超濾法和HPLC法測(cè)定14-去氧穿心蓮內(nèi)酯的血漿蛋白結(jié)合率

張二鋒， 趙軍利， 楊 靜， 孫瑞潔， 韓 光（河南大學(xué)藥物研究所，河南開封475004）

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超濾法和HPLC法測(cè)定14-去氧穿心蓮內(nèi)酯的血漿蛋白結(jié)合率

張二鋒， 趙軍利， 楊 靜， 孫瑞潔， 韓 光*
（河南大學(xué)藥物研究所，河南開封475004）

摘要：目的 測(cè)定14-去氧穿心蓮內(nèi)酯在大鼠與人血漿中的蛋白結(jié)合率。方法 超濾法和HPLC法測(cè)定14-去氧穿心蓮內(nèi)酯在大鼠與人血漿中的血漿蛋白結(jié)合率。結(jié)果 14-去氧穿心蓮內(nèi)酯與大鼠和人血漿中的平均血漿蛋白結(jié)合率分別為（93.88±2.16）和（95.55±0.83）%。結(jié)論 14-去氧穿心蓮內(nèi)酯與大鼠和人血漿蛋白均具有很強(qiáng)的結(jié)合能力，而且無(wú)明顯的濃度依賴性。

關(guān)鍵詞：14-去氧穿心蓮內(nèi)酯；血漿蛋白；結(jié)合率；超濾；HPLC

穿心蓮為爵床科穿心蓮屬植物穿心蓮Andrographis paniculata（Burm.f.）Nees的干燥地上部分，《中國(guó)藥典》2010版一部記載，其性寒，味苦，歸心、肺、大腸、膀胱經(jīng)，具有清熱解毒，涼血消腫功效［1］，其有效成分為穿心蓮內(nèi)酯、14-去氧穿心蓮內(nèi)酯、脫水穿心蓮內(nèi)酯和新穿心蓮內(nèi)酯等二萜內(nèi)酯類化合物。現(xiàn)代藥理研究表明，14-去氧穿心蓮內(nèi)酯具有抗炎、抗癌、抗鉤端螺旋體病、治療酒精肝、抗菌等作用［2-10］。吳陽(yáng)等［11］發(fā)現(xiàn)，脫水穿心蓮內(nèi)酯與牛血清白蛋白、正常人血漿、大鼠血漿的血漿蛋白結(jié)合率分別為（71.50±1.50）%、（79.91±2.51）%、（82.41± 2.05）%，屬于中等強(qiáng)度的結(jié)合，但目前尚無(wú)關(guān)于14-去氧穿心蓮內(nèi)酯與血漿蛋白結(jié)合率的研究報(bào)道。藥物血漿蛋白結(jié)合率可直接影響藥物在體內(nèi)的吸收、分布、代謝與排泄，從而影響其作用強(qiáng)度與時(shí)間，是藥代動(dòng)力學(xué)、分子藥理學(xué)等學(xué)科研究的重要課題之一［12］。本實(shí)驗(yàn)采用超濾法和HPLC法測(cè)定14-去氧穿心蓮內(nèi)酯與大鼠和人血漿的血漿蛋白結(jié)合率，為該成分的臨床合理應(yīng)用與相關(guān)新藥研發(fā)提供可靠的依據(jù)。

1 儀器與材料

1.1 儀器 島津LC-20AT HPLC色譜儀，包括CLASS-VP色譜工作站、紫外檢測(cè)器（日本島津公司）；精密移液器（大龍興創(chuàng)實(shí)驗(yàn)儀器北京有限公司）；KQ-300VDE雙頻數(shù)控超聲清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）；NanosepI10KDa超濾管（美國(guó)Pa11公司）；TGL-16G高速離心機(jī)（上海安亭科學(xué)儀器廠）；MaxiMix P1us漩渦混合器（美國(guó)Thermo Fisher Scientific公司）。

1.2 藥品與試劑 14-去氧穿心蓮內(nèi)酯對(duì)照品（自制，結(jié)構(gòu)經(jīng)各波譜手段確認(rèn)和HPLC法測(cè)定，按面積歸一化法計(jì)算，純度在99.5%以上）；14-去氧穿心蓮內(nèi)酯樣品（自制，純度在98.0%以上）；肝素鈉（江蘇萬(wàn)邦生化醫(yī)藥股份有限公司，批號(hào)1307132）；正常人血漿（開封市中心血站）。乙腈為色譜純（天津市四友精細(xì)化學(xué)品有限公司）；水為娃哈哈純凈水；其他試劑均為分析純。

1.3 動(dòng)物 SD大鼠，雄性，體質(zhì)量（200±20）g（河南省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，合格證號(hào)SCXK［豫］2010-0002）。取健康SD大鼠5只，乙醚麻醉，75%酒精消毒，摘除眼球取血，置于肝素化的EP管中，4 000 r/min離心15 min，然后將上清液（血漿）轉(zhuǎn)移到另一EP管中，保存于4℃冰箱中，備用。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件 ST Pak C18-ES色譜柱（250 mm×4.6 mm，5 μm），包括預(yù)柱（50 mm×4.6 mm，北京迪馬科技有限公司）；流動(dòng)相為乙腈-水（40∶60）；體積流量為1.0 mL/min；檢測(cè)波長(zhǎng)為205 nm；柱溫為室溫；進(jìn)樣體積為20 μL。在該條件下，空白血漿中的內(nèi)源物質(zhì)不干擾主成分測(cè)定，專屬性較好，見圖1。

2.2 磷酸鹽緩沖溶液（PBS，pH＝7.4）的配制 取磷酸二氫鉀1.36 g，加入0.1 mo1/L氫氧化鈉溶液79 mL，蒸餾水稀釋至200 mL，即得。

2.3 對(duì)照品溶液的配制 精密稱取對(duì)照品10.02 mg，置于10 mL量瓶中，加入甲醇適量，超聲溶解，甲醇定容至10 mL，搖勻。精密吸取5 mL，置于25 mL量瓶中，PBS液定容，搖勻，即得。

2.4 標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備 分別精密吸取“2.3”項(xiàng)下對(duì)照品溶液0.005、0.05、0.1、0.2、0.5、1 mL，置于10 mL量瓶中，PBS液定容，搖勻，過0.22 μm濾膜，進(jìn)樣20 μL。然后，以峰面積（A）對(duì)質(zhì)量濃度（C）作回歸，得到標(biāo)準(zhǔn)曲線A＝41 168C-6 218.2（r＝0.999 9），表明在0.100 2～20.04 μg/mL范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

2.5 精密度 分別精密配制質(zhì)量濃度為4.008、10.02、20.04 μg/mL的14-去氧穿心蓮內(nèi)酯溶液，PBS液定容，搖勻，過0.22 μm濾膜，進(jìn)樣20 μL，測(cè)定峰面積ISD值。日內(nèi)精密度分別在2、4、6、8、10 h進(jìn)樣測(cè)定，而日間精密度分別在第1、2、3、4、5天進(jìn)樣測(cè)定，結(jié)果見表1，表明儀器精密度良好。

表1 14-去氧穿心蓮內(nèi)的精密度

圖1 超濾液的HPLC色譜圖

2.6 超濾膜回收率的考察 PBS液配制質(zhì)量濃度分別為2.00、4.00、10.00 μg/mL的標(biāo)準(zhǔn)品溶液500 μL，置于超濾離心管超濾膜上，6 000 r/min離心30 min，取20 μL進(jìn)樣測(cè)定，代入“2.4”項(xiàng)下標(biāo)準(zhǔn)曲線方程，計(jì)算回收率。結(jié)果，14-去氧穿心蓮內(nèi)酯的回收率均大于93%，說明超濾膜對(duì)其沒有特異性吸附。

2.7 溫孵時(shí)間的考察 模擬人體體溫37℃的孵化時(shí)間，分別溫孵20、40、60、80、120、150 min。最終確定，溫孵120 min時(shí)，藥物與蛋白達(dá)到結(jié)合平衡狀態(tài)。

2.8 血漿蛋白結(jié)合率試驗(yàn) 精密吸取標(biāo)準(zhǔn)品溶液30、50、100 μL，置于1.5 mL EP管中，分別加入大鼠與人血漿970、950、900 μL，渦旋1 min，37℃下恒溫水浴中溫孵2 h。然后，移取0.5 mL置于超濾管中，6 000 r/min離心30 min，取20 μL進(jìn)樣測(cè)定，將峰面積代入標(biāo)準(zhǔn)曲線方程，計(jì)算14-去氧穿心蓮內(nèi)酯的質(zhì)量濃度，求出其血漿蛋白結(jié)合率，計(jì)算公式如下，結(jié)果見表2。

（ρ超濾前為超濾前14-去氧穿心蓮內(nèi)酯的質(zhì)量濃度，ρ超濾后為超濾后14-去氧穿心蓮內(nèi)酯的質(zhì)量濃度）

表2 14-去氧穿心蓮內(nèi)酯與大鼠和人血漿的血漿蛋白結(jié)合率（±s，n＝3）

表2 14-去氧穿心蓮內(nèi)酯與大鼠和人血漿的血漿蛋白結(jié)合率（±s，n＝3）

質(zhì)量濃度/ （μg·mL-1）大鼠血漿蛋白結(jié)合率/%人血漿蛋白結(jié)合率/% 6.012　91.20±4.03　93.87±1.33 10.02　94.30±1.39　95.77±0.43 20.04　96.14±1.06　97.02±0.73平均值93.88±2.16　95.55±0.83

由表可知，14-去氧穿心蓮內(nèi)酯與大鼠和人血漿均具有很強(qiáng)的結(jié)合能力，并且在所考察的質(zhì)量濃度范圍內(nèi)，無(wú)明顯的濃度依賴性。

3 討論

研究藥物血漿結(jié)合率的方法有超濾法、平衡透析法、超速離心法、凝膠過濾法等［12］，其中較常用的為平衡透析法與超濾法，但前者耗時(shí)較長(zhǎng)，可能引起藥物代謝降解，對(duì)藥物蛋白結(jié)合率的測(cè)定造成較大誤差，而后者不僅操作方便簡(jiǎn)便，而且測(cè)定速度快，樣品用量少。因此，本實(shí)驗(yàn)選擇超濾法［13］。

另外，本實(shí)驗(yàn)考察了藥物模擬人體體溫37℃的孵化時(shí)間，發(fā)現(xiàn)藥物在溫孵120 min時(shí)，與蛋白達(dá)到結(jié)合平衡狀態(tài)。同時(shí)，還研究了超濾離心的轉(zhuǎn)速和時(shí)間，根據(jù)不漏蛋白，而且超濾液體積與超濾前總體積之比為0.3～0.6為宜的標(biāo)準(zhǔn)［14］，最終確定離心時(shí)間為30 min，轉(zhuǎn)速為6 000 r/min。

實(shí)驗(yàn)顯示，14-去氧穿心蓮內(nèi)酯的平均蛋白結(jié)合率在93%以上，屬于高蛋白結(jié)合［15］，表明如果在臨床上與其它藥物聯(lián)合使用，容易產(chǎn)生安全性問題。因此，有必要選擇臨床上聯(lián)合使用并具有高蛋白結(jié)合率的藥物，開展體外藥物蛋白競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合實(shí)驗(yàn)，用于保證人體用藥的安全性。

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*通信作者：韓 光（1966—），女，博士，教授，碩士生導(dǎo)師，研究方向?yàn)樘烊换钚猿煞盅芯考靶滤庨_發(fā)。Te1：（0371）23880680，E-mai1：hang@henu.edu.cn

作者簡(jiǎn)介：張二鋒（1988—），男，碩士，研究方向?yàn)樘烊换钚猿煞盅芯考靶滤庨_發(fā)。Te1：15136226020，E-mai1：779354666@qq.com

基金項(xiàng)目：國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目（81373974）；河南大學(xué)研究生教育綜合改革項(xiàng)目（Y1319023）

收稿日期：2015-01-27

doi：10.3969/j.issn.1001-1528.2016.03.047

中圖分類號(hào)：I969.1

文獻(xiàn)標(biāo)志碼：B

文章編號(hào)：1001-1528（2016）03-0689-03