstet Gynaecol,2001,108:623-628

26.Basson R,McInnes R,Smith MD,et al.Efficacy and safety of sildenafil citrate in women with sexual dysfunction associated with female sexual arousal disorder[J].J Womens Health Gend Based Med,2002,11:367-377.

27.Alexander MS,Rosen RC,Steinberg S,et al.Sildenafil in women with sexual arousal disorder following spinal cord injury[J].Spinal Cord,2011,49:273-279.

28.Kim SO,Oh KJ,Lee HS,et al.Expression of aquaporin water channels in the vagina in premenopausal women[J].J Sex Med,2011,8:1925-1930

29.Kim SO,Lee HS,Ahn K,et al.Effect of estrogen deprivation on the expression of aquaporins and nitric oxide synthases in rat vagina[J].J Sex Med,2009,6:1579-1586.

30.Pei L,Jiang J,Jiang R,et al.Expression of aquaporin proteins in vagina of diabetes mellitus rats[J].J Sex Med,2013, 10:342-349

31.Lee HS,Li Z,Kim SO,et al.Effect of hyperglycemia on expression of aquaporins in the rat vagina[J].Urology. 2012,80(3):7-12.

32.Raina R,Pahlajani G,Khan S,et al.Female sexual dysfunction:classification,pathophysiology,and management [J].Fertil Steril,2007,88:1273-1284.

33.Ishibashi K,Sasaki S.The dichotomy of MIP family suggests two separate origins of water channel[J].News Physiol Sci,1998,13:137-142.

34.Hermo L,Krzeczunowicz D,Ruz R.Cell specificity of aquaporins 0,3,and 10 expressed in the testis,efferent ducts,and epididymis of adult rats[J].J Androl,2004,25: 494-505.

35.Zhang D,Tan YJ,Qu F,et al.Functions of water channels in male and female reproductive systems[J].Mol Aspects Med,2012,33:676-690

36.Skowronski MT,Kwon TH,Nielsen S.Immunolocalization of aquaporin 1,5,and 9 in the female pig reproductive system[J].J Histochem Cytochem,2009,57:61-67.

37.Anderson J,Brown N,Mahendroo MS,et al.Utilization of different aquaporin water channels in the mouse cervix during pregnancy and parturition and in models of preterm and delayed cervical ripening[J].Endocrinology,2006, 147:130-140.

38.Huang HF,He RH,Sun CC,et al.Function of aquaporins in female and male reproductive systems[J].Hum Reprod Update,2006,12:785-795

39.Yeung CH,Cooper TG.Aquaporin AQP11 in the testis: molecular identity and association with the processing of residual cytoplasm of elongated spermatids[J].Reproduction,2010,139:209-216.

40.Takata K,Matsuzaki T,Tajika Y.Aquaporins:water channel proteins of the cell membrane[J].Prog Histochem Cytochem,2004,39:1-83.

41.Takeda T,Taguchi D.Aquaporins as potential drug targets for Meniere's disease and its related diseases[J].Handb ExpPharmacol,2009,190:171-184.

42.Calvanese L,Pellegrini-Calace M,Oliva R.In silico study of human aquaporin AQP 11 and AQP 12 channels[J]. Protein Sci,2013,22:455-466.

43.Yakata K,Tani K,Fujiyoshi Y.Water permeability and characterization of aquaporin-11[J].J Struct Biol,2011, 174:315-320.

44.Hung KC,Hsieh PM,Hsu CY,et al..Expression of aquaporins in rat liver regeneration[J].Scand J Gastroenterol,2012,47:676-685.

45.Benga O,Huber VJ.Brain water channel proteins in health and disease[J].Mol Aspects Med,2012,33:562-578.

46.Tran TL,Bek T,Holm L,et al.Aquaporins 6-12 in the human eye[J].Acta Ophthalmol,2013,91:557-563.

47.Itoh T,Rai T,Kuwahara M,et al.Identification of a novel aquaporin,AQP12,expressed in pancreatic acinar cells[J].Biochem Biophys Res Commun,2005,330:832-838.

48.Wang D,Yuan Z,Inoue N,et al.Abnormal subcellular localization of AQP 5 and downregulated AQP 5 protein in parotid glands of streptozotocin-induced diabetic rats[J]. Biochim Biophys Acta,2011,1810:543-554.

49.Hollborn M,Dukic-Stefanovic S,Pannicke T,et al.Expression of aquaporins in the retina of diabetic rats[J].Curr Eye Res,2011,36:850-856.

（2016-04-25收稿）

Expression of aquaporins in vagina of diabetic rat

Yang Lei1,Xia Jiyi2,JiangJun3，Jiang Rui11Department of Urology；2Medical Research Center；3Department of Vascular Surgery,the Affiliated Hospital of Southwest Medical University,Luzhou,Sichuan Province 646000,China

Objective:The aim is to investigate the expression of AQP0,5,6,10,11 and 12 in the vaginal tissue of diabetes mellitus rats.Methods:Female Sprague-Dawley rats（n=24）were randomly divided into 4 groups:12-week-old diabetic rats（n=6）,12-week-old non-diabetes control（n=6）,16-week-old diabetic rats（n=6）and 16-week-old non-diabetes control（n=6）.The level of vaginal lubrication and the expression of AQP 0,5,6,10,11 and 12 in vaginal tissue of rats were determined.Results:The levels of blood glucose were significantly increased in 12-week-old diabetic rats and 16-week-old diabetic rats compared to their age matched counterparts respectively（P＜0.05），vaginal lubrication was significantly lower in 12-week-old diabetic rats（2.12±1.41）and 16-week-old diabetic rats（2.64±0.88）than their age matched counterparts,（4.21± 0.86）and（4.41±0.77）（P＜0.05）,respectively;and the expression of AQP 0,5,6,10,11 and 12 in vaginal tissue were significantly lower in 12-week-old diabetic rats and 16-week-old diabetic rats than their age matched counterparts respectively（P＜0.05）,as determined by immunohistochemistry and western blot,respectively. Conclusions:Decreased vaginal lubrication in diabetic rats may be related to the decreased expression of AQPs in vaginal tissue.

Aquaporin water channels;Diabetic;Vaginal lubrication;Female rats

R587.1；R393

A

10.3969/j.issn.1000-2669.2016.05.011

國家自然科學基金（81070486）

楊雷（1987-），男，醫(yī)師，碩士

姜睿（1970-），男，教授，博士。E-mail:jiangrui@126.com